PLoS ONE: la miscela probiotico VSLAccelera ulcera gastrica guarigione, stimolando crescita dell'endotelio vascolare Factor

Estratto

Studi valutare l'effetto e il meccanismo di probiotici sulle malattie del tratto gastrointestinale superiore (GI) tra cui le ulcere gastriche sono limitati, nonostante un ampio lavoro e promettenti risultati di questa opzione terapeutica per altre malattie dell'apparato gastrointestinale. In questo studio, abbiamo studiato i meccanismi con cui la miscela probiotico VSL(una miscela di otto batteri probiotici, tra cui lattobacilli
, bifidobatteri
e Streptococcus
specie) guarisce acido acetico indotta ulcera gastrica nel ratto. VSLè stato somministrato per via orale a bassa (6 × 10 ^{9 batteri) o alto (1,2 × 10 10 batteri) dosaggi da giorno 3 dopo l'induzione ulcera per 14 giorni consecutivi. VSLtrattamenti significativamente migliorata cicatrizzazione dell'ulcera gastrica in modo dose-dipendente. Per valutare il meccanismo (s), per cui VSLha esercitato i suoi effetti protettivi, abbiamo quantificato l'espressione genica di diversi pro-infiammatorio citochine, proteine ​​e di espressione di stomaco mucina-MUC5AC, citochine IL-10 regolamentare, COX-2 e vari crescita fattori. Di tutti i componenti esaminati, solo espressione e proteine ​​produzione di VEGF è aumentata 332 volte il giorno 7 nei tessuti ulcerati degli animali trattati con VSL. Com'era prevedibile, gli animali trattati con l'anticorpo neutralizzante VEGF significativamente ritardata guarigione delle ulcere gastriche in VSLanimali trattati. Questo è il primo rapporto a dimostrare elevata efficacia della miscela probiotico VSLnel migliorare la guarigione delle ulcere gastriche. efficacia probiotico è stato efficace a concentrazioni più elevate di VSLda specificamente aumentando l'espressione e la produzione di fattori di crescita angiogenesi promuovere, in primo luogo VEGF}

Visto:. Dharmani P, De Simone C, Chadee K (2013) la miscela probiotico VSLAccelera ulcera gastrica guarigione, stimolando Vascular Endothelial Growth Factor. PLoS ONE 8 (3): e58671. doi: 10.1371 /journal.pone.0058671

Editor: John Wallace, McMaster University, Canada |

Ricevuto: October 29, 2012; Accettato: 7 febbraio 2013; Pubblicato: March 6, 2013

Copyright: © 2013 Dharmani et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del Canadian Institute for Health Research (CIHR, KC). PD è stato finanziato da un Canadian Association of Gastroenterology-Axcan Pharma-CIHR ricerca e Fellowship Award. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Conflitto di interessi:. Gli autori hanno la seguente interessi. PD è stato finanziato da un Canadian Association of Gastroenterology-Axcan Pharma-CIHR ricerca e Fellowship Award. Ciò non toglie l'aderenza degli autori a tutte le politiche di PLoS ONE sui dati e la condivisione di materiale.

Introduzione

gastrica guarigione dell'ulcera è una spontanea, serie complicata di diversi meccanismi che lavorano in tandem per correggere lo squilibrio tra l'aggressivo (ad esempio, l'acido, pepsina, citochine proinfiammatorie e Helicobacter pylori
) e fattori difensivi (ad esempio, muco, bicarbonato, il flusso di sangue e fattori di crescita) a stomaco [1]. Il processo prevede la mitigazione dei fattori luminali aggressivi, il riempimento di difetti della mucosa con proliferanti e la migrazione di cellule epiteliali e componente connettivo in modo da ricostruire l'architettura della mucosa [2]. Noi e gli altri [3], [4], [5] hanno dimostrato l'efficacia e il meccanismo putativo di diversi farmaci ed erbe nel migliorare il processo di guarigione delle ulcere spontanea in vari in vivo
modelli ulcera gastrica. Tuttavia, gli studi che valutano gli effetti dei probiotici sulle malattie del tratto gastrointestinale superiore (GI) e in particolare sul ulcera gastrica sono limitati, nonostante l'ampio lavoro e promettenti risultati di questa opzione terapeutica per altre malattie gastrointestinali, tra cui la malattia infiammatoria intestinale [6], [ ,,,0],7], [8], [9].

probiotici sono microrganismi vivi che, oltre al valore nutritivo conferiscono benefici per la salute quando forniti in quantità abbondante. VSLè un preparato probiotico contenente una miscela di otto specie batteriche, quattro specie di lattobacilli
( acidophilus
, bulgaricus
, casei
, plantarum
), tre specie di bifidobatteri
( breve
, infantis
, longum
) e un Streptococcus
specie, che ha dimostrato di essere clinicamente efficace nel prevenire le fiammate di pouchitis refrattario [8] e portare a remissione della colite ulcerosa [9]. Abbiamo precedentemente dimostrato che VSLo dei suoi prodotti secreti sono potenti secretagoghi mucina del colon in vitro
sulle cellule epiteliali del colon umano e negli studi del ciclo del colon in modelli animali [10]. Tuttavia, l'effetto del trattamento probiotico sul danno gastrico acuta associata con ulcere gastriche non è ben esplorata. Il motivo principale è che l'intestino fornisce una serie di condizioni fisiologiche avverse come pH acido, enzimi digestivi, acidi biliari e sollecitazioni meccaniche che attenua la sopravvivenza e la crescita di microrganismi probiotici. Tuttavia, il trattamento con ampia quantità di diversi microrganismi probiotici può superare questa limitazione. Ci sono alcune segnalazioni di singoli batteri probiotici, tra cui Lactobacillus rhamnosus
[11], L. gasseri
[12], L. acidophilus
[13] e Bifidobacterium
[14] il conferimento della protezione contro le ulcere gastriche nel promuovere la guarigione dell'ulcera in diversi in vivo
modelli ulcera. Tuttavia, gli studi sugli effetti dei batteri probiotici sul miglioramento H. pylori
eradicazione erano incoerenti nella loro risultati [14], [15]. Un recente studio ha dimostrato che la supplementazione con adeguata miscela di 8 probiotici ceppi potrebbe sradicare H. pylori
[16]. Allo stato attuale, ancora non sa se i batteri probiotici misti sono più efficaci di ceppi singoli nel promuovere la guarigione dell'ulcera. In questo studio, abbiamo studiato i meccanismi cellulari per cui VSLmiscela di probiotici aumentata cicatrizzazione dell'ulcera gastrica nei ratti.

Materiali e Metodi

Animali

sei settimane di età ratti maschi Sprague-Dawley di peso compreso tra 150 e 200 g (Charles River, San Constant, Quebec) sono stati alloggiati in gabbie 2 per gruppo a temperatura ambiente costante, con 12 ore di luce e cicli scuri, e nutriti chow standard di roditori e acqua ad libitum
. A seguito di un periodo di acclimatazione di 7 giorni, i ratti sono stati randomizzati in gruppi sperimentali e di controllo per l'induzione di ulcera gastrica. L'esperimento su animali Comitato Etico dell'Università di Calgary ha approvato questo studio.

Experimental design

Per studiare l'effetto di VSLmiscela di probiotici sulla cicatrizzazione dell'ulcera gastrica e la mitigazione dei fattori luminali offensivi (pro citochine -inflammatory) e la promozione di fattori citoprotettive difensivi (citochine di regolamentazione, mucina e fattori di crescita), i ratti sono stati divisi in tre gruppi sperimentali. Controlli gli animali sono stati trattati con veicolo dopo l'induzione ulcera e altri due gruppi che hanno ricevuto sia bassa (6 × 109 batteri /animale /giorno) o alto (1,2 × 1010 batteri /animale /giorno) la dose VSL. Gli animali sono stati sacrificati il ​​giorno 3, 7 e 14 del veicolo o VSLtrattamento (per la logica, vedere la sezione sulla gastrica induzione ulcera e VSLtrattamenti). Un totale di 18 animali sono stati utilizzati per ogni punto di tempo ( N
= 6 per ogni prova punto /ora) e lo studio è stato fatto in triplice copia. Per studiare l'effetto di anti-fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) sulla guarigione delle ulcere gastriche, anticorpi neutralizzanti contro VEGF sono stati utilizzati. In questo esperimento, sono stati utilizzati quattro gruppi. Dopo l'induzione ulcera, un gruppo di controllo è stato trattato con solo veicolo. I gruppi di trattamento inclusi ratti trattati con anticorpi neutralizzanti il ​​VEGF da solo, i topi che hanno ricevuto alte dosi VSL(1.2 × 1010 batteri /animale /giorno) insieme con un anticorpo IgG di controllo e ratti che hanno ricevuto alte dosi VSL(1.2 × 1010 batteri /animale /giorno) insieme ad anticorpi neutralizzanti VEGF. I gruppi di anticorpi trattati (IgG e anticorpi neutralizzanti il ​​VEGF) sono stati dati gli anticorpi alla dose di 10 mg /kg di peso corporeo (per logica, vedere la sezione sulla VEGF neutralizzanti trattamento anticorpale). Gli animali sono stati sacrificati per dislocazione cervicale il giorno 3, 7 e 14 dopo il trattamento anti-VEGF. Un totale di 24 animali sono stati utilizzati per ogni punto di tempo (n = 6 per ogni prova /punto di tempo).

ulcera gastrica induzione e VSLtrattamento

ulcere gastriche cronica sono stati indotta sperimentalmente in ratti come precedentemente descritto [17]. Sotto anestesia con pentobarbitone (35 mg /kg di peso corporeo, per via intraperitoneale), l'addome è stato aperto da incisione mediana. Un tubo di plastica di 6 mm, aperto ad entrambe le estremità è stato applicato saldamente alla superficie sierosa parete anteriore dello stomaco appena prossimale antrale zona ghiandola. Sulla superficie dello stomaco, 60 ml di acido acetico 40% è stata versata attraverso un tubo per 90 secondi. Questo prodotto necrosi immediato dell'intero mucosa e sottomucosa all'interno dell'area in cui è stato applicato l'acido acetico. L'acido acetico che rimane sulla superficie è stata poi asciugati con carta da filtro sterile e l'addome aperto è stata chiusa. Abbiamo precedentemente dimostrato che questa procedura produce ulcere istologicamente ben caratterizzati entro 3 giorni dopo l'esposizione acido acetico e guarisce completamente entro 3 settimane senza perforazione o penetrazione agli organi circostanti [3] - [4].

Trattamento di VSLa bassa (6 × 10 ^{9 batteri) e alti dosaggi (1,2 × 10 10 batteri) è stato sulla base dei risultati di studi preliminari utilizzando cinque diversi dosaggi di VSL(1.5 × 10 9, 3 × 10 9, 6 × 10 9, 1.2 × 10 10 e 2,4 × 10 10 batteri /animale /giorno, rispettivamente). VSLdosi da 1,5 × 10 9 e 3 × 10 9 batteri /animale /giorno non sono state trovate efficace nel promuovere la cicatrizzazione dell'ulcera gastrica mentre l'effetto della dose di 2,4 × 10 10, batteri /animale /giorno in cicatrizzazione dell'ulcera gastrica non era significativamente diversa da quella di 1,2 × 10 10 batteri /animale /giorno (Figura S1). Il trattamento con VSLè stato iniziato quando le ulcere sono stati completamente sviluppati al 3 ° giorno dopo la somministrazione di acido acetico; questo è stato considerato come il giorno 1 di trattamento per i successivi 14 giorni. Il pH delle diverse concentrazioni di VSLera 7,0. Gli animali sono stati sacrificati il ​​giorno 3, 7 e 14 dopo VSLtrattamento. L'area ulcerata e non ulcerata da ciascun animale è stato risciacquato con PBS ghiacciato posti su ghiaccio e tre sezioni sono state raccolte. Due sezioni erano snap-congelati in azoto liquido e conservati a -70 ° C per l'isolamento di RNA e la preparazione di proteine. terza sezione trasversale è stato immediatamente fissato nel 10% formalina tamponata neutra per l'analisi istologica.}

La valutazione della dimensione dell'ulcera, la percentuale di guarigione e l'esame istologico

L'area dell'ulcera e la percentuale guarigione dell'ulcera totale in tempi diversi inviare i trattamenti sono stati valutati in ratti stomaco tagliando lungo la grande curvatura e l'ulcera (mm ^{2) area misurata. Due diversi individui misurati l'area dell'ulcera in cieco. La guarigione percentuale è stata calcolata come:}

studi istologici sono stati eseguiti secondo il metodo descritto in precedenza [18]. Brevemente, il cratere ulcera di ogni stomaco è stato sezionato fuori e fissato notte in 10% formalina tamponata neutra, quindi disidratato gradualmente in etanolo ed inclusi in paraffina, utilizzando neoclear come solvente intermedio. Sezioni di 6 micron sono stati ottenuti in un microtomo automatico. sezioni ulcerate sono state colorate con ematossilina e eosina (H & E) per la valutazione istologica durante la guarigione. Microscopicamente, H & tessuti E sono stati segnalati a mostrare: un aspetto normale, infiltrati lievi di cellule infiammatorie nella mucosa lamina propria, sia con nessuna o solo l'erosione superficiale, o profonda erosione e ulcere

quantitativa in tempo reale. PCR analisi

quantitativa in tempo reale analisi PCR è stata effettuata per valutare i cambiamenti nell'espressione dei geni che codificano per mucina secretoria (MUC5AC), cicloossigenasi-2 (COX-2), pro-infiammatorie (TNF-α e IL- 1β) e normativo (IL-10 e TGF-β) citochine e vascular endothelial growth factor (VEGF), fattore di crescita trasformante-β (TGF-β) e fattore di crescita epidermico (EGF). RNA totale è stato estratto dal tessuto ulcerata e non ulcerata con Trizol reagente (Invitrogen). La resa e la purezza del RNA è stata determinata mediante analisi spettroscopica. 2 mg di RNA è stato trascritto inversa utilizzando M-MLV trascrittasi inversa (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. Un ml di cDNA è stato utilizzato per real-time PCR (Corbett Research). primer tempo reale utilizzati con la temperatura di ricottura specifico sono mostrati in Tabella 1. Le amplificazioni sono state effettuate con kit Quantitect SYBR Green PCR di Qiagen in base alle seguenti condizioni di ciclo: 94 ° C mantenuta per 15 minuti, seguiti da 40 cicli di denaturazione a 94 ° C per 20 s, annealing a temperature per 30 s e estensione corrispondente a 72 ° C per 30 s. La specificità di amplificazione è stata verificata da analisi della curva di fusione. L'espressione di mRNA del gene diversa è stata normalizzata contro GAPDH, e piega il cambiamento per il controllo è stato determinato in base al metodo DDCT [19].

livelli proteici di VEGF, TGFβ e EGF in tessuto omogenato gastrico

tessuti gastrici sono stati omogeneizzati in tampone fosfato freddo salina (PBS, pH 7,4) usando un omogeneizzatore Polytron. Il tessuto omogenato è stato poi centrifugato a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C per ottenere le concentrazioni surnatante e proteine ​​chiare misurati utilizzando un BCA (acido bicinconinico) kit. I livelli proteici di VEGF, TGF-β e EGF in tessuti gastrici omogeneizzati sia dalla mucosa ulcerata e non ulcerata sono stati misurati utilizzando kit ELISA secondo il protocollo del produttore (ratto VEGF ELISA Kit, Ray Biotech; kit di ratto TGF-β, eBioscience e ratto kit ELISA EGF, Uscn life Science Inc.). livello di VEGF, TGF-β e FEG è stato espresso in pg /mg di tessuto.

L'effetto di anticorpi neutralizzanti anti-VEGF sulla guarigione delle ulcere gastriche indotte da VSL

Per valutare l'effetto di neutralizzanti anti-VEGF anticorpi sulla cicatrizzazione dell'ulcera gastrica promosso da VSL, quattro gruppi di animali sono stati utilizzati in particolare, il controllo, anticorpi neutralizzanti il ​​VEGF (R & sistemi di D), VSL # dose di 3 alta + IgG (anticorpi isoforma, R & D sistemi), e VSLad alto dosaggio + anticorpi neutralizzanti il ​​VEGF (R & sistemi D). In esperimenti preliminari, tre dosi di anticorpi neutralizzanti VEGF (5, 10 e 20 ug /animale /giorno; ip) sono stati testati in animali trattati con un alto dosaggio di VSLper 14 giorni consecutivi e un dosaggio di 10 mg /animale /giorno è stato trovato per ridurre significativamente la guarigione ed è stato selezionato per l'uso per tutti gli esperimenti successivi. Gli animali sono stati sacrificati il ​​giorno 3, 7 e 14 giorni dopo il VSL+ trattamento anticorpale. zona Ulcera gastrica è stata misurata e l'esame istologico, in tempo reale l'analisi PCR quantitativa e l'analisi delle proteine ​​basato ELISA è stata eseguita come descritto sopra.

Analisi statistica

I risultati sono espressi come media ± SEM. differenze significatività tra il controllo e la VSLgruppi trattati sono stati determinati usando test di Kruskal-Wallis con Dunns post-test per confrontare gruppi specifici. La scelta di un test non parametrico (test di Kruskal-Wallis) invece di un test parametrico (analisi della varianza, ANOVA) era basata sul fatto che almeno uno dei gruppi in tutte tranne tre confronti era non-Gaussiano. Per mantenere la coerenza, test di Kruskal-Wallis è stato utilizzato per tutti i confronti. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software grafico Pad Instat. A P valore
di > 0.05 è stato considerato significativo

Risultati

VSLmiscela di probiotici accelera la guarigione dell'ulcera gastrica

Dopo l'applicazione sierosa di acido acetico. acido 100% degli animali sviluppa ulcere gastriche dopo 3 giorni. Da allora in poi, le ulcere gastriche progressivamente guariti fino al giorno 14 (Fig. 1 bis). Per determinare se il probiotico VSLmiscela potrebbe accelerare la guarigione dell'ulcera gastrica, gli animali sono stati trattati con dosi basse o alte di VSLa partire dal giorno 3, quando le ulcere sono stati pienamente sviluppati per i prossimi 14 giorni consecutivi. Come mostrato in Figura 1 a /b, guarigione dell'ulcera il giorno 3 di trattamento non era significativo in entrambi i gruppi trattati controllo o VSL. Successivamente, c'è stato un aumento progredito in guarigione dell'ulcera riflessa da una diminuzione della superficie dell'ulcera il giorno 7 in animali trattati con una bassa (p = 0,07) o alta (p = 0.003) dosaggi di VSLrispetto ai controlli non trattati ( Fig. 1a). In particolare, VSLad alti dosaggi per 14 giorni ha determinato una guarigione dell'ulcera completo in circa il 50% degli animali (Fig. 1 a), senza alcun segno di mucosa ulcerata. Nelle restanti animali non è stato significativo restauro dell'epitelio superficiale ed estesa la rigenerazione dei tessuti (Fig. 1b). Mentre VSLha conferito aumento significativo della guarigione delle ulcere, il trattamento ad alto dosaggio (% di guarigione è stato del 57% e del 84% il giorno 7 e 14, rispettivamente) sovraperformato in modo significativo i trattamenti a basso dosaggio (% di guarigione è stata del 30% e del 57% il giorno 7 e 14 rispettivamente; Fig. 1a). Dal momento che, il giorno 3 del trattamento non ha mostrato differenze significative nella guarigione dell'ulcera per il controllo e la VSLgruppi trattati, tutti i risultati nelle sezioni successive sono indicati per i giorni 7 e 14 del trattamento.

VSLil trattamento promuove riparazione dei tessuti a livello della mucosa gastrica ulcerata

H & e colorazione rivelato diversi segni istologici di guarigione tra i diversi gruppi. Il giorno 14, simile al nostro risultato lordo nel misurazione dell'area dell'ulcera, ratti di controllo hanno mostrato riparazione minima. Ci sono stati ridotti essudati infiammatori, in minima parte della rigenerazione della mucosa con dimensioni ridotte del cratere dell'ulcera. Non abbiamo osservato molto organizzazione ghiandolare in ratti di controllo (Fig. 2a). Tuttavia, negli animali trattati con alte dosi VSLche mostravano massima guarigione nella riduzione delle dimensioni dell'area dell'ulcera, c'era restauro dell'epitelio mucosale (riepitelizzazione) e poche cellule infiammatorie. Come mostrato in figura 2c, sono stati organizzati ghiandole secretorie. La valutazione dei tessuti ulcerate in VSLbasso dosaggio gruppo trattato ha mostrato qualche ritocco superficiale con essudati infiammatori modesti e in completa riepitelizzazione della mucosa. organizzazione corretta delle ghiandole è stato visto anche in alcuni luoghi (Fig. 2b).

Effetto della VSLtrattamento sulla MUC5AC, COX-1/2 e geni di citochine pro-infiammatorie e normativo espressione

lo strato di muco è il primo strato di difesa della mucosa gastrica [20] che svolge un importante ruolo protettivo contro acido e pepsina nello stomaco. Dal momento che MUC5AC è la mucina più abbondantemente espressa nel normale mucosa gastrica, determiniamo se il VSLtrattamenti colpiti espressione genica MUC5AC nel ulcerata e /o tessuti non ulcerata. Come mostrato nella Tabella 2, anche se l'espressione MUC5AC stata modestamente aumentata in VSLanimali trattati, non era significativamente differente tra i gruppi esaminati. Le prostaglandine sono l'altro importante fattore difensivo critico per il mantenimento dell'integrità della mucosa gastrica, la cui sintesi è regolata dalla enzima limitante-cicloossigenasi (COX), che esiste in due isoforme-COX-1 e COX-2 [21]. Costitutivamente espresso COX-1 è stato trovato anche che rimanga immutata nei tessuti ulcerate e non ulcerata, mentre l'espressione di COX-2 era significativamente più alta nel VSL # dose di 3 alta gruppo trattato il giorno 7, ma non il giorno 14 (tabella 2) .

il citochine pro-infiammatorie TNF-α e iL-1β hanno dimostrato di giocare un ruolo importante nella patogenesi dell'ulcera gastrica avviando un processo infiammatorio precoce [22], mentre la citochina iL-10 è noto per attenuare la produzione di TNF-α [23]. L'espressione di entrambi TNF-α e geni IL-1b è risultato essere elevati nei tessuti ulcerati nei tre gruppi di animali. Tuttavia, VSLtrattamento non influenzava l'espressione di IL-1β e IL-10 e marginalmente diminuito l'espressione di TNF-α nel tessuto ulcerata rispetto al trattamento veicolo (Tabella 2).

VSL trattamentostimola la produzione di fattori di crescita

il ruolo dei fattori di crescita VEGF, TGF-β e EGF nell'angiogenesi e la migrazione delle cellule epiteliali e la proliferazione di cicatrizzazione dell'ulcera gastrica è ben documentato [24], [25]. Come mostrato in figura 3, c'è stato un significativo aumento VEGF (P < 0,001) espressione genica nei tessuti ulcerati il ​​giorno 7 negli animali trattati con basse o alte dosi di VSLrispetto agli animali trattati con solo veicolo (97 e 332 volte maggiore espressione genica in VLSratti basse e alte dosi trattati, rispettivamente). L'aumento dell'espressione genica VEGF era evidente anche al giorno 14 ed era più prominente a basso dosaggio VSLratti trattati (Fig. 3, in alto). espressione di VEGF non è stato alterato nei tessuti non ulcerata di tutti i gruppi esaminati. contenuto proteico VEGF nel tessuto omogenato gastrica confermato i risultati dei dati di espressione genica VEGF (Fig. 4, in alto). Allo stesso modo, TGF-β e EGF (Fig. 3 medio e pannelli in basso) i livelli di geni e proteine ​​(Fig. 4 centrale e pannelli inferiori) sono risultati significativamente aumentati nel VSLanimali trattati, anche se la variazione è stata meno pronunciata di quella osservata per il VEGF .

VEGF anticorpi neutralizzanti attenua VSL-mediata guarigione dell'ulcera gastrica

in base ai dati in figura 3 dove VEGF è risultata significativamente aumentata in risposta a VSLtrattamento che esaltate cicatrizzazione dell'ulcera gastrica ( Fig. 1), abbiamo ipotizzato che VSLeffetto protettivo e il meccanismo di azione era dipendente da VEGF. Per indagare su questo, gli animali sono stati trattati con alte dosi di VSL+ anticorpi neutralizzanti il ​​VEGF. Come mostrato in figura 5, gli animali trattati con l'anticorpo VEGF neutralizzanti diminuite guarigione dell'ulcera del 34% e 41%, rispettivamente, nei giorni 7 e 14 rispetto agli animali trattati con alte dosi VSL+ IgG o controllo del veicolo (Fig. 5a). Patologia macroscopica (Fig. 5b) ha dimostrato che l'architettura della mucosa è stata meno intatta nel VSL+ VEGF anticorpi neutralizzanti ratti trattati di VSL+ IgG trattati ratti nei giorni 7 e 14 del trattamento. Gli animali trattati con l'anticorpo neutralizzante VEGF solo hanno mostrato riduzione della guarigione dell'ulcera rispetto agli animali di controllo, tuttavia, i risultati non erano statisticamente significative (Fig 5a).

Discussione

Questo è il primo studio completo per dimostrare che il probiotico miscela VSLpuò aumentare guarigione delle acido acetico ulcere gastriche indotte. I nostri risultati hanno mostrato che VSLha agito in modo dose-dipendente per aumentare l'espressione e la produzione di VEGF, un fattore di crescita noto per promuovere l'angiogenesi e la guarigione. VEGF è stato di fondamentale importanza nella guarigione delle ulcere gastriche come il trattamento con l'anticorpo neutralizzante VEGF significativamente ritardato il processo di guarigione in VSLanimali trattati.

Il ruolo preventivo e terapeutico dei probiotici è ben segnalato, non solo in caso di colite ulcerosa e malattia di Crohn [8] - [9], ma anche in condizioni diversi come ferite bruciate e colpi di pistola [26] - [27]. Tuttavia, vi sono pochi studi per valutare l'impatto del trattamento probiotici nelle ulcere gastriche dovuta principalmente alle condizioni fisiologiche avverse dello stomaco che diminuisce la sopravvivenza e la crescita di microrganismi. Curiosamente, uno studio [28] ha dimostrato che la colonizzazione batterica avviene rapidamente dopo l'induzione ulcera e, in particolare, la colonizzazione di alcuni batteri tra cui Lactobacillus
poteva migliora significativamente la guarigione delle ulcere gastriche. Altri studi hanno dimostrato che i batteri probiotici Lactobacillus
specie, Saccharomyces boulardii
, Escherichia coli ceppo
Nissle 1917 sono efficaci nel prevenire e curare danno gastrico acuta associata con acido acetico [ ,,,0],12], lo stress [13], l'aspirina [29], l'etanolo [30], ibuprofene [31] e l'indometacina [32] indotti ulcere gastriche. Negli esseri umani, prove circostanziali suggeriscono che una regolare assunzione di un Lactobacillus
-contenenti prodotto protegge l'integrità della barriera mucosa gastrica contro l'indometacina [32], mentre altri [15] hanno riportato che l'effetto di utilizzo di batteri probiotici insieme con triplice terapia non è meglio che usare la terapia tripla da solo per il trattamento delle ulcere gastriche. Un recente rapporto [13] suggerisce un nuovo approccio per il trattamento simbiotico in cui un probiotico ( L. Acidophilus
) ed estratto di zenzero sono stati contemporaneamente e individualmente incapsulato /immobilizzato in perline galleggianti alginato significativamente influenzato cicatrizzazione dell'ulcera gastrica nei ratti. Un approccio alternativo è quello di utilizzare la quantità di probiotici multi-deformazione per promuovere la guarigione dell'ulcera come gli studi IBD hanno dimostrato che il multi probiotici deformazione sono più efficaci di probiotici monostrain [33]. I nostri risultati confermano questi risultati utilizzando VSL, una miscela di otto specie batteriche che era molto efficace nel migliorare la migrazione epiteliale e la proliferazione cellulare, l'angiogenesi, e la produzione di tessuti di granulazione che portano a più rapida guarigione delle ulcere gastriche.

Per affrontare i meccanismi per cui VSLaccelerato cicatrizzazione dell'ulcera gastrica che la quantificazione del lume offensivo e /o la promozione di fattori difensivi. Precedenti studi hanno dimostrato che i probiotici esercitano meccanismi diversi, tra cui la stabilizzazione della degranulazione mucosa mastociti [29], l'induzione della produzione sIgA [29], riduzione della apoptosi delle cellule al rapporto di proliferazione cellulare nello stomaco [11], aumentare la resistenza transepiteliale [34 ] e promuovere l'angiogenesi [11] per mediare cicatrizzazione dell'ulcera gastrica. Qui, dimostriamo che VSLha promosso cicatrizzazione dell'ulcera gastrica, migliorando l'espressione di fattori di crescita, soprattutto VEGF da diverse pieghe. VEGF è un fattore angiogenico fondamentale, che stimola la formazione di tessuto di granulazione e nuovi vasi micro tramite l'angiogenesi [24], che a sua volta accelera gastrica e la guarigione dell'ulcera duodenale [35]. Fino ad oggi, c'è solo una relazione [11] che mostrano L. rhamnosus GG
può up-regolazione della proteina VEGF durante la guarigione dell'ulcera. Nei nostri studi, abbiamo scoperto che il giorno 7 del trattamento con alte dosi di VSL, espressione di VEGF è stata aumentata 332 volte rispetto agli animali di controllo. Questo aumento non è stato visto come ben visibile il giorno 14 del trattamento, in primo luogo perché la maggior parte delle ulcere sono stati già guarito da quel momento in ratti VSL-trattati. In confronto, a basso dosaggio VSLanimali trattati hanno continuato a mostrare alta espressione di VEGF in entrambi i giorni 7 e 14 come le ulcere erano ancora guariti. Chiusura di VSL-indotta cicatrizzazione dell'ulcera gastrica trattando gli animali con anti-VEGF anticorpi neutralizzanti confermato che VSLaugmented cicatrizzazione dell'ulcera gastrica attraverso un meccanismo VEGF-mediata. L'osservazione di ridotta guarigione dell'ulcera in animali trattati con VEGF anticorpi neutralizzanti, solo rispetto ai controlli anche sostenere un ruolo per VEGF in spontanea guarigione dell'ulcera gastrica [35]. È importante sottolineare che, anche se VEGF è noto per essere fino regolata da COX-2 deriva PGE _{2 [36], abbiamo riscontrato cambiamenti marginali nel espressione di COX-2 in VSLratti trattati che suggeriscono che VSLVEGF indotta non sono COX-2 mediata.}

Abbiamo anche trovato che il fattori di crescita EGF e TGF-β sono stati significativamente fino regolati nei tessuti ulcerate di VSLratti trattati. TGF-β è noto per influenzare matrice extracellulare che trasforma il processo di ricostituzione delle cellule epiteliali e si spegne, mentre EGF promuove sia la restituzione epiteliale e la proliferazione nel tratto GI [25]. È interessante notare che, VSLè risultata essere efficace solo nella promozione di fattori di crescita e non i fattori difensivi Muc5A e COX2. E 'ancora possibile che VSLpotrebbe influenzare altri fattori difensivi non analizzati nel presente studio. Abbiamo precedentemente dimostrato che il trattamento VSLmigliora colon MUC2 /MUC2 secrezione di mucina nel colon di ratto e nelle cellule epiteliali del colon umano. VSLil trattamento degli animali, inoltre, non ha marcatamente a ridurre l'espressione delle citochine pro-infiammatorie, IL-1b e in misura minore del TNF-α. Entrambe queste citochine svolgono un ruolo critico nella formazione di ulcere gastriche avviando una risposta infiammatoria acuta precoce [22]. Questi risultati confermano un recente rapporto che ha esaminato 13 ceppi probiotici sulla guarigione dell'ulcera gastrica aspirina-indotta [29]. Allo stato attuale, non sappiamo che specie batterica (s) o combinazioni nella miscela probiotico VSLsono responsabili della guarigione delle ulcere gastriche. Studi precedenti hanno suggerito che il multi probiotici deformazione (più precisamente, ceppi multi-genere) sono più efficaci di probiotici mono-deformazione [33]. È anche possibile che VSLmiscela essendo una soluzione neutra (diverse concentrazioni di VSLhanno un pH di 7,0) potrebbe influenzare la guarigione acido gastrico diluendo l'acidità del succo gastrico. Tuttavia, i dati presentati in questo studio non possono dedurre questo fatto, come l'acidità gastrica succo non è stata misurata. Tuttavia, VSLsarebbe avere solo una diluizione di acido e non effetto neutralizzante acido su succo gastrico, se presente. Con ogni probabilità, l'effetto dell'acido diluendo di VSLcontribuirebbe solo un ruolo secondario per la sua forte funzione cytoprotective dimostrato dalla vasta up-regolazione di VEGF. Come VSLè stato somministrato come sospensione cellulare dal vivo, questa formulazione potrebbe avere esercitato i suoi effetti protettivi come microbi vivi, dai loro metaboliti, componenti della parete cellulare e /o contenuto di DNA o di tutto quanto sopra. Non abbiamo effettuato un esperimento per confrontare l'effetto di microbi vivi e inattivati ​​al calore miscela di probiotici per valutare questa domanda, anche se studi precedenti hanno dimostrato che il calore-uccisi o radiazioni batteri probiotici inattivati ​​(in una dose simile a quella di microbi vivi) non è riuscito a promuovere ulcera-guarigione [11], [12]. Inoltre, dato che non abbiamo valutato l'angiogenesi, la deduzione che VSLsta promuovendo cicatrizzazione dell'ulcera gastrica attraverso l'angiogenesi è solo speculato sulla base di VSLcapacità di indurre una robusta up regolazione di VEGF, che è di fondamentale importanza in angiogenesi [35].

in conclusione, i nostri studi dimostrano che VSLmiscela di probiotici è altamente efficace nel aumentando cicatrizzazione dell'ulcera gastrica. L'effetto è dominante ad alte concentrazioni di VSLmiscela e si ottiene meccanicamente stimolando l'espressione e la secrezione di fattori di crescita angiogenici promozione, principalmente VEGF. Questo studio stabilisce la prospettiva di utilizzare VSLmiscela di probiotici terapeuticamente per aumentare cicatrizzazione dell'ulcera gastrica.

Informazioni di supporto
Figura S1.
Effetto del trattamento di diverse concentrazioni di VSLdi acido acetico indotto cicatrizzazione dell'ulcera gastrica nel ratto. [A] L'area dell'ulcera (mm 2) tracciati per gli animali con acido acetico indotta ulcera gastrica il giorno 3, 7 e 14 del trattamento con veicolo (blu scuro), VSL1.5 × 10 9 batteri /animale /giorno (giallo chiaro), VSL3.0 × 10 9 batteri /animale /giorno (giallo scuro), VSL6.0 × 10 9 batteri /animale /giorno (verde chiaro), VSL1.2 × 10 10 batteri /animale /giorno (verde scuro), VSL2.4 × 10 10 batteri /animale /giorno (azzurro). I dati sono rappresentati come media ± SEM da 6 animali al giorno.

• PLoS ONE: In Vivo antiossidante e antiulcera attività di Parkia speciosa etanolica Estratto di foglie di etanolo-indotta ulcera gastrica a ratti
• PLoS ONE: bidirezionale Crosstalk tra stress-indotta ulcera gastrica e depressione in condizioni di stress cronico