alterata espressione di un putativo cellule progenitrici marcatore DCAMKL1 nel ratto mucosa gastrica nella rigenerazione, metaplasia e displasia

alterata espressione di un marcatore di cellule progenitrici putativo DCAMKL1 nel ratto mucosa gastrica nella rigenerazione, metaplasia e displasia
Abstract
sfondo
doublecortin e calcio /calmodulina-dipendente proteina chinasi-simile-1 (DCAMKL1) è un candidato marcatore per le cellule progenitrici nella mucosa gastrointestinale. cellule della linea della mucosa gastrica sono derivati ​​da cellule progenitrici, ma questo processo possono essere modificati dopo la lesione. Pertanto, abbiamo esplorato espressione DCAMKL1 in condizioni patologiche.
Metodi
L'analisi immunoistochimica è stata eseguita nello stomaco ratto con lesione acuta superficiale, ulcera cronica, metaplasia intestinale e displasia.
Risultati
DCAMKL1 stato espresso esclusivamente in cellule quiescenti immature nell'istmo di normali ghiandole fundica, dove le cellule progenitrici putativi sono pensati per risiedere. cellule DCAMKL1-positive e cellule proliferanti capannone nel lume dopo lesioni superficiali e ri-apparso durante il processo di rigenerazione, soprattutto nella mucosa superficiale. Nella mucosa marginale intorno al ulcera attiva, parietale e capo cellule diminuita, iperplasia foveolare era evidente, e il fattore di trifoglio famiglia 2 (TFF2) /spasmolitico polipeptide che esprimono metaplasia (SPEM) è emerso alla base della ghiandola. cellule DCAMKL1 riemerse nella mucosa profondo giustapposti con le cellule SPEM e proliferanti. Nella guarigione dell'ulcera, la popolazione cellulare TFF2 ampliato e sembrava ridifferenziare a cellule principali, mentre cellule in proliferazione DCAMKL1 apparvero sopra e sotto le cellule TFF2 per promuovere la guarigione. SPEM apparve e cellule PCNA aumentato nella mucosa intestinalized e DCAMKL1 è stato espresso in prossimità delle cellule PCNA nella mucosa profonda. DCAMKL1, PCNA e TFF2 sono stati espressi in diverse cellule che rivestono displastiche ghiandole dilatati vicino SPEM.
Conclusione
L'aspetto ultrastrutturale delle cellule DCAMKL1-positive e gli schemi di espressione di DCAMKL1 in stati normali e patologici indicano che le cellule appartengono a un popolazione di cellule progenitrici. espressione DCAMKL1 è strettamente associato con le cellule TFF2 /SPEM dopo l'infortunio. cellule DCAMKL1 ripopolare vicino alle cellule proliferanti, iperplastici, metaplastiche e displasia, e la zona progenitore si sposta a seconda delle circostanze patologiche.
Sfondo
Il mouse e unità gastrico umano mostra la conversione monoclonale, che indica la presenza di cellule staminali multipotenti [ ,,,0],1, 2]. Electron autoradiografia microscopica nel topo hanno comportato che le cellule senza granuli nell'atto istmo come cellule staminali multipotenti [3]. I processi di differenziazione e migrazione delle linee cellulari possono essere alterati da lesioni. La zona di cellule progenitrici nell'istmo è facilmente danneggiati da intraluminale etanolo, droghe o Helicobacter pylori
(H. pylori
) non steroidei anti-infiammatori. L'infiammazione cronica dello stomaco può portare ad atrofia e perdita di cellule specializzate come effetti tangibili di lesioni delle cellule progenitrici tessuto-specifica o la perdita. Tuttavia, il comportamento delle cellule progenitrici dopo danno mucosale acuto o cronico e il meccanismo di ripristino di queste cellule durante la rigenerazione della mucosa non sono ben compresi.
La popolazione di cellule progenitrici è importante nella manutenzione e rigenerazione dell'epitelio gastrico, ma lungo cellule progenitrici vissuto sono a rischio di accumulare mutazioni che portano al cancro [4]. Neoplasia può seguire metaplasia cellulare a causa di un'infiammazione cronica e riparazione. Tuttavia, precisa analisi del ruolo e alterazione di cellule progenitrici nella sequenza di gastrite-metaplasia-displasia-cancro non è stata eseguita, principalmente a causa della mancanza di marcatori di cellule progenitrici discreti nello stomaco.
Musashi-1, una marcatore di cellule progenitrici nel topo piccolo intestino, non è espresso in cellule progenitrici putativi, ma si trova nelle cellule parietali nel ratto istmo fundica [5]. Il Villin-1 frammento di promotore /enhancer è un indicatore di possibili cellule progenitrici gastriche nell'istmo delle ghiandole pilorica [6]. Uno studio lineage indicato che il marcatore di cellule progenitrici intestinale Lgr5 è espresso alla base delle ghiandole fundica e piloriche potenziali nello stomaco neonatale, mentre l'espressione in adulta era prevalentemente limitato alla base delle ghiandole pilorica [7]. Così, non ci sono marcatori definiti per progenitori ghiandole fundica adulti.
DCAMKL1 è uno dei prodotti di trascritti Gene Ontogeny-arricchiti disponibili a confronto con gastrica mouse e piccoli gruppi di dati progenitrici intestinali [8]. analisi immunoistochimica utilizzando un anticorpo DCAMKL1 rivelato singola colorazione della cellula in sezioni cripta intestinale nei pressi o posizione 4 e nelle cellule istmo gastriche [8]. Dopo la prima relazione, localizzazione specifica di DCAMKL1-cellule che esprimono in una nicchia di cellule staminali è stato mostrato nel piccolo intestino dei topi [9, 10] e nel colon dei topi e gli esseri umani [11, 12], mentre DCAMKL1 stato coespressi con Musashi -1 nelle cellule parietali dello stomaco di topi [13].
il primo obiettivo di questo studio era di determinare se DCAMKL1 è un marker per le cellule progenitrici nello stomaco di ratto. Il secondo obiettivo è stato quello di chiarire gli schemi temporali e spaziali della comparsa di cellule che esprimono specificamente DCAMKL1 in diverse condizioni patologiche gastrici.
Metodi
Preparazione degli animali in tutte le nazioni protocolli di animali sono stati approvati dal Comitato per la ricerca degli animali Keio University. Ratti maschi Wistar del peso di circa 200 g sono stati tenuti a digiuno per 24 ore con libero accesso all'acqua. Per produrre lesioni superficiali acuta nella mucosa fundica, etanolo assoluto (1 ml) è stato instillato nello stomaco mediante intubazione gastrica. Per produrre ulcere profonde croniche, acido acetico al 20% (50 ml) è stato iniettato nella sottomucosa fundica della parete anteriore utilizzando una microsiringa. I ratti sono stati sacrificati 3 giorni e 1, 2 e 3 settimane dopo l'iniezione di acido acetico.
Il metodo per indurre metaplasia intestinale nel ratto mucosa gastrica è stato descritto altrove [14, 15]. In breve, i ratti hanno ricevuto due dosi di raggi X di 10 Gy ciascuno e sono stati sottoposti ad eutanasia 6 mesi dopo l'irradiazione. Il metodo per indurre displasia nel ratto mucosa gastrica è stato anche descritto altrove [14]. In breve, 50 mg /ml di N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) è stato dato ai ratti ad libitum
per 4 mesi.
Anticorpi
rabbit anti-DCAMKL1 immunoglobuline (Ig) G (Abcam, Cambridge, UK; diluizione finale 1: 100), topo anti-proliferazione antigene nucleare di cellule (PCNA) IgG (DAKO, Carpinteria, CA, pronto per l'uso), anti coniglio -PCNA IgG (Abcam; 1: 200), topo anti-H + /K + - trifosfatasi adenosina (ATPasi) α subunità IgG (Research Diagnostics Inc. Flanders, NJ; 1: 200), anti pecore -pepsinogen II IgG (Stati Uniti biologica, Swampscott, MA; 1: 100), topo anti-IgM MUC6 (Kanto Kagaku, Tokyo, 1: 100), topo anti-IgG MUC5AC (Abcam; 1: 100), anti-topo TFF2 IgM (Abcam; 1: 200), cavia decarbossilasi anti-istidina (HDC) IgG (ARP, Belmont, MA; 1: 100), di capra anti-grelina IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1: 100 ), e il mouse anti-somatostatina IgG (Biomeda, Foster City, CA; 1,25) sono state usate come anticorpi primari
L'analisi istologica
Il tessuto dello stomaco è stato fissato in formalina neutra tamponata al 10% durante la notte, e poi. inclusi in paraffina e sezionati (4 micron). Le sezioni sono state colorate con ematossilina e eosina (H & E) utilizzando tecniche standard. L'acido-Schiff periodica (PAS) -Alcian colorazione blu è stata effettuata per individuare linee cellulari mucose. Compra di analisi immunoistochimica, sezioni incluse in paraffina sono stati deparaffinate e pretrattato con una procedura di recupero appropriato per ciascun antigene. Le sezioni sono state incubate in 0,3% H 2O 2 in metanolo per 10 minuti per inattivare perossidasi endogena e quindi lavati con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 0,1% di Tween 20 (PBST). Dopo incubazione con una soluzione bloccante (Block Ace, Dainippon Seiyaku, Tokyo, Giappone) per 10 minuti, le sezioni sono state incubate con un anticorpo primario per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, ogni passo è seguita lavando 3 volte con PBST per 3 minuti. Le sezioni sono state incubate con HP-coniugato IgG o IgM per 40 minuti. Le cellule marcate sono state colorate marrone con 3,3 'Diaminobenzidina cloridrato (DAB) utilizzando un set di reagenti DAB (DAKO), e poi di contrasto con ematossilina di Mayer. Compra di immunocolorazione doppio-colore, un metodo immunoalkaline fosfatasi indiretto, è stato utilizzato in seguito la procedura dell'immunoperossidasi indiretta descritta sopra. Dopo la reazione con DAB, le sezioni sono state incubate con un secondo anticorpo primario per 1 ora, seguito da incubazione con IgG ALP-coniugato o IgM per 40 minuti. Le cellule marcate sono state colorate blu con un kit di substrato ALP III (vettore blu, Vector Laboratories, Burlingame, CA). Compra di antigene recupero di Pepsinogeno II e MUC6, proteinasi K (DAKO) è stato applicato localmente alle sezioni deparaffinate per 6 minuti. Per antigene recupero di PCNA (IgG di topo), le sezioni sono state riscaldate in acqua distillata in autoclave per 10 minuti. Per antigene recupero di MUC5AC, le sezioni sono state riscaldate in tampone citrato in autoclave per 10 minuti. Nessun procedimento antigene di recupero è stato utilizzato per DCAMKL1, H + /K + -. ATPasi, PCNA (coniglio IgG), TFF2, HDC, la grelina o somatostatina colorazione
punteggio di celle DCAMKL1 e cellule PCNA
le sezioni che hanno subito immunostaining doppio colore usando DCAMKL1 e PCNA sono stati analizzati per determinare il numero di cellule immunostained. Le sezioni sono state utilizzate da 5 ratti, e 10 unità gastrici ben orientati, sono stati analizzati in ogni sezione.
Microscopia elettronica
microscopia pre-embedding dell'immunoperossidasi elettrone è stata effettuata come segue. Piccoli pezzi di campioni freschi dal corpus gastrica di ratti non trattati sono stati fissati in paraformaldeide al 4% per 24 ore, seguita da fissaggio in 0.1% glutaraldeide e 4% paraformaldeide per 1 ora. sezioni al criostato (6 micron) sono stati preparati e incubate con anticorpo anti-DCAMKL1 per 48 ore, seguita da incubazione con HP-coniugato anti-IgG di coniglio per 24 ore. Le sezioni sono state poi fissati con glutaraldeide 0,5% per 5 minuti, hanno reagito con DAB, post-fissate con 2% tetrossido di osmio, disidratati in una serie graduata di etanolo, ed inclusi in resina epossidica. Le sezioni ultrasottili sono stati tagliati con una ultramicrotomo e colorati in soluzione acetato di uranile e citrato di piombo. I campioni sono stati esaminati con un microscopio elettronico a trasmissione (JEM-1200EX, JEOL, Tokyo, Giappone).
Risultati
cellule normali fundica Gland
DCAMKL1 che esprimono sono stati distribuiti nel terzo superiore del valore normale ghiandole fundica, in una regione indicata come l'istmo (Figura 1A). In microscopia elettronica, DCAMKL1-cellule sono state trovate anche nel istmo (Figura 1B, a). La cella DCAMKL1 era più piccolo della cellula parietale, che era ricca di mitocondri, e mancavano i granuli secretori visto nella cella endocrino (Figura 1B, b). DCAMKL1 immunoreattività è stato trovato diffusamente nel citoplasma, dando un elevato rapporto nucleocytoplasmic (Figura 1B, c). cellule DCAMKL1 erano presenti nei rivestimenti cellule epiteliali, poiché le cellule avevano desmosomi nella giunzione con le cellule epiteliali adiacenti (Figura 1B, d). Le cellule DCAMKL1 avevano un aspetto immaturo con pochi mitocondri, vescicole o granuli secretori (Figura 1B, c e 1B, d). Figura 1 Distribuzione e ultrastruttura di DCAMKL1-cellule che esprimono in normale stomaco di ratto. (A) A luce microfotografia, mostra l'ubicazione delle cellule DCAMKL1 nella mucosa fundica. Scala: 100 micron. L'inserto mostra una vista ingrandita della zona delineata in A. Scala: 10 micron. microscopio elettronico (B) di trasmissione. (A, c) Le sezioni ultrasottili senza di contrasto. (B, d) Le sezioni ultrasottili con di contrasto. (A) le cellule DCAMKL1 nella ghiandola fundica. Scala: 2 micron, ingrandimento × 5600. (B) La cella DCAMKL1 (D) è minore della cellula parietale (P), che era ricco di mitocondri, e mancava granuli secretori visto nella cella endocrine (E). Scala: 2 micron, ingrandimento × 7000. (C) DCAMKL1 colorazione era prevalentemente citoplasmatica. Scala: 1 micron, ingrandimento × 14400. (D) le frecce indicano desmosomi. La freccia bianca indica DCAMKL1 immunoreattività. Scala:. 2 micron, ingrandimento × 8400
Abbiamo poi confrontato la distribuzione delle cellule DCAMKL1 con quelli di note linee cellulari epiteliali. cellule DCAMKL1 sono stati mescolati con cellule proliferanti etichettati dal PCNA nell'istmo (Figura 2a), ma non le cellule DCAMKL1 contenuta PCNA. cellule DCAMKL1 risieduto sotto cellule foveolare (colorate con Alcian Blu, Figura 2b) e soprattutto le cellule del collo mucose (colorati con MUC6 e TFF2, figura 2c, d). cellule parietali e principali cellule del istmo erano adiacente alle cellule DCAMKL1, ma le cellule DCAMKL1 non coesprimere H + /K + -ATPasi o pepsinogeno (figura 2e, f). cellule DCAMKL1 erano anche discreta da linee cellulari endocrino. La popolazione di cellule DCAMKL1 era distante dalle cellule enterocromaffini simili, che sono stati distribuiti principalmente nella base fundica (Figura 2G). La maggior parte delle cellule A-come risiedeva nella base fundica con un po 'distribuito in l'istmo, ma distinto da cellule DCAMKL1 (Figura 2 ore), e le cellule D chiaramente differivano dalle cellule DCAMKL1 (Figura 2i). cellule foveolare Figura 2 doppio colore immunocolorazione che mostra la localizzazione delle cellule DCAMKL1 che esprimono e linee cellulari epiteliali che comprendono cellule proliferanti con nuclei PCNA marcato (a), Alcian Blu-macchiato (B), MUC6 macchiati di cellule del collo mucose (c), TFF2 cellule -stained mucose del collo (d), H + /cellule parietali K + -ATPasi-macchiati (e), pepsinogeno II-macchiati cellule principali (f), HDC-macchiato cellule enterocromaffini-like (g), grelina macchiati A- come le cellule (h), e le cellule D somatostatina-macchiato (I). Bilancia: 100 micron. L'inserto in (e) è una vista ingrandita della zona delineata. Si noti che le cellule DCAMKL1 erano distinte dalle cellule parietali
acuta superficiale delle mucose Lesioni e rapido rinnovo
analisi istologica del processo di lesioni della mucosa e la riparazione dopo la somministrazione di etanolo con H &. E di colorazione e di doppio-colore DCAMKL1 e PCNA immunocolorazione è mostrato in Figura 3. Immediatamente dopo il trattamento etanolo, cellule DCAMKL1 e cellule PCNA staccate dalla ghiandola e capannone nel lume con cellule foveolare (Figura 3AA e 3BA). cellule DCAMKL1 e cellule PCNA erano quasi scomparsi nella mucosa danneggiata 1 ora dopo il trattamento di etanolo (Figura 3 bis ter e 3BB). cellule DCAMKL1 poi riapparso dopo 6 ore, e alcuni erano presenti in prossimità della superficie della mucosa (Figura 3AC e 3BC). cellule PCNA aumentati a 24 ore dopo l'etanolo (Figura 3AD e 3bd), mentre diverse cellule DCAMKL1 e cellule PCNA erano presenti alla superficie della mucosa (Figura 3AE e 3BE). La distribuzione delle cellule DCAMKL1 e cellule PCNA aveva l'aspetto morfologico della mucosa fundica non trattati dopo 96 ore (Figura 3AF e 3BF). Figura 3 L'analisi immunoistochimica di lesioni della mucosa superficiale dopo il trattamento di etanolo. (A) immunocolorazione doppio colore per le celle DCAMKL1 e cellule PCNA. sezioni gastrici prese a 5 minuti (a), 1 ora (b), 6 ore (c), 24 ore (d, e) e 96 ore (f) dopo il trattamento etanolo. (B) H & sezioni E-macchiati, che mostra l'andamento nel tempo del danno della mucosa gastrica e la riparazione dopo la somministrazione di etanolo. (AF) Sezioni seriali delle rispettive sezioni in A. Bilancia:. 100 micron
corsi tempo di cambiamenti nel numero di cellule DCAMKL1 e PCNA sono mostrati in Figura 4. Il numero di cellule DCAMKL1 cambiato quasi in concomitanza con quella di PCNA cellule, ma il reclutamento di cellule DCAMKL1 cominciarono a 6 ore dopo il trattamento di etanolo, prima di reclutamento di cellule PCNA. Figura 4 corsi a tempo dei numeri di cellule DCAMKL1 (A) e le cellule PCNA (B) in una ghiandola dopo la somministrazione di etanolo. Ogni barra rappresenta la media ± SE di risultati da 5 ratti. L'asse Y mostra il numero di cellule per ghiandola e l'asse X mostra il tempo dopo la somministrazione di etanolo.
Cronica ulcera
ulcere profonde che coinvolgono interi strati della mucosa e penetranti della mucosa muscolare sono stati prodotti 3 giorni dopo il trattamento con acido acetico acido. La maggior parte delle ulcere guarite dopo 2 settimane di trattamento e un po 'ricomparsa dopo 3 settimane. Una analisi istopatologica di rigenerazione della mucosa è stata eseguita utilizzando tessuti prelevati da 1 a 3 settimane dopo il trattamento. ghiandole Cystically dilatati erano prominenti nella mucosa rigenerativo del margine dell'ulcera intorno al cratere di un'ulcera attiva (figura 5a, b). Queste ghiandole sono stati rivestiti con cellule che esprimono MUC5AC, un marker di cellule foveolare (Figura 5C). Inoltre, TFF2, un marker di cellule del collo mucose nei ratti non trattati, visualizzata colorazione intensa alla base delle ghiandole rigenerative fundica (figura 5d), simile a quella per TFF2 colorazione delle profonde cellule della ghiandola antrali e coerenti con l'emergere di una cella SPEM fenotipo [16, 17]. Al contrario, l'espressione di MUC6, un altro marcatore di cellule del collo mucose nei ratti non trattati, deteriorati nella mucosa rigenerativa e solo debole colorazione MUC6 è stata osservata nelle cellule alla base della ghiandola (Figura 5e). cellule principali diminuita anche a margine e le cellule debolmente colorate con pepsinogen ulcera sono state visualizzate solo alla base della ghiandola (figura 5f). Pertanto, non vi era sovrapposizione nell'espressione di TFF2, MUC6 e pepsinogeno in cellule alla base (Figura 5, d-f). cellule parietali erano assenti nel tessuto della mucosa marginale dell'ulcera attiva (figura 5g). cellule PCNA aumento nelle ghiandole e mesenchima del margine dell'ulcera e un marcato aumento di queste cellule è stato notato alla base della ghiandola (Figura 5h). Figura 5 modelli di cellule epiteliali della mucosa marginale di un'ulcera attiva. (A) Un H & sezione E-macchiato presa a 1 settimana dopo trattamento con acido acetico, che mostra un cratere di tessuto di granulazione e tessuti marginali che circonda il cratere. Scala: 1000 micron. (B) Una vista ingrandita della mucosa margine dell'ulcera illustrato in (a). Scala: 100 micron. (C-h) Sezioni seriali di (b) colorati con MUC5AC (c), TFF2 (d), MUC6 (e), pepsinogeno II (f), H + /K + -ATPasi (g), e PCNA (h). (I-k) immunocolorazione doppio colore per DCAMKL1 con MUC5AC (i), DCAMKL1 con TFF2 (j), e PCNA con TFF2 (k). Bilancia: 100 micron. (L) immunocolorazione doppio colore per DCAMKL1 con PCNA. Scala: 10 micron. L'inserto a (h-k) rappresenta una vista ingrandita della zona delineata.
Abbiamo poi esplorato espressione DCAMKL1 nella mucosa marginale dell'ulcera attiva. Dispersi cellule DCAMKL1 esprimono erano presenti vicino ai rivestimenti cellulari MUC5AC (figura 5i) e giustapposti con le cellule SPEM (figura 5j). cellule PCNA sono stati distribuiti anche in prossimità delle cellule SPEM e alcune cellule SPEM coespressi PCNA (Figura 5K), il che implica che il lignaggio SPEM si sta moltiplicando e proliferativa. cellule DCAMKL1 sono stati mescolati con le cellule PCNA alla base della ghiandola, ma non coesprimere PCNA (Figura 5l). Ciò indica che le cellule DCAMKL1 sono mantenute in uno stato quiescente. La zona progenitore di cellule PCNA e cellule DCAMKL1 è stato spostato dal istmo nella ghiandola normale alla base del margine dell'ulcera attiva.
Nella fase di guarigione, le dimensioni dell'ulcera ridotto e le cellule epiteliali sono stati restaurati (figura 6a) . Nella guarigione delle ulcere, un gradiente di rigenerazione epiteliale era presente dal bordo ulcera alle ghiandole rigenerati distanti dal ulcera (figura 6b). Nella mucosa rigenerativa della guarigione delle ulcere, le cellule mucose come marcatamente aumentato. Queste cellule sono state localizzate alla base del margine dell'ulcera e ampliato per il collo delle ghiandole come la guarigione procedeva. cellule MUC5AC sono diminuiti nel collo ed era presente principalmente nel foveolae (figura 6c), simile alla posizione nella mucosa fundica. Le cellule muco-come espansione nella guarigione delle ulcere sono stati in parte colorate con MUC5AC, ma soprattutto colorate con TFF2 (Figura 6d). MUC6 era espresso in cellule alla base ghiandola ma non in quelli nel collo (figura 6e), considerando che pepsinogeno è stato espresso in cellule nel collo (figura 6f). cellule parietali, che era scomparso nel ulcera attiva, riapparvero sopra e al di sotto della popolazione di cellule TFF2 nella mucosa della guarigione dell'ulcera (Figura 6g). Nella mucosa normale, le cellule parietali sono derivati ​​da cellule progenitrici nell'istmo, maturo in esso, e poi prendere diversi giorni per migrare verso il basso fino alla base [18], mentre nella guarigione delle ulcere, cellule parietali ripopolato il collo e la base della ghiandola contemporaneamente. PCNA era espresso fortemente appena sopra TFF2 cellule vicine l'ulcera, indicando una maggiore amplificazione delle cellule epiteliali in questa regione (Figura 6h). Alcune cellule PCNA sono stati distribuiti anche al di sotto delle cellule TFF2. cellule DCAMKL1 riapparvero sopra e giustapposti con la metà inferiore della popolazione di cellule TFF2 (Figura 6i). Questo profilo di distribuzione duale della zona progenitore può contribuire alla promozione della rigenerazione rapida ed efficiente mucosa. Figura 6 Modelli di cellule epiteliali e cellule DCAMKL1 nella mucosa rigenerativa di una guarigione dell'ulcera. (A) Un H & sezione E-macchiato presa a 2 settimane dopo il trattamento con acido acetico, che mostra il tessuto rigenerativa della guarigione delle ulcere. Scala: 1000 micron. (B) Una vista ingrandita della mucosa rigenerativa descritto in (a). Un gradiente di rigenerazione epiteliale dal bordo dell'ulcera (lato destro) alla mucosa rigenerata distante dal ulcera (lato sinistro) è stato identificato. Scala: 100 micron. (C-h) Sezioni seriali di (b), colorati con MUC5AC (c), TFF2 (d), MUC6 (e), pepsinogeno II (f), H + /K + -ATPasi (g), e PCNA (h). (I) immunocolorazione doppio colore per DCAMKL1 e TFF2 in una sezione di serie (B)
. Intestinale metaplasia e displasia
Nei ratti irradiati, metaplasia intestinale contenenti cellule caliciformi identificate da PAS-Alcian blu colorazione formarti nel fundica ghiandola (figura 7a). Le cellule che esprimono DCAMKL1 trovato sotto cellule foveolare nel compartimento luminale della mucosa, così come nella mucosa profonda (figura 7b, c). cellule PCNA è aumentato notevolmente nella mucosa intestinalized e le cellule DCAMKL1 nel compartimento luminale erano distale alle cellule PCNA (Figura 7c). cellule TFF2 esprimono, coerenti con SPEM, emerse alla base della mucosa intestinalized (Figura 7d). cellule PCNA trovato prossimale alle cellule DCAMKL1 profondità nel rivestimento epiteliale intestinalized, con un modello di distribuzione simile a quella nella piccola cripta intestinale (figura 7e, f). Figura 7 DCAMKL1 espressione nella mucosa intestinalized. (A) PAS-Alcian blu colorazione che mostra la mucosa con metaplasia intestinale contenenti cellule calice. Scala: 100 micron. (B-d) Sezioni seriali di (a), macchiato con DCAMKL1 (b), DCAMKL1 e PCNA (C), e TFF2 (d). (E, f) viste ingrandite delle aree delineate in (b) e (c), rispettivamente. Scale:. 10 micron
In ratti trattati con MNNG, dilatazione cistica delle ghiandole con displasia è stata raggiunta in mucosa e sottomucosa (Figura 8a). SPEM si è evoluto e ampliato nei pressi delle ghiandole dilatate e l'espressione segmentale di TFF2 è stato trovato nelle cellule di rivestimento delle ghiandole (Figura 8b). DCAMKL1 era scarsamente espresso in queste ghiandole (Figura 8c). TFF2 e DCAMKL1 sono stati espressi in diverse cellule nelle ghiandole dilatati (Figura 8d, 8e), e PCNA è stato anche espressi in cellule diverse da quelle cellule DCAMKL1, indicando la natura proliferativa delle ghiandole (Figura 8F). Figura 8 DCAMKL1 espressione nelle ghiandole dilatati con displasia. (A) Un H & sezione E-macchiati, che mostra la dilatazione cistica delle ghiandole. (B) Ampliamento del SPEM. Le frecce indicano espressione segmentale dei TFF2 nelle ghiandole dilatati. (C) L'espressione di DCAMKL1 nella ghiandola dilatata. (D-f) Sezioni seriali della ghiandola dilatato per TFF2 (d), DCAMKL1 (e) e DCAMKL1 con PCNA (f). Scale:. 100 micron
Discussione
Lo studio ha dimostrato che le cellule DCAMKL1 che esprimono sono esclusivamente presenti nell'istmo del ratto ghiandola fundica, in cui le cellule progenitrici multipotenti sono pensati per risiedere [1, 3]. Abbiamo dimostrato che le cellule DCAMKL1 sono discreti dalle cellule epiteliali differenziate, tra cui linee cellulari endocrino. Inoltre, la microscopia immunoelettronica mostrato che DCAMKL1 era espresso in cellule epiteliali immature con pochi organelli, che corrispondono alle cellule privo di granuli precedentemente proposto come cellule progenitrici presunte nel istmo gastrica [3]. DCAMKL1 è coespressi con Musashi-1 nelle cellule parietali dello stomaco del mouse [13], che questo studio ha dimostrato che le cellule DCAMKL1 erano distinte dalle cellule parietali, che esprimono Musashi-1 nello stomaco di ratto [5].
Modifiche sequenziali in perdita cellulare e il recupero della ghiandola gastrica dopo la lesione della mucosa superficiale con etanolo sono riassunti nella figura 9. i corsi tempo di cambiamenti nel numero di cellule DCAMKL1 e PCNA 6 a 96 ore dopo il trattamento di etanolo in ratti sono in linea con quelle di topo [13 ]. Inoltre, abbiamo analizzato cambiamenti precedenti in questi tipi cellulari. cellule DCAMKL1 e cellule PCNA desquamate con le cellule foveolare immediatamente dopo il trattamento etanolo. Una superficie della mucosa denudato dopo esposizione etanolo è ri-epitelizzata in 1 a 2 ore, mediante una rapida migrazione delle cellule dell'epitelio foveolare da vicino illeso [19]. Dal momento che questa restituzione anticipata non si basa sulla proliferazione cellulare, ma in materia di migrazione, mobilizzazione delle cellule progenitrici non è necessaria. Dopo un periodo di latenza di circa 8 ore, una raffica di attività proliferativa avvenuto fino a 24 ore per ripristinare la foveolae alla loro lunghezza originale [20]. Questo andamento temporale della proliferazione epiteliale dopo esposizione etanolo è simile a quello osservato nel presente studio. Figura 9 cambiamenti sequenziali in perdita cellulare e il recupero della ghiandola gastrica dopo la lesione della mucosa superficiale con etanolo.
Un recente rapporto ha mostrato che le cellule proliferanti PCNA-positivi contengono cellule prefoveolar [21]. L'aumento del numero di cellule proliferanti sono probabilmente derivato da cellule progenitrici, ma il processo di ripopolamento delle cellule progenitrici dopo l'infortunio è oscuro. In questo studio, le cellule DCAMKL1 stati reclutati prima del restauro di cellule proliferanti, e il numero e la distribuzione delle cellule DCAMKL1 cambiati quasi contemporaneamente a quelli delle cellule proliferanti dopo 24 ore. Questo risultato implica che le cellule DCAMKL1 esprimono sono progenitrici delle cellule che danno origine a cellule proliferanti. Diverse cellule DCAMKL1 e cellule PCNA erano presenti sulla superficie della mucosa durante il periodo di rigenerazione presto. spostamento transitoria della zona progenitore verso la superficie può contribuire a facilitare ripristino rapido e preferenziale delle cellule foveolare, che è il lignaggio che è più danneggiato e perse lesioni della mucosa superficiale. Dal momento che le cellule DCAMKL1 reclutate riapparvero entro un giorno dopo che le cellule indigeni sono stati persi, le ripopolamento cellule DCAMKL1 nella mucosa lesa può migrare da ghiandole non feriti o reclutare da progenie di una stirpe di cellule staminali multipotenti che subisce continua espansione o l'estinzione nella nicchia [9, 22].
I processi di ricostruzione della mucosa e di ripopolamento delle cellule progenitrici in un'ulcera profonda cronica differiva nettamente da quelle lesioni superficiali acute (Figura 10). linee cellulari differenziate vengono mantenute dopo la lesione superficiale acuta, mentre la differenziazione ordinata di linee cellulari della mucosa nel ulcera attivo è stato turbato e linee cellulari inerenti sono stati sostituiti da nuova concezione linee cellulari mucose. Parietale e cellule principali sono stati persi, iperplasia foveolare era evidente, e SPEM emerse nell'epitelio rigenerante che circonda l'ulcera attiva. Questi risultati imitano cambiamenti patologici in diversi modelli sperimentali indotti da atrofia acuta o cronica ossintiche [16, 17, 23, 24]. A margine dell'ulcera, MUC6 e pepsinogeno sembrano essere coexpressed con TFF2 alla base della ghiandola. Questo risultato supporta l'ipotesi che cellule principali transdifferenziare a SPEM [17, 25], e che il processo di ridifferenziazione da cellule mucose del collo a cellule principali viene modificato in un'ulcera attiva. Una spiegazione alternativa, che è più probabile sulla base dei risultati attuali, è che SPEM è derivato da cellule progenitrici e redifferentiates di cellule principali. La constatazione che SPEM è associata ad un aumento della proliferazione sostiene questa proposta [16, 24]. Figura 10 Alterazioni di linee cellulari mucosali nel margine di ulcere attivi e curativi.
Cronica ulcerazioni della mucosa del tratto gastrointestinale avvia un processo di guarigione dalla base mucosa sul bordo dell'ulcera e può indurre linee cellulari nuovi corrispondenti a SPEM [26 ]. Questi sembrano essere derivato da cellule staminali multipotenti nella cripta dell'intestino tenue e del colon, che SPEM e cellule proliferanti alla base del margine dell'ulcera gastrica è distante dal normale orario progenitore nell'istmo. Il modello di ulcera cronica in questo studio ha sviluppato diverse settimane dopo il trattamento, il che rende la migrazione delle cellule staminali derivate dal midollo osseo improbabile a causa attecchimento di queste cellule, come le cellule epiteliali gastriche si verifica nei topi dopo sostenuti H. felis
infezione su più di 1 anno , ma non in topi con un'ulcera gastrica indotta da acido acetico [27]. La presenza di una seconda popolazione progenitrici, cellule progenitrici criptici nello stomaco, è stato previsto da molti anni [16, 24], ma deve ancora essere identificato. In questo studio, le cellule progenitrici DCAMKL1 putative sono stati trovati in prossimità di due linee cellulari mucose, cellule foveolare e cellule SPEM, iperplasia al margine dell'ulcera. cellule DCAMKL1 giustapposti con SPEM sono compatibili con le cellule progenitrici criptici. Il marcatore di cellule progenitrici intestinale Lgr5 è presente alla base delle ghiandole e non nell'istmo [7], e che una popolazione di cellule progenitrici notevolmente aumentata durante l'infiammazione [6]. Noi ipotizziamo che le cellule DCAMKL1-esprimenti alla base della ghiandola gastrica sono la popolazione progenitore seconda linea, che viene mascherato in condizioni fisiologiche. Questi progenitori dormienti possono essere attivati ​​dalle citochine infiammatorie durante la formazione di ulcere, e possono svolgere un ruolo fondamentale nell'avviare il processo di guarigione.
Cellule DCAMKL1 e le cellule PCNA erano presenti vicino alle cellule /SPEM TFF2 nel margine dell'ulcera.

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