PLOS ONE: La mezcla probiótica VSLacelera la cicatrización de la úlcera gástrica mediante la estimulación de crecimiento endotelial vascular Factor

Extracto

Los estudios que evalúan el efecto de los probióticos y el mecanismo de las enfermedades del tracto gastrointestinal (GI) superior incluyendo úlceras gástricas se limitan a pesar del gran trabajo y los resultados prometedores de esta opción terapéutica para otras enfermedades gastrointestinales. En este estudio, hemos investigado los mecanismos por los cuales la mezcla probiótica VSL(una mezcla de ocho bacterias probióticas incluyendo Los lactobacilos
, Las bifidobacterias
y Streptococcus
especies) se cura ácido acético indujo úlcera gástrica en ratas. VSLse administró por vía oral a baja (6 × 10 ^{9 bacterias) o alta (1,2 x 10 10 bacterias) dosificaciones desde el día 3 después de la inducción de la úlcera durante 14 días consecutivos. VSLtratamientos mejorados significativamente curación de la úlcera gástrica en una forma dependiente de la dosis. Para evaluar el mecanismo (s) por el cual VSLejerce sus efectos protectores, cuantificamos la expresión génica de varios citoquinas pro-inflamatorias, la proteína y la expresión de estómago mucina-Muc5ac, citoquinas IL-10 de regulación, COX-2 y varios crecimiento factores. De todos los componentes examinados, única expresión y la proteína producción de VEGF se aumentó 332 veces en el día 7 en los tejidos ulcerados de animales tratados con VSL. Como era de esperar, los animales tratados con el anticuerpo neutralizante de VEGF retrasan significativamente la curación de la úlcera gástrica en VSLanimales tratados. Este es el primer informe para demostrar una alta eficacia de la mezcla probiótica VSLen la mejora de la cicatrización de la úlcera gástrica. eficacia de los probióticos fue eficaz a concentraciones más altas de VSLal aumentar específicamente la expresión y producción de la angiogénesis promoción de los factores de crecimiento, principalmente VEGF}

Visto:. Dharmani P, De Simone C, Chadee K (2013) la mezcla Probiotic VSLacelera la cicatrización de la úlcera gástrica mediante la estimulación Vascular endotelial Growth Factor. PLoS ONE 8 (3): e58671. doi: 10.1371 /journal.pone.0058671

Editor: John Wallace, Universidad de McMaster, Canadá

Recibido: 29 de octubre de 2012; Aceptó 7 de febrero de 2013; Publicado: 6 Marzo 2013

Derechos de Autor © 2013 Dharmani et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto canadiense para la Investigación en Salud (CIHR, KC). PD fue financiado por una Asociación Canadiense de Gastroenterología-Axcan Pharma-CIHR Investigación y Fellowship Award. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:. Los autores tienen el siguiente interés. PD fue financiado por una Asociación Canadiense de Gastroenterología-Axcan Pharma-CIHR Investigación y Fellowship Award. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.

Introducción

cicatrización de la úlcera gástrica es una complicada matriz espontánea, de diferentes mecanismos que funcionan en conjunto para corregir el desequilibrio entre el agresivo (por ejemplo, ácido, pepsina, citoquinas proinflamatorias y Helicobacter pylori
) y factores defensivos (por ejemplo, moco, bicarbonato, el flujo sanguíneo y factores de crecimiento) en el estómago [1]. El proceso consiste en la mitigación de los factores agresivos luminales, llenando de defecto de la mucosa con proliferación y migración de células epiteliales y componente conectivo a fin de reconstruir la arquitectura de la mucosa [2]. Nosotros y otros [3], [4], [5] han demostrado la eficacia y el mecanismo putativo de diferentes drogas y hierbas para mejorar el proceso de curación de la úlcera espontánea en varios vivo y modelos de úlcera gástrica en. Sin embargo, los estudios que evalúan el efecto de los probióticos en las enfermedades del tracto gastrointestinal (GI) superior y en particular sobre la enfermedad de úlcera gástrica se limitan a pesar de la extensa labor y los resultados prometedores de esta opción terapéutica para otras enfermedades gastrointestinales incluyendo la enfermedad inflamatoria intestinal [6], [ ,,,0],7], [8], [9].

los probióticos son microorganismos vivos que, además de el valor nutritivo confieren beneficios para la salud cuando se proporciona en cantidad suficiente. VSLes una preparación probiótica que contiene una mezcla de ocho especies bacterianas, cuatro especies de Los lactobacilos gratis ( acidophilus
, bulgaricus
, casei
, plantarum
), tres especies de Las bifidobacterias gratis ( breve
, infantis
, longum
) y un Streptococcus
especies, que se ha demostrado ser clínicamente efectivo en la prevención de los brotes de la reservoritis refractaria [8] y dar lugar a la remisión de la colitis ulcerosa [9]. Hemos demostrado previamente que VSLo sus productos secretados son potentes secretagogos de mucina colónica in vitro
en las células epiteliales del colon humanos y en estudios de asa de colon en modelos animales [10]. Sin embargo, el impacto del tratamiento probiótico sobre el daño gástrico agudo asociado con úlceras gástricas no está bien explorado. La razón principal es que el intestino proporciona una serie de condiciones fisiológicas adversas como pH ácido, enzimas digestivas, ácidos biliares y el estrés mecánico que atenúa la supervivencia y el crecimiento de los microorganismos probióticos. Sin embargo, el tratamiento con una amplia cantidad de múltiples microorganismos probióticos puede superar esta limitación. Hay algunos informes de bacterias probióticas individuales, incluyendo Lactobacillus rhamnosus
[11], L. gasseri
[12], L. acidophilus
[13] y Bifidobacterium
[14] que confiere protección contra las úlceras gástricas en la promoción de la curación de la úlcera en diferentes y modelos de úlcera in vivo. Sin embargo, los estudios sobre el efecto de las bacterias probióticas en la mejora de H. pylori
erradicación eran inconsistentes en sus conclusiones [14], [15]. Un estudio reciente ha demostrado que la suplementación adecuada con la mezcla de 8 cepas de probióticos podría erradicar H. pylori
[16]. En la actualidad, todavía no se sabe si las bacterias probióticas mixtos son más eficaces que las cepas individuales en la promoción de curación de la úlcera. En el presente estudio, hemos investigado los mecanismos celulares mediante el cual VSLmezcla de probióticos aumenta la cicatrización de úlceras gástricas en ratas.

Materiales y Métodos

Animales

Seis semanas de edad ratas Sprague-Dawley que pesaban entre 150 y 200 g (Charles River, St. Constant, Quebec) fueron alojados en jaulas de 2 por grupo a una temperatura ambiente constante, con 12 horas de luz y oscuridad ciclos, y se alimenta de roedores dieta estándar y agua ad libitum
. Después de un período de aclimatación de 7 días, las ratas se distribuyeron aleatoriamente en grupos experimentales y de control para la inducción de la úlcera gástrica. El Comité de Ética Animal Experimental de la Universidad de Calgary aprobó este estudio.

Experimental diseño em

Para estudiar el efecto de VSLmezcla de probióticos en la cicatrización de la úlcera gástrica y la mitigación de los factores luminales ofensivos (pro citoquinas-inflamatorio) y la promoción de los factores citoprotectores defensivas (citoquinas reguladoras, mucina y factores de crecimiento), las ratas se dividieron en tres grupos experimentales. Controles animales fueron tratados con vehículo después de la inducción de la úlcera y otros dos grupos que recibieron ya sea bajo (6 x 109 bacterias /animal /día) o alto (1,2 × 1010 bacterias /animal /día) dosis VSL. Los animales fueron sacrificados en el día 3, 7 y 14 del tratamiento con vehículo o VSL(por lógica, véase la sección sobre la inducción de úlcera gástrica y VSLtratamientos). Un total de 18 animales fueron utilizados para cada punto de tiempo ( N
= 6 para cada uno /punto de tiempo de ensayo) y el estudio se realizó por triplicado. Para investigar el efecto del factor de crecimiento endotelial anti-vascular (VEGF) en la curación de la úlcera gástrica, anticuerpos neutralizantes contra VEGF se utilizaron. En este experimento, se utilizaron cuatro grupos. Después de la inducción de la úlcera, un grupo de control fue tratado sólo con vehículo. Los grupos de tratamiento incluyen las ratas tratadas con el anticuerpo neutralizante de VEGF por sí solo, las ratas que recibieron dosis alta VSL(1,2 × 1010 bacterias /animal /día) junto con un anticuerpo IgG de control y las ratas que recibieron dosis alta VSL(1,2 × 1010 bacterias /animal /día) junto con los anticuerpos neutralizantes de VEGF. Los grupos tratados con anticuerpos (IgG y la neutralización de anticuerpos VEGF) recibieron anticuerpos a una dosis de 10 mg /kg BW (por razón de ser, véase la sección sobre el tratamiento con anticuerpos VEGF neutralizante). Los animales se sacrificaron por dislocación cervical en el día 3, 7 y 14 después del tratamiento anti-VEGF. Un total de 24 animales fueron utilizados para cada punto de tiempo (n = 6 para cada uno /punto de tiempo de ensayo).

Úlcera gástrica Inducción y VSLtratamiento

úlceras gástricas crónicas fueron inducidos experimentalmente en ratas como se describió previamente [17]. Bajo anestesia con pentobarbital (35 mg /kg de peso corporal, por vía intraperitoneal), se abrió el abdomen mediante una incisión en la línea media. Un tubo de plástico de 6 mm, abierto en ambos extremos se aplicó firmemente a la superficie serosa de la pared anterior del estómago justo proximal a antral área de la glándula. Sobre la superficie de estómago, de 60 l de ácido acético 40% se vertieron a través de un tubo durante 90 segundos. Esto produjo una necrosis inmediata de toda la mucosa y submucosa dentro del área donde se aplicó el ácido acético. El ácido acético restante en la superficie después se limpió con un papel de filtro estéril y el abdomen abierto se cerró. Hemos demostrado anteriormente que este procedimiento produce úlceras histológicamente bien caracterizados plazo de 3 días después de la exposición al ácido acético y se cura completamente en 3 semanas sin perforación o penetración de los órganos circundantes [3] - [4].

Tratamiento de VSLen baja (6 × 10 ^{9 bacterias) y las dosis altas (1,2 × 10 10 bacterias) se basó en los resultados de los estudios preliminares utilizando cinco dosis diferentes de VSL(1,5 × 10 9, 3 × 10 9, 6 × 10 9, 1.2 × 10 10 y 2.4 × 10 10 bacterias /animal /día, respectivamente). VSLdosis de 1,5 × 10 9 y 3 × 10 9 bacterias /animal /día no se encontraron eficaces para promover la curación de la úlcera gástrica, mientras que el efecto de la dosis de 2,4 x 10 10, bacterias /animal /día en la cicatrización de la úlcera gástrica no fue significativamente diferente de la de 1.2 × 10 10 bacterias /animal /día (Figura S1). El tratamiento con VSLse inició cuando las úlceras estaban completamente desarrollados a los 3 días después de la administración de ácido acético; esto fue considerado como el día 1 de tratamiento para los próximos 14 días. El pH de las diferentes concentraciones de VSLera 7,0. Los animales fueron sacrificados en el día 3, 7 y 14 después del tratamiento con VSL. La zona ulcerada y no ulcerada de cada animal se enjuagó con se recogieron solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo colocado en hielo y tres secciones transversales. Dos secciones transversales fueron instantánea congelada en nitrógeno líquido y se almacenan a -70 ° C para el aislamiento de ARN y preparación de proteína. tercera sección transversal se fijó inmediatamente en formalina al 10% tamponada neutra para el análisis histológico.}

Evaluación del tamaño de la úlcera, el porcentaje de curación y el examen histológico

El área de la úlcera y el porcentaje de úlceras de curación total a diferentes tiempos post los tratamientos se evaluaron en ratas estómago cortando a lo largo de la curvatura mayor y la úlcera (mm ^{2) área medida. Dos individuos diferentes midió el área de la úlcera de una manera ciega. La curación porcentaje se calculó como:}

Los estudios histológicos se realizaron de acuerdo con el método descrito previamente [18]. Brevemente, el cráter de la úlcera de cada estómago se seccionó a cabo y se fija durante la noche en 10% de formalina tamponada neutra, entonces deshidratado gradualmente en etanol e incluidos en parafina, utilizando como disolvente neoclear intermedio. Las secciones de 6 micras, se obtuvieron en un microtomo automatizado. secciones ulcerados se tiñeron con hematoxilina y eosina (H & E) para la evaluación histológica durante la curación. Microscópicamente, H & se informaron los tejidos E como se muestra: una apariencia normal, infiltrados leves de células inflamatorias en la mucosa de la lámina propia, con ninguna o erosión superficial o profunda erosión y ulceración

Cuantitativa en tiempo real. el análisis por PCR

el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real se realizó para evaluar los cambios en la expresión de genes que codifican para la mucina secretora (Muc5ac), la ciclooxigenasa-2 (COX-2), pro-inflamatorias (TNF-α e IL 1β) y regulador (IL-10 y TGF-β) citocinas y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y el factor de crecimiento epidérmico (EGF). ARN total fue extraído de tejido ulcerado y no ulcerada con el reactivo Trizol (Invitrogen). El rendimiento y la pureza del ARN se determinó por análisis espectroscópico. 2 g de ARN se transcribió inversamente mediante el uso de M-MLV transcriptasa inversa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Una l de cDNA se utilizó para la PCR en tiempo real (Corbett Research). cebadores en tiempo real utilizados con la temperatura de hibridación específica se muestran en la Tabla 1. Las amplificaciones se llevaron a cabo con el kit Quantitect SYBR Green PCR de Qiagen utilizando las siguientes condiciones de ciclos: 94 ° C mantenga durante 15 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 20 s, recocido a temperaturas de 30 s y extensión correspondiente a 72 ° C durante 30 s. La especificidad de la amplificación se comprobó mediante análisis de la curva de fusión. La expresión de mRNA de genes diferentes se normalizó en contra GAPDH, y doble cambio a lo largo de control se determinó según el método DDCT [19].

niveles de proteína de VEGF, TGF y EGF en homogeneizado de tejido gástrico

tejidos gástricos se homogeneizaron en fosfato frío tampón de solución salina (PBS, pH 7,4) utilizando un homogeneizador Polytron. A continuación, el homogeneizado de tejido se centrifugó a 20.000 × g durante 20 min a 4 ° C para obtener las concentraciones de sobrenadante y proteína claras medidos usando un BCA (ácido bicinconínico) kit. Los niveles de proteína de VEGF, TGF-β y EGF en los tejidos gástricos homogeneizadas tanto de la mucosa ulcerada no ulcerada y se midieron usando kits de ELISA de acuerdo con el protocolo del fabricante (rata VEGF ELISA Kit, Ray Biotech; kit rata TGF-β, eBioscience y la rata kit ELISA EGF, Uscn Life Science Inc.). nivel de VEGF, TGF-β y EGF se expresó como pg /mg de tejido.

El efecto de anticuerpos neutralizantes anti-VEGF en la cicatrización de la úlcera gástrica inducida por VSL

Para evaluar el efecto de neutralizar anticuerpo anti-VEGF en la cicatrización de la úlcera gástrica promovido por VSL, se utilizaron cuatro grupos de animales a saber, el control, el anticuerpo neutralizante de VEGF (amp I +; D systems), VSLdosis alta + IgG (anticuerpo isoforma, R & D sistemas), y VSLdosis alta de anticuerpos neutralizantes + VEGF (R & D systems). En experimentos preliminares, tres dosis de anticuerpo neutralizante de VEGF (5, 10 y 20 g /animal /día; ip) se ensayaron en los animales que recibieron una alta dosis de VSLdurante 14 días consecutivos y una dosis de 10 mg /animal /día se encontró que reduce significativamente la curación y fue seleccionado para su uso para todos los experimentos posteriores. Los animales fueron sacrificados en el día 3, 7 y 14 días después de VSL+ tratamiento con anticuerpos. área de la úlcera gástrica se midió y el examen histológico, el análisis de PCR cuantitativa en tiempo real y análisis de proteínas basado en ELISA se realizó como se ha descrito anteriormente.

El análisis estadístico

Los resultados se expresan como medias ± SEM. diferencias significativas entre el control y VSLgrupos tratados se determinaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis con el post-test de Dunn para comparar los grupos específicos. La elección de una prueba no paramétrica (prueba de Kruskal-Wallis) en lugar de una prueba paramétrica (análisis de varianza, ANOVA) se basó en el hecho de que al menos uno de los grupos en todo menos en tres de las comparaciones fue no gaussiana. Para mantener la coherencia, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para todas las comparaciones. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad INSTAT. Un P
valor de > 0,05 fue considerado significativo

Resultados

VSLmezcla probiótica acelera la cicatrización de úlceras gástricas

Después de la aplicación de la serosa acético. ácido 100% de los animales desarrolló úlceras gástricas después de 3 días. A partir de entonces, las úlceras gástricas curados progresivamente hasta el día 14 (Fig. 1a). Para determinar si el probiótico mezcla de VSLpodría acelerar la cicatrización de la úlcera gástrica, los animales fueron tratados con dosis bajas o altas de VSLcomenzando en el día 3 cuando las úlceras estaban completamente desarrollados durante los próximos 14 días consecutivos. Como se muestra en la Figura 1 a /b, curación de la úlcera en el día 3 del tratamiento no fue significativa, ya sea en los grupos tratados de control o VSL. Después de esto, hubo un aumento progresado en la cicatrización de la úlcera se refleja en una disminución en el área de la úlcera en el día 7 en los animales tratados con o bien bajo (p = 0,07) o (p = 0,003) dosis altas de VSLen comparación con los controles no tratados ( Fig. 1a). En particular, VSLen altas dosis durante 14 días llevó a una completa curación de la úlcera en ~ 50% de los animales (Fig. 1 a), y no hay indicios de la mucosa ulcerada. En los animales restantes no había restauración significativa de la superficie del epitelio y extensa la regeneración de tejidos (Fig. 1b). Mientras VSLconfirió aumento significativo de la curación de la úlcera, tratamiento de alta dosis (% de curación fue 57% y 84% en el día 7 y 14, respectivamente) superado de tratamientos de baja dosis (% de curación fue 30% y 57% en el día 7 y 14 , respectivamente; Fig. 1a). Puesto que, el día 3 de tratamiento no mostró diferencias significativas en la cicatrización de las úlceras de control y VSLgrupos tratados, se muestran todos los resultados en las secciones posteriores para los días 7 y 14 del tratamiento.

promueve VSLTratamiento reparación de tejidos en la mucosa gástrica ulcerada

H & E tinción reveló diferentes signos histológicos de curación entre los diferentes grupos. En el día 14, similar a nuestro hallazgo bruto en la medición de área de la úlcera, las ratas de control mostraron la reparación mínima. No se redujeron exudado inflamatorio, la extensión mínima de regeneración de la mucosa con el tamaño reducido del cráter de la úlcera. No se observó mucha organización glandular en ratas de control (Fig. 2a). Sin embargo, en los animales tratados con la dosis alta VSLque mostraron máximo de curación en la reducción del tamaño de la superficie de la úlcera, hubo restauración del epitelio de la mucosa (re-epitelización) y pocas células inflamatorias. Como se muestra en la Figura 2c, también se organizaron glándulas secretoras. La evaluación de los tejidos ulcerados en VSLgrupo tratado con una dosis baja mostró un poco de remodelación superficial con exudados inflamatorios modestos y en completa re-epitelización de la mucosa. La adecuada organización de las glándulas también fue visto en algunos sitios (Fig. 2b).

Efecto de VSLen el tratamiento Muc5ac, la expresión de COX-1/2 y de genes de citoquinas pro-inflamatorias y regulatorio

la capa de moco es la primera capa de defensa de la mucosa gástrica [20] que juega un papel protector importante contra el ácido y la pepsina en el estómago. Desde Muc5ac es la mucina más abundantemente expresado en la mucosa gástrica normal, determinamos si VSLtratamientos afectados expresión génica Muc5ac en el ulcerado y /o tejidos no ulcerada. Como se muestra en la Tabla 2, a pesar de que la expresión Muc5ac se aumentó modestamente en VSLanimales tratados, no fue significativamente diferente entre los grupos de prueba. Las prostaglandinas son el otro factor importante defensiva crítico para el mantenimiento de la integridad de la mucosa gástrica, cuya síntesis está regulada por la enzima limitante-ciclooxigenasa (COX), que existe en dos isoformas-COX-1 y COX-2 [21]. Expresada constitutivamente COX-1 también se encontró que era sin cambios en los tejidos ulcerados y no ulcerada, mientras que la expresión de COX-2 fue significativamente mayor en el VSL # grupo tratado 3 dosis alta en el día 7, pero no en el día 14 (Tabla 2) .

las citoquinas pro-inflamatorias TNF-α y la IL-1β se han demostrado que desempeñan un papel importante en la patogénesis de la úlcera gástrica mediante el inicio de un proceso inflamatorio temprana [22], mientras que la citocina reguladora IL-10 es conocido para atenuar la producción de TNF-α [23]. Se encontró que la expresión de tanto TNF-α y genes IL-1ß a ser elevados en los tejidos ulcerados en los tres grupos de animales. Sin embargo, VSL tratamientono afectó la expresión de IL-1β y IL-10 y marginalmente disminuyó la expresión de TNF-α en el tejido ulcerado en comparación con el tratamiento con vehículo (Tabla 2).

VSL tratamientoestimula la producción de factores de crecimiento

el papel de los factores de crecimiento VEGF, TGF-β y EGF en la angiogénesis y la migración de células epiteliales y la proliferación en la curación de la úlcera gástrica está bien documentado [24], [25]. Como se muestra en la Figura 3, se produjo un aumento significativo de VEGF (P < 0,001) la expresión de genes en los tejidos ulcerados en día 7 en los animales tratados con dosis bajas o altas de VSLen comparación con los animales tratados sólo con vehículo (97 y 332 veces de incremento en la expresión génica en VLSratas tratadas dosis bajas y altas, respectivamente). El aumento de la expresión del gen VEGF también fue evidente en el día 14 y fue de lo más destacado en dosis bajas VSLratas tratadas (Fig. 3, arriba). La expresión del VEGF no se alteró en los tejidos, no ulceradas de todos los grupos examinados. contenido de proteína VEGF en el homogeneizado de tejido gástrico se corrobora las conclusiones de los datos de expresión génica de VEGF (Fig. 4, arriba). Del mismo modo, el TGF-β y EGF (Fig. 3 media y paneles inferiores) los niveles de genes y proteínas (Fig. 4 media y paneles inferiores) se incrementaron significativamente en VSLanimales tratados, aunque el cambio era menos pronunciada que la observada para VEGF .

VEGF anticuerpos neutralizantes atenúa VSLmediada por la curación de la úlcera gástrica

a partir de los datos de la Figura 3, donde el VEGF fue significativamente mayor en respuesta a VSLtratamiento que mejoraron la curación de la úlcera gástrica ( La Fig. 1), se especula que VSLefecto protector y mecanismo de acción dependía de VEGF. Para investigar esto, los animales se trataron con anticuerpo neutralizante de alta dosis VSL+ VEGF. Como se muestra en la Figura 5, los animales tratados con el anticuerpo VEGF neutralizante disminuyeron curación de la úlcera por 34% y 41%, respectivamente, en los días 7 y 14 en comparación con los animales tratados con dosis alta VSL+ IgG o control del vehículo (Fig. 5a). patología bruto (Fig. 5b) mostró que la arquitectura de la mucosa fue menos intacta en el VSL # ratas tratadas 3 + VEGF de anticuerpos neutralizantes que VSL+ IgG ratas en los días 7 y 14 del tratamiento a tratar. Los animales tratados con el anticuerpo neutralizante de VEGF solo mostraron una reducción en la cicatrización de las úlceras en comparación con los animales control, sin embargo, los resultados no fueron estadísticamente significativas (figura 5a).

Discusión

Este es el primer estudio exhaustivo para demostrar que el probiótico mezcla VSLpuede aumentar la curación de las úlceras gástricas inducidas de ácido acético. Nuestros resultados mostraron que VSLactuó de manera dependiente de la dosis para aumentar en la expresión y la producción de VEGF, un factor de crecimiento conocido para promover la angiogénesis y la curación. VEGF era críticamente importante en la cicatrización de la úlcera gástrica como el tratamiento con anticuerpo neutralizante VEGF retrasó significativamente el proceso de curación en VSLanimales tratados.

El papel preventivo y terapéutico de los probióticos es bien informado no sólo en el caso de la colitis ulcerosa y la la enfermedad de Crohn [8] - [9], sino también en condiciones tan variadas como las heridas quemadas y heridas de bala [26] - [27]. Sin embargo, hay un número limitado de estudios que evalúan el impacto del tratamiento probióticos en las úlceras gástricas debido principalmente a las condiciones fisiológicas adversas de estómago que disminuye la supervivencia y el crecimiento de microorganismos. Curiosamente, un estudio [28] demostraron que la colonización bacteriana se produce rápidamente después de la inducción de úlceras y, en particular, la colonización de ciertas bacterias incluyendo Lactobacillus
podría mejora significativamente la curación de la úlcera gástrica. Otros estudios han demostrado que las bacterias probióticas Lactobacillus
especies, Saccharomyces boulardii
, Escherichia coli cepa
Nissle 1917 son eficaces en la prevención y el tratamiento del daño gástrico agudo asociado con ácido acético [ ,,,0],12], el estrés [13], la aspirina [29], etanol [30], ibuprofeno [31] y la indometacina [32] úlceras gástricas inducidas. En los seres humanos, la evidencia circunstancial sugiere que la ingestión regular de un Lactobacillus
-Con producto protege la integridad de la barrera de la mucosa gástrica contra la indometacina [32], mientras que otros [15] han informado de que el efecto de la utilización de bacterias probióticas a lo largo con la triple terapia no es mejor que el uso de la triple terapia sola para el tratamiento de las úlceras gástricas. Un informe reciente [13] sugiere un enfoque novedoso para el tratamiento simbiótica donde un probiótico ( l. Acidophilus
) y extracto de jengibre se encapsula simultáneamente y de forma individual /inmovilizada en perlas de alginato flotantes influido significativamente la curación de úlceras gástricas en ratas. Un enfoque alternativo es utilizar diferente cantidad de probióticos múltiples deformación para promover la cicatrización de la úlcera como estudios de EII han demostrado que los probióticos de múltiples cepas son más eficaces que los probióticos monostrain [33]. Nuestros resultados confirman estos resultados usando VSL, una mezcla de ocho especies bacterianas que era muy eficaz en la mejora de la migración epitelial y la proliferación celular, la angiogénesis y la producción de tejidos de granulación que conducen a una curación más rápida de las úlceras gástricas.

Para abordar los mecanismos por los que VSLaceleró la curación de úlceras gástricas que la cuantificación luminal ofensivo y /o la promoción de factores defensivos. Estudios anteriores han demostrado que los probióticos ejercen diversos mecanismos, incluyendo la estabilización de la desgranulación de mastocitos de la mucosa [29], la inducción de la producción de sIgA [29], la reducción de la apoptosis de las células a la proporción de proliferación de células en el estómago [11], aumentar la resistencia transepitelial [34 ] y la promoción de la angiogénesis [11] para mediar en la curación de la úlcera gástrica. Aquí, mostramos que VSLpromueve la curación de úlceras gástricas mediante la mejora de la expresión de factores de crecimiento, principalmente VEGF por varios pliegues. VEGF es un factor angiogénico fundamental, que estimula la formación de tejido de granulación y nuevos vasos a través de micro angiogénesis [24] que a su vez acelera gástrica y duodenal cicatrización de la úlcera [35]. Hasta la fecha, sólo hay un informe [11] que muestran L. rhamnosus GG puede
hasta de regular la proteína VEGF durante la cicatrización de la úlcera. En nuestros estudios, se encontró que en el día 7 de tratamiento con dosis alta VSL, la expresión del VEGF se aumentó 332 veces en comparación con los animales control. Este aumento no fue visto como un lugar destacado en el día 14 del tratamiento, principalmente debido a que la mayoría de las úlceras ya se curó en ese momento en las ratas tratadas VSL. En comparación, dosis bajas de VSLanimales tratados continuaron mostrando una alta expresión de VEGF en ambos días 7 y 14 como las úlceras estaban siendo curados. Terminación de VSLinducido por cicatrización de la úlcera gástrica mediante el tratamiento de los animales con anticuerpos anti-VEGF anticuerpos neutralizantes confirmó que VSLaumentada cicatrización de la úlcera gástrica a través de un mecanismo mediado por VEGF. La observación de la reducción de la curación de úlceras en los animales tratados con VEGF anticuerpo neutralizante solo en comparación con los controles también apoyan el papel de VEGF en espontánea curación de la úlcera gástrica [35]. Es importante destacar que, a pesar de que el VEGF es conocido por ser de hasta reguladas por la COX-2 derivado de PGE _{2 [36], encontramos cambios marginales en la expresión de COX-2 en VSLratas tratadas que sugieren que la expresión de VEGF inducida VSLno se COX-2 mediada.}

también encontramos que los factores de crecimiento EGF y TGF-β fueron significativamente hasta reguladas en los tejidos ulcerados de VSLratas tratadas. TGF-β se sabe que afectan a la matriz extracelular que se convierte el proceso de reconstitución de las células epiteliales y fuera, mientras que EGF promueve tanto la restitución epitelial y la proliferación en el tracto GI [25]. Curiosamente, se encontró VSLpara ser eficaz en la promoción de factores de crecimiento y no los factores defensivos Muc5A y Cox2. Todavía es posible que VSLpodría afectar a otros factores defensivos no analizados en el presente estudio. Hemos demostrado previamente que el tratamiento con VSLmejora la secreción de mucina colónica Muc2 /MUC2 en colon de rata y en las células epiteliales del colon humano. VSLen el tratamiento de los animales también no redujo significativamente la expresión de las citoquinas pro-inflamatorias, IL-1 y, en menor medida TNF-α. Ambas de estas citoquinas juegan un papel crítico en la formación de úlceras gástricas mediante el inicio de una respuesta inflamatoria aguda temprana [22]. Estos resultados corroboran un informe reciente que evaluó 13 cepas probióticas en inducida por aspirina cicatrización de la úlcera gástrica [29]. En la actualidad, no sabemos cuales especie bacteriana (s) o combinaciones en la mezcla probiótica VSLson responsables de la cicatrización de la úlcera gástrica. Estudios anteriores han sugerido que los probióticos múltiples de deformación (más específicamente, las cepas de múltiples género) son más eficaces que los probióticos mono-deformación [33]. También es posible que VSLmezcla de ser una solución neutra (diferentes concentraciones de VSLtienen un pH de 7,0) podría afectar la curación de ácido gástrico mediante la dilución de la acidez del jugo gástrico. Sin embargo, los datos presentados en este estudio no pueden deducir de este hecho, como la acidez jugo gástrico no se midió. Sin embargo, VSL, sólo sería tener una dilución ácida y no efecto neutralizante ácido en el jugo gástrico, en su caso. Con toda probabilidad, el efecto de diluir el ácido de VSLsólo contribuiría un papel secundario a su fuerte función citoprotectora demostrado por una extensa regulación de VEGF. Como VSLse administró como una suspensión de células vivas, esta formulación podría haber ejercido sus efectos protectores como microbios vivos, por sus metabolitos, componentes de la pared celular y /o el contenido de ADN o todo lo anterior. No hemos realizado un experimento para comparar el efecto de microbios vivos y inactivado por calor mezcla de probióticos para evaluar esta cuestión a pesar de que estudios anteriores han demostrado que los muertos por calor o radiación bacterias probióticas inactivadas (en una dosis similar a la de microbios vivos) no pudo promover la curación de las úlceras [11], [12]. Además, ya que no se evaluó la angiogénesis, la inferencia de que VSLes la promoción de la curación de la úlcera gástrica a través de la angiogénesis sólo se especula sobre la base de VSLcapacidad de inducir una robusta hasta la regulación de VEGF, que es críticamente importante en la angiogénesis [35].

en conclusión, nuestros estudios demuestran que VSLmezcla de probióticos es muy eficaz en el aumento de la curación de la úlcera gástrica. El efecto es dominante a altas concentraciones de VSLde la mezcla y se consigue de manera mecánica mediante la estimulación de la expresión y secreción de la angiogénesis promoción de los factores de crecimiento, principalmente VEGF. Este estudio establece la posibilidad de utilizar VSLmezcla probiótica terapéuticamente para aumentar la cicatrización de la úlcera gástrica.

Apoyo a la Información
Figura S1.
Efecto del tratamiento de diferentes concentraciones de VSLen ácido acético induce cicatrización de la úlcera gástrica en ratas. [A] El área de la úlcera (mm 2) trazada para los animales con ácido acético inducida úlcera gástrica en el día 3, 7 y 14 del tratamiento con vehículo (azul oscuro), VSL1,5 × 10 9 bacterias /animal /día (luz amarilla), VSL3,0 x 10 9 bacterias /animal /día (amarillo oscuro), VSL6,0 × 10 9 bacterias /animal /día (verde claro), VSL1.2 × 10 10 bacterias /animal /día (verde oscuro), VSL2,4 × 10 10 bacterias /animal /día (azul claro). Los datos se representan como medias ± SEM de 6 animales por día.

• PLOS ONE: antioxidante in vivo y la actividad antiulcerosa de Parkia speciosa hoja etanólico Extracto contra inducidas por etanol úlcera gástrica en ratas
• PLOS ONE: bidireccional Diafonía entre el estrés inducido por la úlcera gástrica y la depresión bajo estrés crónico