PLOS ONE: Soro Apolipoproteínas CI e C-III são reduzidos em pacientes com câncer de estômago: resultados de MALDI-Based peptidoma e imuno-Based Clinical Assays

Abstract

Encontrar novos biomarcadores peptídicos de câncer de estômago em soros humanos que pode ser implementado em um método de previsão clinicamente viável para o monitoramento de câncer de estômago. Estudou-se a peptidoma soro de dois Biorepositórios diferentes. Em primeiro lugar, empregue uma abordagem de cromatografia líquida de fase reversa C8-para a purificação da amostra, seguido por análise de espectrometria de massa. Estes foram aplicados em amostras de soro de controles livres de câncer e pacientes com câncer de estômago em vários estágios clínicos. Criamos, então, um gasoduto análise bioinformática e identificou assinatura peptídeo discriminar pacientes de adenocarcinoma de estômago de controles sem câncer. Matrix Assisted Laser Dessorção /Ionização-Time of Flight (MALDI-TOF) os resultados de 103 amostras revelaram 9 peptídeos de assinatura; com precisão da previsão de 89% no conjunto de treinamento e 88% no conjunto de validação. Três dos péptidos que discriminam foram descobertos fragmentos das apolipoproteínas C-I e C-III (apoC-I e C-III); quantificou ainda mais os seus níveis no soro, bem como CA19-9 e PCR, empregando ensaios clínicos comercial-quantitativos em 142 amostras. Resultados quantitativos ApoC-I e apoC-III correlacionados com os resultados MS. Nós então utilizado apoB-100-normalizou os níveis de PCR apoC-I e apoC-III, CA19-9 e gerar regras estabelecidas para a previsão do câncer de estômago. Para o treinamento, foram utilizados soros de um repositório, e para a validação, foram utilizados soros a partir do segundo repositório. precisões de previsão de 88,4% e 74,4% foram obtidos nos conjuntos de treinamento e validação, respectivamente. Os níveis séricos de apoC-I e apoC-III combinado com outros parâmetros clínicos pode servir de base para a formulação de uma pontuação de diagnóstico para pacientes com câncer de estômago

Citation:. Cohen M, Yossef R, Erez T, Kugel Um, H Welt, Karpasas MM, et al. (2011) Serum Apolipoproteínas C-I e C-III são reduzidos em pacientes com câncer de estômago: Resultados de MALDI-Based peptidoma e Ensaios Clínicos Baseados em Immuno. PLoS ONE 6 (1): e14540. doi: 10.1371 /journal.pone.0014540

editor: Hana algul, Technische Universität München, Alemanha |

Recebido: 01 de julho de 2010; Aceito: 22 November, 2010; Publicação: 18 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Cohen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida pela Comunidade Europeia (FP6 GLYFDIS 037.661). RNTech SAS France é indicado como financiador, devido ao fato de que JT e HB são /eram empregados da empresa; as contribuições de JT e HB são definidos como A aprovação final da versão a ser publicada, e eles não estavam envolvidos na contribuição para a concepção e desenho, ou aquisição de dados ou análise e interpretação dos dados ou da elaboração do manuscrito. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O fato de que dois funcionários antigos ou atuais de RNTech SAS França são autores deste manuscrito não altera a adesão a todos os PLoS ONE políticas sobre a partilha de dados e materiais, conforme detalhado no guia on-line para os autores.

Introdução

as taxas de mortalidade de muitos cânceres não mudaram dramaticamente no últimos 20 anos [1]. A detecção precoce foi mostrado para melhorar grandemente a eficácia do tratamento do cancro, ainda detecção é muitas vezes apenas possível após o aparecimento dos primeiros sintomas clínicos, que ocorre em alguns cancros tarde demais para uma intervenção bem sucedida. Isto é principalmente devido à ausência de testes específicos e sensíveis que permitem rastreio precoce e acompanhamento de estados cancerosos. Portanto, a descoberta de novos biomarcadores tumorais é cada vez mais considerada essencial para melhorar o tratamento do cancro. Na última década, muitos estudos têm-se centrado na descoberta de biomarcadores. Uma das fontes mais promissores para a descoberta de biomarcadores é o sangue humano, em particular soro e plasma, o que pode reflectir diversos eventos no corpo, em tempo real. No entanto, apesar imensos esforços, apenas um número muito pequeno de proteínas plasmáticas foram provados têm valor de diagnóstico [2] - [5]. Frequentemente, estes biomarcadores não ficar sozinho e são acompanhados por outros testes de monitorização e diagnóstico. A maioria deles não são específicos e sensíveis o suficiente para o diagnóstico de ecrã panorâmico [6], [7].

Uma possível fonte de novos biomarcadores de câncer é o peptidoma. A lógica por trás focando peptídeos de soro é baseada na evidência de que a formação e desenvolvimento do câncer envolve mudança no metabolismo de proteínas e peptídeos '', e no aumento da disponibilidade de metodologia de triagem de todo o peptidoma. Em termos de desenvolvimento de cancro, as alterações podem ocorrer na gama de péptidos intra- e extra-celulares representados na peptidoma sangue, que possam ser específicas para a fase cancerosa, e assim têm um potencial de diagnóstico [2], [4], [ ,,,0],5]. Em termos de tecnologia de detecção, avanços recentes na tecnologia MS permitir a detecção de centenas de péptidos a partir de alguns microlitros de soro [8], [9]. De facto, estudos anteriores peptidoma sangue relataram uma variedade de péptidos de assinatura no soro que tinham distinguido saudáveis ​​de pacientes com cancro (revisto em [5]). Isso foi mostrado para próstata, bexiga, da mama e cancro da tiróide por Villanueva et al
[10], [11]. Eles relataram peptídeos 61 de assinatura que poderia distinguir indivíduos saudáveis ​​a partir de 3 tipos diferentes de pacientes com câncer. Apesar de todos estes péptidos e /ou os seus fragmentos são normalmente encontrados no soro, as diferenças na quantidade entre indivíduos saudáveis ​​e afectadas são observados. No entanto, embora estes resultados demonstram o potencial que os perfis peptidoma ter para diagnóstico de câncer, ele ainda continua a ser demonstrado que esta abordagem pode ser estendida para descobrir biomarcadores adequados para o diagnóstico precoce e acompanhamento consistente. Em primeiro lugar, a capacidade destes biomarcadores peptídicos soros para distinguir doentes de controlo foi demonstrado principalmente para pacientes com tumores mais avançados ou metastáticos. Além disso, a robustez desses biomarcadores foi contestada; variáveis ​​não controladas, principalmente atribuída a diferenças no manuseamento das amostras, protocolos de processamento e análise de dados, têm sido mostrados para modificar drasticamente os resultados destes ensaios, [11] - [19]. Colocando grande ênfase na aquisição de amostras, manuseamento, transformação, processamento de sinais MS e as análises estatísticas resultados mais robustos e reprodutíveis podem ser alcançados [18], [20], [21].

Neste trabalho, nós nos concentramos na descoberta de uma série de peptídeos de assinatura que podem ter valor de diagnóstico para o câncer de estômago. A fim de conseguir isso, usamos três diferentes fontes de soro envolvendo pacientes com câncer de estômago em diferentes fases. Um protocolo rigoroso de coleta e processamento de soro foi aplicado [18], utilizando um procedimento coerente de extração de peptídeo e leituras MALDI-TOF, com um pipeline de análise modificada. Juntos, o oleoduto melhorado permitiu a identificação de um péptido padrão que discrimina entre amostras de cancro e de controlo. Estes resultados foram corroborados na soros original e novo por três características identificadas do padrão, apoC-I (duas características) e apoC-III, utilizando ensaios baseados em imuno. Em seguida, empregou níveis séricos de apoC-I e apoC-III combinado com PCR e CA19-9 marcadores para discriminar pacientes de adenocarcinoma de estômago de controles sem câncer.

Materiais e Métodos

colheita de soro e manuseamento

Os soros foram obtidos a partir de duas fontes comerciais. 79 amostras de soros de pacientes com câncer de estômago pré-operação e 33 amostras de soros de controles pareados sem câncer (incluindo 10 pacientes com gastrite) foram recolhidos por RNTech (Paris, França), na Roménia. cancro forma soros e os pacientes não cancerosas foram tomadas após jejum durante a noite, da seguinte maneira: 5 ml de sangue foi tirado para um tubo de soro VACUETTE (CatLj005, Greiner Bio One, Kremsmuenster, Áustria) e deixou-se coagular durante cerca de 30 minutos, após o que o tubo foi centrifugado a 3000 rpm numa centrífuga Hettich EBA 20S (Hettich Ag, Tuttlingen, Alemanha) durante 5 minutos à temperatura ambiente. O soro separado foi dividido em alíquotas em alíquotas de 1 ml em tubos criogénicos estéreis (Nalgene, Rochester, NY, EUA) e imediatamente congelado a (-70) ° C. 22 soros pré-operação cancro do estômago e 21 controlos foram recolhidos por Asterand nos EUA (Detroit, MI, EUA) da seguinte maneira: 10 ml de sangue foi tirado para um Vacutainer SST, mais plástico do tubo BD (gato #BEC 367985, BD , San Jose, CA, EUA). O tubo foi misturado invertendo-o 5 vezes e deixou-se coagular durante cerca de 30 minutos numa posição vertical. Esta etapa foi seguida por uma centrifugação de 1,100-1,300 g durante 10 minutos à temperatura ambiente. O soro separado foi separado em alíquotas para alíquotas de 1 ml em tubos criogênicos estéreis tubos (Nalgene) e imediatamente congelado a (-70) ° C. Para a fonte Asterand, o jejum não foram coletados dados em qualquer um dos exames de sangue em seu banco. As amostras de soro de ambas as empresas foram transportadas em gelo seco e armazenado a (-70) ° C imediatamente após a chegada. As amostras de soro foram descongeladas em gelo durante cerca de uma hora e meia, 50 pi foi aliquotado em tubos lo-bind (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e imediatamente re-congelados a (-70) ° C. Todas as aliquotas das amostras foram armazenadas a (-70) ° C até ao processamento. Uma terceira fonte de soros foram obtidas em nosso laboratório a partir de 12 controles israelenses sem câncer. O sangue foi retirado com a marca tubo usado por RNTech (CatLj005, Greiner Bio One) e manuseio do soro seguido o procedimento de RNTech. Os soros obtidos no nosso laboratório foram retirados de indivíduos não-jejum. Ambas as empresas RNTech e Asterand estabeleceram e realizou suas atividades seguindo os padrões reguladores e éticos, a implementação local, nacional, europeu, as regras internacionais (ONU) e recomendações dos Estados Unidos e particularmente quando aplicável a coleta de material biológico e tratamento e exploração resultado da pesquisa. Isso inclui tanto o consentimento escrito de cada contribuinte paciente para o banco biológica e de dados, e autorização estudo escrito da comissão de ética de cada instituto clínico contribuindo amostras para os bancos das empresas.

processamento de amostras de soro e preparação para MS- MALDI leitura

Cada amostra de soro foi processado em dois ou três repetições (a partir de alíquotas idênticas e em datas separadas aleatórios). Os péptidos foram extraídos em grânulos revestidos com C8, lavou-se, eluiu-se, misturou-se com matriz de CHCA, e depositados na placa alvo de MALDI. Os soros foram processados ​​em repetições e depositado sobre a placa de MALDI em duplicado. Para uma descrição detalhada consulte S1 Arquivo.

A análise dos dados de MALDI resulta

O processamento de dados foi realizada em duas etapas. No primeiro passo, uma matriz de intensidade foi realizada a partir dos ficheiros ASCII matérias de leituras MALDI-TOF de todas as fontes de amostra utilizando soros de re-amostragem, alinhamento e de detecção m /z picos como descrito em Villanueva et ai
[21]. No segundo passo, a aprendizagem máquina foi utilizada para definir um padrão discriminativo que podem ser usados ​​para classificar os doentes. Para este fim, o processo descrito em Villanueva
et al [21] foi modificado tal como descrito abaixo. O gasoduto modificado depende inteiramente de software de fonte aberta e detalhes adicionais estão descritos na seção bioinformática em S1 Arquivo.

(1) A soma de replicação e as etapas de filtragem de recursos foram adicionados a considerar os valores zero como casos especiais. Nossa matriz original continha uma quantidade considerável de valores zero para diferentes funções em diferentes amostras. Devido à limitação geral da tecnologia MALDI, uma fracção significativa destes valores zero poderia representar valores em falta, em vez de zero real intensidades. Para superar esta limitação parcialmente lemos cada amostra em repetições e calculada a intensidade média, ignorando zero de leituras de intensidade. Seguindo esse somatório réplica, a matriz resultou ainda continha uma quantidade substancial de valores de zero. modelos baseados em SVM poderia classificar de acordo com os valores zero que representam valores em falta e não zero real intensidades. Portanto, filtrados características que ainda tinham valores iguais a zero, pelo menos, uma das amostras. Nenhum desses recursos removidos tinha clara preferência dos valores de zero para uma tarefa específica grupo clínico. O sub-matriz resultante foi usado em uma máquina de classificação de aprendizagem.

(2) foi desenvolvida uma nova abordagem para caracterizar parametrização seleção. As definições para análise baseada em SVM foram inicialmente como segue: RNTech estômago vs. controlo RNTech, Asterand estômago vs. controlo Asterand. Mann-Whitney p-valor foi calculado para cada pico, de acordo com os grupos clínicos definidos para a análise. Em seguida, usamos os valores de p Mann-Whitney e intensidades de pico, como cortes para selecionar um subconjunto de recursos (picos) para uso em experiências de aprendizado de máquina. Um corte intensidade não filtrar amostras na qual pelo menos uma leitura média tiveram intensidade acima do ponto de corte para o pico testado. Os valores de filtro foram optimizadas para a melhor performance em classificadores baseados em SVM (produzido por LIBSVM, núcleo linear) de acordo com a dez vezes validação cruzada por um protocolo de duas etapas. O primeiro passo definido intervalos de busca e intervalos para ambos os filtros e interagindo sobre todas as combinações. Em seguida, a segunda etapa selecionada a combinação de valores, o que proporcionou o melhor desempenho e menor número de recursos.

(3) A etapa de normalização foi adicionado para controlar cross-amostra e cross-experimento preconceitos. Para efeito de comparação e seleção de características que mostram tendências semelhantes em ambas as fontes fontes sera ', cross-fonte normalização das intensidades foi realizada utilizando a função R "quantil" para definir 9 limiares X _{1 | . 9
que dividir os valores em escala na classe de controle em 10 quantiles.}

métodos de bioinformática adicionais são fornecidos em S1 Arquivo.

baseada em imuno ensaios comerciais e clínicos para o diferentes apolipoproteínas

ApoC-III e apoB-100 níveis foram medidos por Immunoturbidometry em um Olympus 400 auto-analisador, usando os kits K-ensaio (cat # KAI-006 e 6142, Kamiya Biomédicas, Seattle, WA, EUA) como previamente descrito [22]. Na casa de ELISA para apoC-III é descrita em S1 Arquivo. níveis ApoC-I foram testados usando um kit AssayMax humano apolipoproteína C-I por ELISA (Assaypro, St. Charles, MO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. normas apoC-I humanos purificados foram incluídos no kit.

Resultados

O uso de método baseado em MS para identificar peptídeos de soro de assinatura para o câncer de estômago

Estudos anteriores mostraram que bem peptidomics soros -Projetado e cuidadosamente controladas pode separar os pacientes com cancro específicos e controles não-cancerosas com base em padrões distintos de peptídeos de assinatura no soro [10], [11]. Investigou-se se estes resultados pode ser reproduzida para o cancro do estômago e se essa separação é suficiente para a análise dos soros de diferentes fontes. O primeiro analisados ​​os perfis de péptidos de soro de 62 pacientes com cancro de estômago, em diferentes fases, bem como soros de controlo 41 a partir de voluntários saudáveis. Estes soros foram obtidos a partir de duas fontes: (i) RNTech, uma empresa que recolheu soros em Bucareste, Roménia; e (ii) Asterand, uma empresa que recolheu soros nos EUA. Para cada fonte, os soros foram recolhidos utilizando um único protocolo clínico padrão. Os protocolos foram comparáveis ​​e.g. do tipo de tubo, o tempo de coagulação e o congelamento inicial do soro (ver Métodos), no entanto, os tubos de retirada de sangue foram diferentes. distribuição por idade, sexo e características clínicas dos 103 indivíduos incluídos neste estudo são apresentados na Tabela 1 e em mais detalhe na S1 Arquivo. Um resumo das fases clínicas de soros derivada de cancro do estômago para ambas as fontes é dado na Tabela 1. A manipulação da amostra após a recolha inicial era uniforme, envolvendo 2 ciclos de congelação-descongelação para realizar o armazenamento inicial e subsequente de alíquotas para a extracção de péptidos e análise por MS. Todas as amostras de soro foram processados ​​103 manualmente, mas de forma idêntica empregando um passo de extracção de fase inversa. As amostras de soro e repetições das amostras foram processadas e ler aleatoriamente em datas diferentes para evitar preparação viés associada à data. Toda a preparação de soros e de deposição foi realizada pelo mesmo indivíduo. Da mesma forma, todas as leituras MALDI foram realizadas pelo mesmo operador. A sensibilidade do instrumento MALDI-TOF foi monitorada rotineiramente e constantemente calibrados durante todas as leituras.

Análise de peptidoma soros baseado no MS revelou uma assinatura 9-peptídeo que distinguir pacientes de adenocarcinoma de estômago de controles livres de câncer

total de 637 picos de massa (características) foram identificados nos 103 amostras estudadas. Os resultados do MALDI foram convertidos para uma matriz que contém as intensidades de sinal dos picos de massa (637) apresenta para cada uma das amostras de soro estudado com repetições para cada amostra (ver métodos, bioinformática). Enquanto agrupamento hierárquico não supervisionado usando todos os recursos não segregou amostras cancerosas e não-cancerosas, análise de PCA de todos os recursos para cada fonte de soros diferenciado entre câncer e amostras não-cancerosas (Figuras S1-S3). Isto sugere que a filtração recurso e seleção é essencial antes de empregar máquina de classificação baseada em aprendizagem. Portanto, (i) aplicou uma etapa de filtração recurso e seleção e (ii) empregados valores de p Mann-Whitney e intensidades de pico, como cortes para selecionar um subconjunto de recursos (picos) para uso em experiências de aprendizado de máquina. (Veja métodos, bioinformática). Em seguida, analisamos dentro de cada fonte (RNTech e Asterand) se soros de pacientes e controles poderiam ser segregados. Recebemos bons resultados para cada um dos classificadores de fonte única; classificadores baseados em SVM para RNTech e Asterand tinha 90,0% e 93,0% do previsto precisões, respectivamente, de acordo com dez vezes validação cruzada do conjunto de treinamento (Tabela 2A). embaralhamento aleatório dos membros do grupo resultou em p-valores muito mais elevados (por exemplo, 0,8) e baixa precisão previsto em modelos treinados por cada fonte de soros. Isto indica a importância de condições clínicas para a classificação em dois grupos clinicamente definidas dentro de cada fonte de soros. No entanto, os classificadores de fonte única não teve um bom desempenho em amostras da outra fonte, prevendo o status corretamente clínica apenas em 35/60 amostras (Asterand na RNTech) e 25/43 (RNTech em Asterand) (quadro 2A). Portanto, o viés fonte de peptidoma tem um efeito significativo sobre a precisão da previsão.

A incapacidade dos modelos treinados em uma fonte de prever adequadamente as condições clínicas de leituras da outra fonte (Tabela 2A) está melhor apresentado ao verificar os recursos selecionados pelos classificadores específicos da origem (Tabela 3). Algumas das características que funcionou bem em uma fonte mostrou uma tendência oposta na outra fonte. Outros foram importantes para a classificação em uma fonte, mas teve pouco ou nenhum efeito no outro. Estas observações levaram-nos a uma análise comparativa dos dados a partir de duas fontes. Produzimos diagramas de caixa para todas as intensidades de pico, de acordo com grupos clínicos. Estas parcelas mostrou que, ao comparar de controlo e de câncer de intensidades para cada função dentro de uma fonte, a tendência observada podem diferir entre as duas fontes (por exemplo, m /z 1520, Figura 1A). Mesmo quando a tendência era persistente em ambas as fontes, os valores de intensidade pode ser diferente (por exemplo, m /z 6431; RNTech maior do que Asterand, Figura 1B). A fim de criar um modelo de previsão, é necessário para (i) fonte específicos de descarte fenômenos, e (ii) adicionar uma etapa de normalização que reduziria o efeito de diferentes níveis de intensidade, onde a tendência foi mantida.

A usar do conjunto de dados misturado com um Mann-Whitney p-valor de corte para seleção de recursos poderia descartar fenômenos específicos da origem. Peaks que mostraram tendências diferentes em diferentes fontes não seria significativo no conjunto misto para a separação baseada em grupo clínico; O recurso de 1520 manifestando tendência oposta entre as fontes, foi selecionado por cada único classificador fonte (Figura 1A, Tabela 3). Portanto, contribuíram para a falta de sucesso de desempenho cada classificador fonte única, por outro fonte (Tabela 2A). Como esperado, esse recurso não foi selecionado por qualquer modelo baseado no conjunto misto. Nós criamos um conjunto de dados mistos criados durante a remoção aleatoriamente 21 amostras de câncer de estômago do conjunto de treinamento misto, e usou estes 21 amostras retiradas para validação. Além disso, foram utilizados os 12 amostras de controlo sem câncer recolhidos em nosso laboratório como um conjunto de validação de controle independente. O modelo foi seleccionado de acordo com um máximo de precisão previsto de acordo com uma validação cruzada de dez vezes, como antes. O melhor modelo de pontuação para o conjunto misto foi utilizando (filtro de valor-p Mann-Whitney de 0,044) 9 características e tinha uma precisão previsto de 84,1% de acordo com dez vezes validação cruzada do conjunto de treinamento. Importante, ele previu com precisão 10/12 controles israelenses. No entanto, este classificador previsto inadequadamente (13 de 21) das 21 amostras de câncer de estômago mista removidos utilizados para validação.

Portanto, para reduzir o efeito das diferenças relacionadas com as fontes em níveis de intensidade, o desempenho do filtro na seleção de recursos foi melhorada através da introdução de uma etapa de normalização quantil. Esta normalização foi realizada de acordo com os controlos de soros de cada uma das fontes de forma independente das outras fontes (ver métodos, bioinformática). Para características, tais como m /z 6431, com uma tendência persistente em ambas as fontes, este passo corrigido o viés intensidade (Figura 1D). Com efeito, 6431 funcionalidade não foi seleccionado para o classificador baseado em mistura não normalizada. No entanto, foi seleccionado para o classificador baseado em mistura normalizada (Tabela 3). No entanto, para recursos como m /z 1520 com tendências opostas em ambas as fontes, este passo pode não mudar a tendência, como esperado (Figura 1C).

Testamos o efeito da normalização quantil por aplicá-lo antes de média e seleção de recurso. Para avaliar melhor a precisão da previsão empregamos a medida Matthews coeficiente de correlação (MCC). MCC é utilizada na aprendizagem de máquina como uma medida da qualidade da classe (dois) classificações binárias e devolve um valor entre -1 e +1. Um coeficiente de +1 representa uma previsão perfeita, 0 uma previsão aleatória média e -1 uma previsão inversa. MCC é geralmente considerado como uma medida equilibrada, que pode ser utilizado mesmo se as classes são de tamanhos diferentes. Nós assim calculado a MCC para vários experimentos de classificação, a fim de mostrar o efeito que a normalização teve na classificação. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Note-se que sem normalização, o MCC foi relativamente alta para o conjunto de treino, mas apresentaram desempenho medíocre no conjunto de validação (Tabela 2). A etapa de normalização deu valores MCC altas semelhantes para a formação e conjuntos de validação (Tabela 2). A etapa de normalização para controlar viés cross-fonte não anulou a necessidade de máquina de classificador à base de aprendizagem para definir um padrão discriminativo; PCA das duas fontes mistas conjuntos de dados normalizados resultou novamente em mau separação entre amostras de câncer de estômago e de controlo (Figura S4).

validação baseada Immuno para recursos que representam apoC-I e apoC-III

o classificador resultou do conjunto de dados mista, seguindo o passo de normalização quantil, empregada 9 características (Tabela 2). Três dos 9 recursos envolvidos apolipoproteínas: apoC-III (recurso de 9443) e apoC-I (características 6431 e 6629, Tabela 3). Para comprovar os resultados com base em MALDI, primeiro desenvolvido um teste de ELISA para a detecção qualitativa de apoC-III no soro (ver métodos) e testado todas as amostras de soro de Asterand e RNTech. Os resultados do ELISA seguiu a tendência dos resultados MALDI (Figura 2A, B); Intensidade do apoC-III foi significativamente maior nos grupos de controlo em relação aos grupos de câncer em ambas as fontes de soro. Nós ensaiada ainda mais a correlação entre apoC-III ELISA e 9443 resultados MALDI por cada amostra; Os resultados de ELISA e MALDI mostrou correlação significativa (p < 0,0001, correu correlação tau de Kendall). Em seguida, enviado aliquotas de soro a partir de quase todas as amostras (mesmo estado de congelação) para um laboratório clínico para o ensaio quantitativo externo à base de immunoturbidity de apoC-III [22]. Os resultados foram obtidos em mg /dl (Figura 2C) e como anteriormente, a quantidade de apoC-III foi significativamente mais alta nos grupos de ambas as fontes de soros de controlo.

Para verificar os resultados apoC-I MALDI, que empregue um comercial kit ELISA quantitativa que inclui normas apoC-I e reconhece ambos os 6431 e 6629 variantes de apoC-I. Os resultados foram obtidos em ug /ml (Figura 3B) e seguiu o padrão observado para os resultados MALDI (Figuras 1D e 3A); Intensidade do apoC-I foi significativamente maior nos grupos de controlo em relação aos grupos de câncer em ambas as fontes de soro. Para avaliar a especificidade de apoC-I e redução de apoC-III no soro de doentes com cancro de estômago de suporte, que os níveis testados apoB-100. As amostras ensaiadas de apoC-III no laboratório clínico externo foram ensaiados em paralelo para a apoB-100, utilizando os níveis de doseamento quantitativo com base em immunoturbidity. Os resultados foram obtidos em mg /dl (Figura 3C) e não mostrou nenhuma tendência significativa entre os grupos de controlo com cancro e do estômago. Portanto, poderíamos fazer uso das apoB-100 resultados como um factor de normalização para a análise bioinformática dos resultados quantitativos apoC-I e apoC-III (Figuras 3C, 3B, 2C, respectivamente).

Foram analisados clinicamente apoC-I, apoC-III e apoB-100 para amostras adicionais de pacientes com câncer de estômago e controles sem câncer (fonte RNTech, mesmo congelamento de estado, incluindo 10 pacientes com gastrite nos controles sem câncer; nota Tabela 1 para o total números de amostra). Foram também analisadas clinicamente níveis CA19-9 e PCR para todas as amostras (mesmo congelamento de estado). Em seguida, empregou Clementina 10,0 software nas amostras RNTech para avaliar se os níveis séricos de definir regras de IC com base na apoB-100 normalizada e C-III, e CA19-9 de PCR podem ser utilizadas para classificar os soros de entre grupos de controlo e RNTech cancro do estômago fonte como uma fonte de formação. A combinação de todos os 4 parâmetros proporcionou melhor precisão da previsão em relação à combinação de menos de 4 parâmetros (Figura 4 e dados não mostrados). precisão da previsão do conjunto de treinamento foi de 88,4%. Nós empregamos as regras RNTech-obtidos estabelecidos para a precisão de origem e previsão Asterand foi 74,4% (Figura 4). Para tanto a formação e validação a sensibilidade foi excelente (87/90 combinado), mas a especificidade foi menos preciso (37/52 combinado).

Discussão

Nos últimos anos, muito poucos relatórios descrevendo biomarcadores séricos MS-identificadas /assinaturas para estados cancerosos foram provado errado [5], [18]. Diferentes fontes de viés foram descritos incluindo a seleção da amostra, manipulação, processamento, leitura e análise [18], [20], [21]. Após a remoção dos factores que contribuem com polarização, mostrou-se que SELDI-TOF MS toda soro perfilamento proteomic com a superfície IMAC não detectar de forma fiável o cancro da próstata [23]. Por conseguinte, os autores sugeriram que é pouco provável que uma abordagem de espectrometria de massa utilizando soro não transformado seriam diferenciar entre homens com e sem cancro da próstata [24]. Por outro lado, outros estudos recentes baseados em MALDI-TOF que evitaram fatores que contribuem com viés e empregou uma técnica de processamento de soros de uma etapa identificada discriminar assinaturas de biomarcadores para diferentes tipos de câncer, incluindo câncer de próstata [11].

Neste estudo, foi adoptado o método de processamento de soros um passo para a identificação de uma assinatura baseada em peptidoma para diferenciar soros derivada de doentes com adenocarcinoma do estômago. Fizemos um esforço razoável para evitar fatores de viés contribuindo anteriormente relatados [18]. Foram analisados ​​soros de dois Biorepositórios. Observou-se que, mesmo quando manipulação de soros, processamento, leitura e análise MALDI são os mesmos, análise peptidoma é influenciado pela biorrepositório. Além das diferenças sócio-geográfica (Roménia e EUA como fonte para as amostras em RNTech e Asterand, respectivamente), o viés relacionado-source pode ser devido à marca do tubo de coleta de sangue, utilizados nas diferentes Biorepositórios.

em seguida, usamos um conjunto de amostras mista de duas fontes de soros para seleção de características e acrescentou uma etapa de normalização cross-fonte para compensar viés fonte. Descobrimos que (i) o uso do conjunto de dados misturado com um Mann-Whitney p-valor de corte para seleção de recursos poderia descartar recursos específicos de origem, e (ii) uma etapa de normalização quantil ajuda a selecionar (para a aprendizagem de máquina) características parcialmente concordantes , em que as tendências são concordantes entre fontes, mas os níveis de intensidade são diferentes entre fontes. A necessidade de normalização, quando se lida com amostras de diferentes fontes, já foi mostrado para a tecnologia de alto rendimento à base de microarray [25]. Está bem estabelecido que as variações nos procedimentos experimentais e condições não controladas (de origem por exemplo sócio-geográfica de amostras) pode levar a desvios de medição sistémicos.

Na sequência das alterações, estabelecemos uma assinatura peptídeo soro cross-fonte para distinguir estômago pacientes com câncer de controles não-cancerosas. Três dos péptidos correspondeu a apoC-I e apoC-III. Nós validado nossos resultados com base em MALDI com os métodos de análise independentes que são baseados em imunoensaios [26]. A assinatura péptido incluído apoC-III e características apoC-I-derivados. Os resultados de quantificação independente dos seus níveis séricos seguiu a tendência identificada pela abordagem MS.

O nosso estudo é o primeiro a relatar que os níveis séricos de apoC-I e apoC-III podem ser utilizadas como biomarcadores potenciais para o estômago Câncer. É verdade que os relatórios recentes indicaram que os níveis de 'apolipoproteínas no sangue poderia ser potenciais biomarcadores para diferentes tipos de câncer. ApoC-I foi identificado como um potencial biomarcador de soro para o cancro colo-rectal, cancro da próstata refractário a hormonas e fibrose do fígado [27] - [29]. Outros relatórios indicam que apoC-III também pode ser um potencial biomarcador no câncer de pâncreas e câncer de mama [30], [31]. No entanto, todos estes relatórios empregada triagem baseada em MALDI e não verificar os seus resultados com baseados em imuno ou outros ensaios. Nem eles estudam soros de outra fonte como um grupo de validação.

Nossos resultados devem ser mais gasta e validado como descrito [32], [33]. No entanto, a validação clínica de apoC-I e apoC-III resulta levar-nos a explorar ainda mais um ensaio de diagnóstico com base em marcadores biológicos que podem ser ensaiadas na clínica, sem a necessidade de uma tecnologia MS. Regras estabelecidas utilizando apoB-100-normalizado níveis séricos quantitativos gerados para a fonte RNTech e validados na fonte Asterand independente teve precisão da previsão de 88,4% e 74,4%, respectivamente C-I e C-III, CA19-9 e PCR. Portanto, a utilização destes 4 características clínicas ultrapassa parcialmente o viés fonte.

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