Veränderte Expression eines mutmaßlichen Vorläuferzellmarker DCAMKL1 bei der Ratte Magenschleimhaut bei der Regeneration, Metaplasie und dysplasia

veränderte Expression eines mutmaßlichen Vorläuferzellmarker DCAMKL1 bei der Ratte Magenschleimhaut bei der Regeneration, Metaplasie und Dysplasie
Zusammenfassung
Hintergrund
Double und Calcium /Calmodulin-abhängige Proteinkinase-like-1 (DCAMKL1) für Vorläuferzellen in der gastrointestinalen Schleimhaut ein Kandidat-Marker. Lineage-Zellen in der Magenschleimhaut werden aus Vorläuferzellen abgeleitet sind, aber dieses Verfahren kann nach einer Verletzung verändert werden. Deshalb haben wir DCAMKL1 Ausdruck unter pathologischen Bedingungen untersucht.
Methoden
Eine immunhistochemische Analyse wurde im Rattenmagen mit akuten oberflächlichen Verletzungen, chronische Geschwüre, intestinale Metaplasie und Dysplasie durchgeführt.
Ergebnisse | DCAMKL1 wurde ausschließlich ausgedrückt in unreif ruhende Zellen in den Isthmus von normalen Fundus Drüsen, wo mutmaßliche Vorläuferzellen werden gedacht, zu wohnen. DCAMKL1-positive Zellen und proliferierenden Zellen Schuppen in das Lumen nach oberflächlicher Verletzung und während des Regenerationsprozesses wieder erschienen, vor allem in der oberflächlichen Schleimhaut. Im Rand Schleimhaut um das aktive Geschwür, parietalen und Hauptzellen vermindert, war Becherzellhyperplasie Hyperplasie evident, und Dreiblatt Faktor Familie 2 (TFF2) /mildernde Polypeptid-exprimierenden Metaplasie (SPEM) entstand an der Drüse Basis. DCAMKL1 Zellen in der Schleimhaut tief tauchte wieder gegenübergestellt mit SPEM und wuchernden Zellen. In der Heilung Geschwür, erweitert die TFF2 Zellpopulation und schien Hauptzellen zu redifferenzieren, während wuchernden Zellen und DCAMKL1 Zellen oberhalb und unterhalb der TFF2 Zellen schien die Heilung zu fördern. SPEM erschien und PCNA-Zellen in der intestinalized Schleimhaut erhöht und DCAMKL1 wurde in der Nähe der PCNA-Zellen in der tiefen mucosa ausgedrückt. DCAMKL1, PCNA und TFF2 wurden in verschiedenen dysplastischen Zellen exprimiert dilatierten Drüsen nahe SPEM auskleiden.
Schlussfolgerung
ultrastruktureller Aussehen DCAMKL1-positive Zellen und die Expressionsmuster von DCAMKL1 in normalen und pathologischen Zustände zeigen an, daß die Zellen einem gehören Vorläuferzellpopulation. DCAMKL1 Ausdruck ist eng mit TFF2 /SPEM Zellen nach einer Verletzung in Verbindung gebracht. DCAMKL1 Zellen besiedeln Nähe von wuchernden, hyperplastische, metaplastischen und dysplastischen Zellen, und die Vorläuferzone verschiebt sich nach den pathologischen Umständen.
Hintergrund
der Maus und menschlichen Mageneinheit zeigt monoklonale Umwandlung, das Vorhandensein von multipotenten Stammzellen angibt [ ,,,0],1, 2]. Die elektronenmikroskopische Autoradiographie in der Maus haben angedeutet, dass Granulat-freien Zellen in den Isthmus wirken als multipotenten Stammzellen [3]. Die Differenzierung und Migrationsprozesse von Zelllinien können durch Verletzungen verändert werden. Die Vorläuferzellzone im Isthmus wird durch intraluminale Ethanol, nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente oder Helicobacter pylori
(H. pylori
) leicht beschädigt werden. Die chronische Entzündung des Magens kann als spürbare Wirkung von gewebespezifischen Vorläuferzellschädigung oder Verlust zu Atrophie und spezialisierten Zellverlust führen. Allerdings sind das Verhalten von Vorläuferzellen nach einer akuten oder chronischen Schädigung der Schleimhaut und den Mechanismus der Wiederherstellung dieser Zellen während der Schleimhautregeneration nicht gut verstanden.
Die Bevölkerung Vorläuferzelle ist wichtig, bei der Wartung und Regeneration des Magen-Epithel, aber langfris lebte Vorläuferzellen sind mit einem Risiko von Mutationen, die zu Krebs führen [4] zu akkumulieren. Neoplasien können zelluläre Metaplasie aufgrund einer chronischen Entzündung und Reparatur folgen. Jedoch genaue Analyse der Rolle und der Veränderung von Vorläuferzellen in der Folge der Gastritis-Metaplasie-Dysplasie-Krebs wurde nicht durchgeführt, vor allem aufgrund des Fehlens von diskreten Vorläuferzellmarker im Magen.
Musashi-1, a Marker von Vorläuferzellen in der Maus-Dünndarm, ist nicht in putative Vorläuferzellen exprimiert wird, wird jedoch in Parietalzellen in Rattenfundus Isthmus [5] zu finden. Die Zotten-1-Promotor /Enhancer-Fragment ist ein Marker für mögliche Magen-Vorläuferzellen in den Isthmus der Pylorusdrüsen [6]. Eine Linie Studie zeigte, dass die Darm-Vorläuferzellmarker Lgr5 ist an der Basis der prospektiven Fundus und Pylorusdrüsen in der Neugeborenen Magen exprimiert, während die Expression bei erwachsenen überwiegend auf der Basis der Pylorusdrüsen beschränkt wurde [7]. Somit gibt es keine eindeutigen Marker für Vorläufern bei erwachsenen Fundusdrüsen.
DCAMKL1 ist eines der Produkte der Gene Ontogenese angereicherten Transkripte im Vergleich mit der Maus Magen und Dünndarm-Vorläufer Datensätze gefunden [8]. Immunhistochemische Analyse einen DCAMKL1 Antikörper unter Verwendung ergab einzelne Zellfärbung in Darm-Krypta Abschnitte an oder in der Nähe der Position 4 und in Magen Isthmus Zellen [8]. Nach dem ersten Bericht spezifische Lokalisierung von Zellen in einer Stammzellnische DCAMKL1 exprimierenden wurde im Dünndarm der Mäuse [9, 10] und im Colon von Mäusen und Menschen [11, 12], während DCAMKL1 mit Musashi coexprimiert wurde gezeigt, -1 in Belegzellen im Magen von Mäusen [13].
das erste Ziel dieser Studie war es, festzustellen, ob DCAMKL1 ein Marker für die Vorläuferzellen bei der Ratte Magen. Das zweite Ziel war es, die zeitliche und räumliche Muster des Auftretens von Zellen, die DCAMKL1 unter mehreren Magen-pathologischen Bedingungen speziell aufzuklären.
Methoden
Vorbereitung der Tiere
Alle Tier Protokolle, die von der Keio University Animal Research Committee genehmigt. Männliche Wistar-Ratten, die etwa 200 g wogen, wurden 24 Stunden lang mit freiem Zugang zu Wasser fasten. Zur Herstellung von akuten oberflächlichen Verletzung im Fundus Schleimhaut, absolutem Ethanol (1 ml) wurde in den Magen durch Magensonde eingeflößt. chronische tiefe Geschwüre, 20% Essigsäure (50 ul) wurde in den Fundus Submukosa der vorderen Wand zu erzeugen, injiziert, um eine Mikrospritze verwenden. Die Ratten wurden 3 Tage eingeschläfert und 1, 2 und 3 Wochen nach der Essigsäure-Injektion.
Die Verfahren für die intestinale Metaplasie bei der Ratte Magenschleimhaut induziert wurde an anderer Stelle beschrieben worden [14, 15]. Kurz gesagt, erhielten die Ratten zwei Röntgendosen von 10 Gy jeweils und wurden 6 Monate nach der Bestrahlung euthanasiert. Das Verfahren zur Dysplasie in der Ratte Magenschleimhaut induziert wurde auch an anderer Stelle beschrieben [14]. Kurz gesagt wurden 50 &mgr; g /ml N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) an Ratten gegeben wurde ad libitum
für 4 Monate.
Antibodies
rabbit anti-DCAMKL1 Immunglobulin (Ig) G (Abcam, Cambridge, UK; Endverdünnung 1: 100), Maus-Anti-Proliferations cell nuclear antigen (PCNA) IgG (DAKO, Carpinteria, CA, gebrauchsfertig), Kaninchen-Anti -PCNA IgG (Abcam; 1: 200), Maus-anti-H + /K + - ATPase (ATPase) α-Untereinheit IgG (Research Diagnostics Inc. Flandern, NJ; 1: 200), Schaf-Anti -pepsinogen II IgG (United States Biological, Swampscott, MA; 1: 100), Maus-Anti-MUC6 IgM (Kanto Kagaku, Tokyo; 1: 100), Maus-Anti-MUC5AC IgG (Abcam; 1: 100), Maus-anti- TFF2 IgM (Abcam; 1: 200), Meerschweinchen anti-Histidin Decarboxylase (HDC) IgG (ARP, Belmont, MA; 1: 100), Ziege-anti-Ghrelin-IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1: 100 ) und Maus-Anti-Somatostatin-IgG (Biomeda, Foster City, CA; 01.25) als primäre Antikörper verwendet wurden
histologische Analyse
Der Magengewebe über Nacht in 10% neutral gepuffertem Formalin fixiert wurde, und dann. in Paraffin eingebettet und geschnitten (4 &mgr; m). Verwendung von Standardtechniken, die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H &E) gefärbt. Periodsäure-Schiff (PAS) -Alcian-Blau-Färbung durchgeführt wurde, Schleimhautzelllinien zu erkennen.
Zur immunhistochemischen Analyse, in Paraffin eingebettete Schnitte wurden mit einem entsprechenden Abrufverfahren für jedes Antigen deparaffinisiert und vorbehandelt. Die Schnitte wurden in 0,3% H 2 O 2 in Methanol für 10 Minuten inkubiert endogene Peroxidase zu inaktivieren, und dann mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,1% Tween 20 (PBST) gewaschen. Nach Inkubation mit Blockierungslösung (Block Ace, Dainippon Seiyaku, Tokyo, Japan) für 10 Minuten wurden die Schnitte mit einem primären Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde jeder Schritt durch Waschen 3x mit PBST für 3 Minuten. Die Schnitte wurden mit HP-konjugiertem IgG oder IgM für 40 Minuten inkubiert. Die markierten Zellen braun gefärbt wurden mit 3,3'-Diaminobenzidin-Hydrochlorid (DAB) unter Verwendung eines DAB-Reagenziensatz (DAKO) und dann mit Mayers Hämatoxylin gegengefärbt.
Für zweifarbige Immunfärbung, eine indirekte immunoalkaline Phosphatase-Methode wurde verwendet, folgende der indirekte Immunperoxidase-Verfahren oben beschrieben. Nach der Reaktion mit DAB wurden die Schnitte für 1 Stunde mit einem zweiten primären Antikörper inkubiert, durch Inkubation mit ALP-konjugiertem IgG oder IgM für 40 Minuten folgte. Die markierten Zellen wurden blau gefärbt mit einem ALP-Substrat-Kit III (Vector Blau, Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Für Antigen-Retrieval von Pepsinogen II und MUC6, Proteinase K (DAKO) wurde topisch auf die deparaffinierten Abschnitte angewendet 6 Protokoll. Für Antigen-Retrieval von PCNA (Maus-IgG) wurden die Schnitte in destilliertem Wasser in einem Autoklaven für 10 Minuten erhitzt. Für Antigen-Retrieval von MUC5AC wurden die Schnitte für 10 Minuten in Citrat-Puffer in einem Autoklaven erhitzt. Kein Antigen-Retrieval-Verfahren wurde für DCAMKL1, H verwendet + /K + -. ATPase, PCNA (Kaninchen-IgG), TFF2, HDC, Ghrelin oder Somatostatin-Färbung
Scoring von DCAMKL1 Zellen und PCNA Cells
Abschnitte, die zwei~~POS=TRUNC-immun~~POS=TRUNC mit DCAMKL1 und PCNA unterzogen wurden, die Anzahl der immunhistochemisch Zellen zu bestimmen, analysiert. Schnitte wurden von 5 Ratten verwendet und 10 gut orientierten Magen Einheiten wurden in jedem Abschnitt analysiert.
Elektronenmikroskopie
Pre-Einbettungs Immunperoxidase-Elektronenmikroskopie wurde wie folgt durchgeführt. Kleine Stücke von frischen Proben aus dem Magen-Korpus von unbehandelten Ratten wurden für 24 Stunden in 4% Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von der Fixierung in 0,1% Glutaraldehyd und 4% Paraformaldehyd für 1 Stunde. Kryostatschnitte (6 &mgr; m) wurden hergestellt und 48 Stunden lang mit Anti-DCAMKL1 Antikörper inkubiert, gefolgt von Inkubation mit HP-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG für 24 Stunden. Die Schnitte wurden dann 5 Minuten lang mit 0,5% Glutaraldehyd fixiert, reagierte mit DAB, nachfixiert mit 2% Osmiumtetroxid, dehydratisiert durch eine abgestufte Ethanolreihe und in Epoxidharz eingebettet. Ultradünne Schnitte wurden mit einem Ultramikrotom geschnitten und in Uranylacetatlösung und Bleizitrat Lösung gefärbt. Die Proben wurden unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (JEM-1200EX, JEOL, Tokyo, Japan) untersucht.
Ergebnisse
Normale Fundusdrüsen
DCAMKL1-exprimierende Zellen wurden im oberen Drittel des normalen Fundusdrüsen verteilt, in eine Region, bezeichnet als Isthmus (1A). In der Elektronenmikroskopie wurden DCAMKL1-Zellen auch in der Isthmus (1B, a) gefunden. Die DCAMKL1 Zelle war kleiner als die Belegzellen, die in den Mitochondrien reich war, und es fehlte die Sekretgranula in der endokrinen Zellen gesehen (1B, b). DCAMKL1 Immunreaktivität wurde diffus im Zytoplasma, was ein hohes Verhältnis nukleozytoplasmatischen (1B, C) gefunden. DCAMKL1 Zellen waren in epithelialen Zellauskleidungen, da die Zellen Desmosomen in der Verbindung mit benachbarten Epithelzellen (Abbildung 1B, d) hatte. Die DCAMKL1 Zellen hatten ein unreifes Erscheinungsbild mit wenigen Mitochondrien, Vesikel oder sekretorischen Granula (1B, C und 1B, d). Abbildung 1: Verteilung und Ultrastruktur von Zellen in normalen Rattenmagen DCAMKL1-Ausdruck zu bringen. (A) Eine lichtmikroskopische Aufnahme, die zeigen, wo DCAMKL1 Zellen in der Schleimhaut Fundus. Maßstab: 100 &mgr; m. Der Einschub zeigt eine vergrößerte Ansicht der umrandete Bereich in A. Maßstab: 10 &mgr; m. (B) TEM-Aufnahmen. (A, c) Ultradünne Schnitte ohne Gegen. (B, d) Ultradünne Schnitte mit Gegen. (A) DCAMKL1 Zellen in der Fundusdrüsen. Maßstab: 2 &mgr; m, Vergrößerung × 5600. (B) Die DCAMKL1 Zelle (D) war kleiner als die Belegzellen (P), die in den Mitochondrien reich war, und es fehlte die Sekretgranula in der endokrinen Zellen gesehen (E). Maßstab: 2 &mgr; m, Vergrößerung × 7000. (C) DCAMKL1 zytoplasmatische Färbung war vorherrschend. Maßstab: 1 &mgr; m, Vergrößerung × 14.400. (D) Pfeilspitzen zeigen Desmosomen. Der weiße Pfeil zeigt DCAMKL1 Immunreaktivität. Maßstab:. 2 um, Vergrößerung × 8400 kaufen Wir verglichen neben der Verteilung von DCAMKL1 Zellen mit denen von bekannten epithelialen Zelllinien. DCAMKL1 Zellen wurden vermischt mit Zellen gekennzeichnet von PCNA in dem Isthmus (2a), aber keine Zellen enthielten DCAMKL1 PCNA proliferierenden. DCAMKL1 Zellen unter Becherzellhyperplasie Zellen residierte (gefärbt mit Alcianblau, 2b) und über Schleimhäute Hals-Zellen (gefärbt mit MUC6 und TFF2, 2c, d). Parietal Zellen und Hauptzellen in den Isthmus zu DCAMKL1 benachbarten Zellen waren, aber DCAMKL1 Zellen nicht H + /K + -ATPase oder Pepsin (Abbildung 2e, f) koexprimiert. DCAMKL1 Zellen wurden ebenfalls von endokrinen Zelllinien diskret. Die DCAMKL1 Zellpopulation war weit entfernt von enterochromaffinen-Zellen, die hauptsächlich in der Fundus Basis (2g) verteilt wurden. Eine Mehrheit der A-wie gewohnt Zellen im Fundus Basis mit einigen in den Isthmus verteilt, sondern unterscheidet sich von DCAMKL1 Zellen (Abbildung 2h) und D-Zellen deutlich von DCAMKL1 Zellen unterschieden (Abbildung 2i). Figur 2 Doppelfarben-Immunfärbung zeigt die Lokalisierung von DCAMKL1-exprimierenden Zellen und epithelialen Zelllinien, umfassend Zellen, die mit PCNA-markierte Kerne (a), Alcian-Blau-gefärbten Becherzellhyperplasie Zellen (b) proliferierende, MUC6 gebeiztes Schleim- Hals Zellen (c), TFF2 färbten Schleimhaut Hals-Zellen (d), H + /K + -ATPase-gefärbten Belegzellen (e), Pepsin Hauptzellen (f), HDC-gefärbten enterochromaffinen-Zellen (g)-II gefärbt, Ghrelin-gefärbte A- ähnliche Zellen (h) und Somatostatin-gefärbten Zellen D (i). Waage: 100 &mgr; m. Der Einschub in (e) zeigt eine vergrößerte Ansicht der umrandete Bereich. Beachten Sie, dass die DCAMKL1 Zellen aus den Belegzellen verschieden waren
Akute Oberflächliche Mukosaverletzung und Rapid Renewal
histologische Analyse des Prozesses der Schädigung der Schleimhaut und Reparatur nach Ethanol Verwaltung unter Verwendung von H &. E-Färbung und zweifarbigen DCAMKL1 und PCNA Immunfärbung ist in Abbildung 3 dargestellt Unmittelbar nach Ethanol-Behandlung, DCAMKL1 Zellen und PCNA-Zellen aus der Drüse abgelöst und Schuppen in das Lumen mit Becherzellhyperplasie Zellen (Abbildung 3Aa und 3Ba). DCAMKL1 Zellen und PCNA Zellen waren fast in der beschädigten Schleimhaut 1 Stunde nach der Ethanol-Behandlung (Abbildung 3Ab und 3Bb) verschwunden. DCAMKL1 Zellen erschien dann nach 6 Stunden, und einige waren anwesend in der Nähe der Schleimhautoberfläche (Abbildung 3Ac und 3Bc). PCNA-Zellen bei 24 Stunden nach der Ethanol (Abbildung 3Ad und 3Bd) erhöht, während mehrere DCAMKL1 Zellen und PCNA-Zellen in der Schleimhautoberfläche vorhanden waren (Abbildung 3AE und 3be). Die Verteilung der DCAMKL1 Zellen und PCNA Zellen hatten die morphologischen Aussehen von unbehandeltem Fundus Schleimhaut nach 96 h (Abbildung 3AF und 3BF). Abbildung 3 Immunhistochemische Analyse von oberflächlichen Verletzungen der Schleimhaut nach Ethanol-Behandlung. (A) Doppel-Farbe Immunfärbung für DCAMKL1 Zellen und PCNA-Zellen. Magenabschnitte bei 5 Minuten (a) genommen, 1 Stunde (b), 6 Stunden (c), 24 Stunden (d, e) und 96 Stunden (f) nach der Ethanolbehandlung. (B) H & E-gefärbten Schnitten, den zeitlichen Verlauf der Magenschleimhaut Schäden und Reparatur nach Ethanol Verwaltung zeigt. (Af) Serienschnitte der jeweiligen Abschnitte in A. Scales:. 100 um
Zeitkurse von Änderungen in der Zahl der DCAMKL1 und PCNA-Zellen werden in Abbildung 4. Die Anzahl der Zellen DCAMKL1 gezeigt verändert fast gleichzeitig mit der PCNA Zellen, aber die Rekrutierung von DCAMKL1 Zellen begann 6 Stunden nach der Ethanol-Behandlung, vor der Einstellung von PCNA-Zellen. Figur 4 Zeitverläufe der Anzahlen von DCAMKL1 Zellen (A) und PCNA-Zellen (B) in einer Stopfbuchse nach ethanol Verabreichung. Jeder Balken stellt den Mittelwert ± SE von Ergebnissen aus 5 Ratten. Die Y-Achse zeigt die Anzahl der Zellen pro Drüse und der X-Achse zeigt die Zeit nach der Verabreichung ethanol. Chronic Ulcer
Tiefe Geschwüre beteiligt gesamte Schleimhautschichten Karten und Durchdringen der muscularis mucosa 3 Tage nach der Behandlung produziert wurden mit Essigs Acid. Die meisten Geschwüre nach 2 Wochen der Behandlung geheilt und einige wiedergekehrt nach 3 Wochen. Eine histopathologische Analyse der Schleimhautregeneration wurde unter Verwendung von Gewebe in 1 bis 3 Wochen nach der Behandlung durchgeführt. Zystisch dilatierten Drüsen in der regenerativen Schleimhaut des Ulkusränder um den Krater eines aktiven Geschwür prominent waren (Abbildung 5a, b). Diese Drüsen wurden mit Zellen ausgekleidet exprimierenden MUC5AC, eine Markierung von Becherzellhyperplasie Zellen (Abbildung 5c). Darüber hinaus TFF2, einem Marker der Schleimhäute Hals Zellen in unbehandelten Ratten zeigten eine intensive Färbung an der Basis regenerativer Fundus Drüsen (5d), ähnlich wie bei TFF2 Färbung von tiefen antral Drüsenzellen und im Einklang mit der Entstehung einer SPEM Zelle Phänotyp [16, 17]. Im Gegensatz dazu ist die Expression von MUC6, eine weitere Markierung von Schleim Hals Zellen in unbehandelten Ratten, in der regenerativen Schleimhaut verschlechtert und nur schwach MUC6 Färbung wurde in den Zellen an der Drüse Basis (Abbildung 5e) beobachtet. Chef-Zellen auch im Ulkusränder vermindert und Zellen schwach gefärbt mit Pepsin wurden nur an der Drüse Basis (5f) sichtbar gemacht. Somit war es eine Überlappung in der Expression von TFF2, MUC6 und Pepsinogen in Zellen an der Basis (5, d-f). Parietalen Zellen wurden in das Gewebe der Rand mucosa des aktiven Ulkus (Abbildung 5 g) fehlt. PCNA-Zellen in den Drüsen und Mesenchym des Ulkusränder und eine deutliche Zunahme in diesen Zellen erhöht wurde, an der Abdichtbasis (Figur 5h) festgestellt. Abbildung 5 Muster von Epithelzellen in der marginalen Schleimhaut eines aktiven Geschwür. (A) Der H & E-gefärbten Abschnitt bei 1 Woche nach der Behandlung mit Essigsäure genommen, einen Krater von Granulationsgewebe und Rand Gewebe um den Krater zeigt. Maßstab: 1000 um. (B) eine vergrößerte Ansicht der Ulkusränder Schleimhaut skizziert in (a). Maßstab: 100 &mgr; m. (C-h) Serielle Schnitte von (b), gefärbt mit MUC5AC (c), TFF2 (d), MUC6 (e), Pepsinogen II (f), H + /K + -ATPase (g) und PCNA (h). (I-k) Doppelfarben-Immunfärbung für DCAMKL1 mit MUC5AC (i), DCAMKL1 mit TFF2 (j) und PCNA mit TFF2 (k). Waage: 100 &mgr; m. (L) Doppel-color-Immunfärbung für DCAMKL1 mit PCNA. Maßstab: 10 &mgr; m. Der Einschub in (h-k) zeigt eine vergrößerte Ansicht der umrandete Bereich.
Wir erkundeten dann DCAMKL1 Ausdruck in der marginalen Schleimhaut des aktiven Geschwür. Verstreute DCAMKL1-exprimierenden Zellen vorhanden waren nahe an MUC5AC Zellauskleidungen (Abbildung 5i) und nebeneinander mit SPEM-Zellen (5j). PCNA-Zellen wurden auch in der Nähe von SPEM Zellen und einigen SPEM Zellen koexprimiert PCNA (5K) verteilt, was bedeutet, dass die SPEM lineage wird multipliziert und proliferative. DCAMKL1 Zellen wurden mit PCNA-Zellen an der Basis der Drüse verwirbelt, aber nicht coexprimieren PCNA (Abbildung 5l). Dies zeigt, dass DCAMKL1 Zellen in einem Ruhezustand gehalten werden. Die Vorläuferzone von PCNA-Zellen und DCAMKL1 Zellen aus dem Isthmus in der normalen Drüse an der Basis am Rand des aktiven Geschwür verschoben wurde. In der Einheilphase
, das Geschwür Größe reduziert und Epithelzellen wurden wiederhergestellt (Abbildung 6a) . In der Heilung Geschwür, war ein Gradient von Epithelregeneration vorhanden von dem Geschwür Rand zu den regenerierten Drüsen entfernt von dem Geschwür (6b). In der regenerativen Schleimhaut des Heilungs Geschwür, Schleim-ähnliche Zellen deutlich erhöht. Diese Zellen wurden an der Basis in der Ulkusränder lokalisiert und erweitert, um die Hälse der Drüsen als Heilung verlief. MUC5AC Zellen verringert im Nacken- und war hauptsächlich in der foveolae (Figur 6c), ähnlich wie die Stelle in der normalen Fundus Schleimhaut. Die expandierenden schleimartigen Zellen bei der Heilung Geschwür wurden zum Teil durch MUC5AC gefärbt, aber vorwiegend mit TFF2 (Abbildung 6d) gefärbt. MUC6 wurde in Zellen an der Drüse Basis, aber nicht in den in den Hals (6e) ausgedrückt, während Pepsin in Zellen in den Hals (Abbildung 6f) ausgedrückt wurde. Parietalen Zellen, die in der aktiven Ulcus verschwunden war, erschien wieder ober- und unterhalb der TFF2 Zellpopulation in der Schleimhaut des Heilungs Ulkus (6g). In der normalen Schleimhaut sind Belegzellen aus Vorläuferzellen im Isthmus abgeleitet, darin reifen, und dann mehrere Tage dauern, bis die Basis zu wandern nach unten [18], während bei der Heilung Geschwür, den Hals und die Basis der Drüse Belegzellen neu besiedelt gleichzeitig. PCNA wurde oben TFF2 Zellen in der Nähe des Geschwürs stark gerade ausgedrückt, was auf verbesserte Verstärkung der Epithelzellen in diesem Bereich (Figur 6h). Einige PCNA-Zellen wurden auch unter den TFF2 Zellen verteilt. DCAMKL1 Zellen erschien wieder oben und mit der unteren Hälfte der TFF2 Zellpopulation (Abbildung 6i) gegenübergestellt. Dieses duale Verteilungsprofil der Vorläuferzone kann auf die Förderung von schnellen und effizienten Schleimhautregeneration beitragen. Abbildung 6 Muster von Epithelzellen und DCAMKL1 Zellen in der regenerativen Schleimhaut eines Heilungs Geschwür. (A) Der H & E-gefärbten Abschnitt in 2 Wochen nach der Behandlung mit Essigsäure aufgenommen, die regenerative Gewebe des Heilungsgeschwür zeigt. Maßstab: 1000 um. (B) eine vergrößerte Ansicht der regenerativen mucosa umrissen in (a). Ein Gradient von Epithelregeneration aus dem Geschwür Rand (rechte Seite), um die regenerierte Schleimhaut entfernt von dem Geschwür (linke Seite) wurde identifiziert. Maßstab: 100 &mgr; m. (C-h) Serielle Schnitte von (b), gefärbt mit MUC5AC (c), TFF2 (d), MUC6 (e), Pepsinogen II (f), H + /K + -ATPase (g) und PCNA (h). (I) Doppel-color-Immunfärbung für DCAMKL1 und TFF2 in einem seriellen Abschnitt (b).
Intestinale Metaplasie und Dysplasie
In bestrahlte Ratten, mit intestinaler Metaplasie Zellen Becher identifiziert durch PAS-Alcian-Blau-Färbung im Fundus gebildet Drüse (Abbildung 7a). Exprimierenden Zellen DCAMKL1 wurden unter Becherzellhyperplasie Zellen in der luminalen Kompartiment der Schleimhaut sowie in der Tiefe mucosa (7b, c) gefunden. PCNA Zellen deutlich in der intestinalized mucosa und DCAMKL1 Zellen in der luminalen Kompartiment erhöht waren distal der PCNA-Zellen (Figur 7c). TFF2-exprimierenden Zellen, im Einklang mit SPEM entstand auf der Basis der intestinalized mucosa (Abbildung 7d). PCNA-Zellen wurden proximal DCAMKL1 Zellen tief im intestinalized epitheliale Auskleidung, mit einem ähnlichen Verteilungsmuster der in der Dünndarm Krypta gefunden (7e, f). 7 DCAMKL1 Ausdruck in der intestinalized Schleimhaut. (A) PAS-Alcian-Blau-Färbung der Schleimhaut mit intestinaler Metaplasie enthaltenden Becherzellen zeigt. Maßstab: 100 &mgr; m. (B-d) Serienschnitte von (a), gefärbt mit DCAMKL1 (b), DCAMKL1 und PCNA (c) und TFF2 (d). (E, f) Vergrößerte Ansichten der skizzierten Bereiche in (b) und (c) sind. Skalen:. 10 &mgr; m
Bei Ratten mit MNNG behandelt, zystische Dilatation der Drüsen mit Dysplasie wurde in der Schleimhaut und Submukosa (Abbildung 8a) ausgelöst. SPEM sich weiterentwickelt und erweitert in der Nähe der erweiterten Drüsen und segmentale Expression von TFF2 wurde in Zellen entlang der Drüsen (Abbildung 8b) gefunden. DCAMKL1 war spärlich in dieser Drüsen (Abbildung 8c) ausgedrückt. TFF2 und DCAMKL1 wurden in verschiedenen Zellen in den erweiterten Drüsen (8d, 8e) ausgedrückt und PCNA wurde auch in anderen Zellen als DCAMKL1 Zellen exprimiert, was auf die proliferative Natur der Drüsen (8f). Abbildung 8 DCAMKL1 Ausdruck in den erweiterten Drüsen mit Dysplasie. (A) Der H & E-gefärbten Schnitt, die zystische Dilatation der Drüsen. (B) Ausbau der SPEM. Die Pfeile zeigen die Segment Expression von TFF2 in den erweiterten Drüsen. (C) Die Expression von DCAMKL1 in der dilatativen Drüse. (D-f) Serienschnitte der erweiterten Drüse für TFF2 (d), DCAMKL1 (e) und DCAMKL1 mit PCNA (f). Skalen:. 100 &mgr; m
Diskussion
Die Studie zeigte, dass DCAMKL1-exprimierenden Zellen in der Isthmus der Ratte Fundusdrüsen ausschließlich vorhanden sind, in denen multipotente Vorläuferzellen gedacht aufzuhalten [1, 3]. Wir haben gezeigt, dass DCAMKL1 Zellen aus differenzierten Epithelzellen diskret sind, einschließlich endokrinen Zelllinien. Weiterhin Immunelektronenmikroskopie zeigte, dass DCAMKL1 wurde in unreifen Epithelzellen mit wenigen Organellen ausgedrückt, die zuvor als vermutliche Vorläuferzellen im Magen Isthmus vorgeschlagen zu den Granula freien Zellen entsprechen [3]. DCAMKL1 mit Musashi-1 in Belegzellen in der Maus Magen [13] koexprimiert, während diese Studie gezeigt, dass DCAMKL1 Zellen aus Belegzellen verschieden waren, die Musashi-1 im Rattenmagen ausdrücken [5].
Sequential Änderungen in Zellverlust und Wiederherstellung der Magen-Drüse nach oberflächlichen Schleimhaut mit Ethanol Verletzungen sind in Abbildung 9 die Zeitverläufe von Änderungen in der Zahl der DCAMKL1 und PCNA Zellen 6 bis 96 Stunden nach Ethanol-Behandlung bei Ratten sind im Einklang mit den in der Maus [13 zusammengefasst ]. Darüber hinaus analysierten wir früher Veränderungen dieser Zelltypen. DCAMKL1 Zellen und PCNA Zellen abgestoßenen mit Becherzellhyperplasie Zellen unmittelbar nach der Ethanol-Behandlung. Eine entblößte Schleimhautoberfläche nach Ethanolexposition wird in 1 bis 2 Stunden wieder epithelialisiert durch schnell Becherzellhyperplasie Zellen aus dem nahe gelegenen unverletzt Epithel [19] zu migrieren. Da diese frühen Restitution auf die zelluläre Proliferation nicht beruht, sondern auf Migration, Mobilisierung von Vorläuferzellen ist nicht erforderlich. Nach einer Latenzzeit von etwa 8 Stunden trat ein Platzen der proliferativen Aktivität bis 24 Stunden, die foveolae ihrer ursprünglichen Länge [20] wiederherzustellen. Dieser zeitliche Verlauf der Epithelzellen-Proliferation nach der Ethanolexposition ist ähnlich der in der vorliegenden Studie beobachtet. Abbildung 9 Sequential Veränderungen der zellulären Verlust und Wiederherstellung der Magen-Drüse nach oberflächlichen Verletzungen der Schleimhaut mit Ethanol.
Ein kürzlich veröffentlichter Bericht hat gezeigt, dass PCNA-positive wuchernden Zellen enthalten prefoveolar Zellen [21]. Die erhöhte Anzahl Zellen proliferieren wahrscheinlich aus Vorläuferzellen abgeleitet, aber der Prozess der Progenitorzellen Neubesiedlung nach der Verletzung ist unklar. In dieser Studie wurden DCAMKL1 Zellen vor der Wiederherstellung der proliferierenden Zellen rekrutiert, und die Anzahl und Verteilung der Zellen verändert DCAMKL1 fast gleichzeitig mit denen von proliferierenden Zellen nach 24 Stunden. Diese Erkenntnis impliziert, dass DCAMKL1-exprimierenden Zellen Zellen Vorläufer, die zu vermehrenden Zellen geben. Mehrere DCAMKL1 Zellen und PCNA-Zellen vorhanden waren, während der frühen Regenerationsperiode an der Schleimhautoberfläche. Transient Verschiebung der Vorläuferzone in Richtung der Oberfläche schnell und Vorzugswiederherstellung der Becherzellhyperplasie Zellen zu erleichtern, kann helfen, die die Linie ist, dass die meisten beschädigt ist und bei oberflächlichen Verletzungen der Schleimhaut verloren. Da die rekrutierten DCAMKL1 Zellen innerhalb eines Tages wieder aufgetaucht, nachdem die einheimischen Zellen verloren wurden, wandern die repopulating DCAMKL1 Zellen in den verletzten Schleimhaut kann aus nicht verletzt Drüsen oder von Nachkommen einer Zelllinie multipotente Stamm rekrutieren, die eine kontinuierliche Expansion oder vom Aussterben in der Nische erfährt [9, 22]., Die Prozesse der Schleimhaut Rekonstruktion und Progenitorzellen Neubesiedlung in einer chronischen deutlich von denen unterscheiden tiefen Geschwür in akuten oberflächlichen Verletzungen (Abbildung 10). Differenzierte Zelllinien sind nach einer akuten oberflächlichen Verletzung aufrechterhalten, während geordnete Differenzierung der Schleimhautzelllinien in der aktiven Geschwür gestört wurde und die inhärente Zelllinien wurden durch neu entwickelte Schleimhautzelllinien ersetzt. Parietal und Chief Zellen wurden verloren, Becherzellhyperplasie Hyperplasie war offensichtlich, und SPEM im Regenerations Epithel tauchte das aktive Geschwür umgibt. Diese Befunde imitieren pathologischen Veränderungen in verschiedenen Versuchsmodellen von akuter oder chronischer oxyntic Atrophie induzierte [16, 17, 23, 24]. Im Ulkusränder, MUC6 und Pepsin scheinen mit TFF2 an der Drüse Basis zu koexprimiert. Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass die Hauptzellen transdifferentiate zu SPEM [17, 25], und dass der Prozess der Redifferenzierung von Schleim Hals Zellen Hauptzellen in einem aktiven Geschwür modifiziert. Eine alternative Erklärung, die eher auf den vorliegenden Ergebnissen basiert, ist, dass SPEM von Vorläuferzellen abgeleitet ist und redifferentiates zu Hauptzellen. Die Erkenntnis, dass SPEM mit erhöhter Proliferation assoziiert unterstützt diesen Vorschlag [16, 24]. 10 Veränderungen der Schleimhaut-Zelllinien in den Rand der aktiven und heilenden Geschwüren.
Chronic mukosalen Ulzerationen im Magen-Darm-Trakt initiiert einen Heilungsprozess von der Basis der Schleimhaut am Ulkus Kante und können neue Zelllinien induzieren 26 bis spem entsprechenden [ ]. Diese scheinen von multipotenten Stammzellen in der Krypta des Dünndarms und des Dickdarms, abgeleitet werden, während SPEM und in den Isthmus von der normalen Vorläuferzellen Zone an der Basis des Randes des Magengeschwür ist weit entfernt proliferierenden. Die chronische Geschwür Modell in dieser Studie entwickelte mehrere Wochen nach der Behandlung, die Migration von Knochenmark-Stammzellen unwahrscheinlich, weil Verpflanzung dieser Zellen als Magenepithelzellen tritt bei Mäusen nach anhalt H. felis
Infektion über mehr als 1 Jahr macht , aber nicht durch Essigsäure induzierten mit einem Magengeschwür in Mäusen [27]. Das Vorhandensein einer zweiten Vorläuferpopulation, kryptische Vorläuferzellen im Magen, ist seit vielen Jahren vorhergesagt [16, 24], hat aber noch nicht identifiziert werden. In dieser Studie wurden mutmaßliche Vorläufer DCAMKL1 Zellen in der Nähe von zwei Schleimhautzelllinien, Becherzellhyperplasie Zellen und SPEM Zellen, Hyperplasie am Ulkusränder gefunden. DCAMKL1 Zellen nebeneinander mit SPEM sind kompatibel mit den kryptischen Vorläuferzellen. Die Darm-Vorläuferzellmarker Lgr5 ist an der Basis der Drüsen und nicht in den Isthmus [7], und dass eine Vorläuferzellpopulation deutlich während der Entzündung erhöht [6]. Wir vermuten, dass DCAMKL1-exprimierenden Zellen an der Basis der Magen-Drüse sind die Second-Line-Vorläuferpopulation, die unter physiologischen Bedingungen maskiert ist.

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