PLoS ONE: Serumas apolipoproteinais PI ir C III sumažėja skrandžio vėžiu sergantiems pacientams: rezultatai nuo MALDI-Based Peptidome ir imuninės sistemos Pagal Klinikinė Assays

Anotacija

rasti naujų peptidų biologinius žymenis dėl skrandžio vėžio į žmogaus serumo, kad gali būti įdiegtas į kliniškai praktiškai prognozavimo metodą stebėsenai skrandžio vėžio. Mes studijavo serumo peptidome iš dviejų skirtingų biorepositories. Mes pirmą kartą dirbo C8-atvirkštinių fazių skysčių chromatografijos metodą mėginio valymo, po masinės spektrometrijos analizei. Tai buvo tepti ant serumo mėginiuose nuo vėžio nemokamai kontrolės ir skrandžio vėžiu sergantiems pacientams įvairių klinikinių etapais. tada mes sukūrėme bioinformatikos analizė vamzdynas ir nustatė peptido parašą diskriminuoti skrandžio adenokarcinoma sirgusių vėžiu be kontrolės. Matrica Assisted Lazeriniai desorbcija /Jonizacijos-laikas skrydį (MALDI-TOF) rezultatai 103 mėginių atskleidė 9 parašo peptidų; su prognozavimo tikslumas 89% į mokymo komplekto ir 88% patvirtinimo rinkinys. Trys iš diskriminuojančio peptidų atrado buvo fragmentai apolipoproteinų C-I ir C-III (Apr-I ir C-III); Mes taip pat kiekybiškai jų koncentraciją serume, taip pat CA19-9 ir CRB,, dirba kiekybinius komercinės klinikinius tyrimus, atliekamus 142 mėginių. Apr-i ir Apr-III kiekybiniai rezultatai koreliuoja su MS rezultatus. Mes tada dirbo apoB-100-normalizuotas Apr-i ir Apr-III, CA19-9 ir CRB koncentracija generuoti nustatytus skrandžio vėžio prognozavimo taisykles. Mokymo, mes panaudojome serumai iš vienos saugyklos, ir patvirtinimo, mes naudojome serumai nuo antrojo saugykloje. Prognozavimo tikslumas 88,4% ir 74,4% buvo gauti mokymo ir tvirtinimo komplektų, atitinkamai. Serume Apr-I ir Apr-III kartu su kitais klinikiniais parametrais gali tarnauti kaip už diagnostikos rezultatas bambą vėžiu sergantiems pacientams formuluojant

nurodomoji dalis:. Cohenas, M, Yossef R Erez T Kugel A, Welt, M, Karpasas mm, ir kt. (2011) Serumas apolipoproteinais, C-aš ir C III sumažėja skrandžio vėžiu sergantiems pacientams: rezultatai MALDI-Based Peptidome ir imuninės sistemos Pagal klinikinių tyrimų. PLoS ONE 6 (1): e14540. Doi: 10,1371 /journal.pone.0014540

redaktorius: "Hana Algül Technische Universität München, Vokietija

Įstojo: liepos 1, 2010; Priėmė: Lapkričio 22 ", 2010; Paskelbta: Sausis 18, 2011

Visos teisės saugomos: © 2011 Cohenas ir kt. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Finansavimas buvo teikia Europos bendrijoje (6BP GLYFDIS 037.661). RNTech SAS Prancūzija nurodė rėmėjui dėl to, kad JT ir HB yra /buvo darbuotojai šioje įmonėje; kad "JT ir HB įmokos apibrėžiamos kaip galutinis patvirtinimas versija bus paskelbta, ir jie nebuvo įtraukti į indėlį į koncepcijos ir dizaino, ar įsigyjant duomenis, arba analizės ir aiškinimo duomenų ar rengiant rankraštį. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų. Tas faktas, kad du buvę ar dabartiniai darbuotojai RNTech SAS Prancūzijoje autoriai šio rankraščio nekeičia, kaip laikomasi visų PLoS ONE politiką dalijimosi duomenimis ir medžiagas, išsamiai internetinėje vadovas autoriams.

Įvadas

Mirtingumas daugelio vėžio nepasikeitė dramatiškai į pastaruosius 20 metų [1]. Anksti aptikimo buvo parodyta, kad žymiai pagerinti vėžio gydymo efektyvumą, dar aptikimo yra dažnai įmanoma tik po to, kai iš pirmųjų klinikinių simptomų, kuris kai kuriais vėžio įvyksta per vėlu sėkmingai intervencijos išvaizdą. Tai daugiausia dėl to, kad konkrečiais ir jautrių testų, kurie leidžia anksti tikrinti bei stebėti vėžinių narių nėra. Todėl naujų naviko biomarkeriai atradimas yra vis labiau laikomas kritinis pagerinti vėžio gydymui. Per pastarąjį dešimtmetį, daugelis tyrimų orientuota į žymenų atradimas. Vienas iš perspektyviausių šaltinių žymenų atradimas yra žmogaus kraujo, ypač serume ir plazmoje, kuris gali atspindėti daug renginių organizme, realiu laiku. Vis dėlto, nepaisant didžiulių pastangų, tik labai nedidelis skaičius plazmos baltymais buvo įrodyta, kad turėti diagnostinę vertę [2] - [5]. Dažnai šie biologiniai žymenys neturi stovėti atskirai ir kartu su kitomis tyrimų stebėsenos ir diagnozavimo. Dauguma jų nėra specifinis ir pakankamai jautrus plačiaekranio diagnozę [6], [7].

Vienas iš galimų šaltinis naujų vėžio biologinius žymenis yra peptidome. Už dėmesio serumo peptidų pagrindimas yra paremtas įrodymais, kad vėžys formavimas ir vystymas apima pokyčius baltymų "ir peptidai" metabolizmo ir padidėjusią prieinamumo metodikos atrankos visą peptidome. Kalbant apie vėžio išsivystymo, pakeitimai gali būti toje viduje ir atskiros ląstelės peptidų atstovaujamą į kraujo peptidome, kurie gali būti būdingi vėžinių etape masyvo, ir tokiu būdu turėti diagnostikos potencialą [2], [4], [ ,,,0],5]. Kalbant apie aptikimo technologija, naujausi MS technologijos leidžia šimtų peptidų aptikimo nuo kelių mikrolitrų serumo [8], [9]. Iš tiesų, ankstesni kraujo peptidome tyrimai pranešė pasirašymo peptidų serume, kad būtų išsiskiria sveiki vėžiu sergantiems pacientams masyvo (peržiūrėtas) [5]. Tai parodė prostatos, šlapimo pūslės, krūties ir skydliaukės vėžio Villanueva ir kt pervežimas [10], [11]. Jie pranešė 61 parašo peptidus, kurie gali atskirti sveikus asmenis iš 3 skirtingų tipų vėžiu sergantiems pacientams. O visi šie peptidai ir /arba jų fragmentų yra paprastai rasti serume, yra stebimas skirtumai kiekio tarp sveikų ir paveiktų asmenų. Tačiau, nors šie rezultatai rodo potencialą, peptidome profiliai vėžio diagnozę, ji vis dar turi būti įrodyta, kad šis metodas gali būti pratęstas atrasti biologinius žymenis tinka ankstyvos diagnostikos ir nuosekliai stebėti. Pirma, šių serumai peptidų biologinių žymenų gebėjimas atskirti pacientus nuo kontrolės daugiausia buvo stebėtas pacientams, sergantiems labai išplitusio ar metastazavusio navikų. Be to, iš šių biomarkeriai tvirtumas buvo užginčytos nekontroliuojamų kintamųjų, daugiausia priskiriamos skirtumų mėginio apdorojimo, perdirbimo protokolus ir duomenų analizės, buvo įrodyta, kad žymiai keisti šių tyrimų [11] Rezultatai - [19]. Įgyvendinant pagrindinį dėmesį mėginio įsigijimo, apdorojimo, perdirbimo, VN signalo apdorojimo ir statistinės analizės stabilesnės ir atkuriami rezultatai gali būti pasiekti [18], [20], [21].

Šiame darbe, mes sutelktas ant atranda žinutę pasirašymo peptidų, kurie galėtų turėti diagnostinę vertę skrandžio vėžio masyvo. Norint pasiekti šį tikslą, mes panaudojome tris skirtingus serume šaltinius, susijusius su skrandžio vėžiu sergantiems pacientams skirtinguose etapuose. buvo taikomas griežtas protokolas surinkimo ir apdorojimo serume [18], naudojant darnią tvarką peptidų gavybos ir MALDI-TOF rodmenis, su modifikuotu analizės etapai. Kartu, pagerėjo vamzdynų leido peptido modelio, kad diskriminuoja vėžio ir kontrolinių mėginių identifikavimo. Šie rezultatai buvo patvirtina ant pirminės ir naujos serumai trijų nustatytų funkcijų iš modelio, Apr-I (dviejų savybių) ir Apr-III, naudojant imuninės remiantis tyrimų. Mes tada dirbo serume Apr-I ir Apr-III kartu su CRB ir CA19-9 žymekliai diskriminuoti skrandžio adenokarcinoma sirgusių vėžiu be kontrolės.

Medžiagos ir metodai

Serumas derliaus nuėmimo ir kėlimo

serumuose buvo gauta iš dviejų komercinių šaltinių. 79 serumai mėginiai iš anksto operacijų skrandžio vėžiu sergančių pacientų ir 33 serumo mėginiuose nuo vėžio nemokamai suderintų kontrolės (įskaitant 10 gastritas pacientų) buvo surinkti RNTech (Paryžius, Prancūzija) Rumunijoje. Serumai forma vėžio ir vėžiu sergantiems pacientams ne buvo imtasi po nakties nevalgius taip: 5 ml kraujo buvo atrinktas į vamzdelį vacuette serume (CATLj005, Greiner Biografija Vienas, Kremsmiunsteris, Austrija) ir iš kairės į krešėti apie 30 minučių, po kurio mėgintuvėlis buvo centrifuguojamas esant 3000 apsisukimų per minutę ant HETTICH EBA 20S centrifugos (Hettich Ag, Tuttlingen, Vokietija) 5 minučių kambario temperatūroje. Atskirta serumo buvo padalinamas alikvotinėmis dalimis į 1 ml alikvotose steriliame kriogeninių vamzdžių (Nalgene, Rochester, NY, JAV) ir iš karto užšaldyti (-70) ° C temperatūroje. 22 iš anksto operacija skrandžio vėžys serumai ir 21 kontrolės priemonės buvo renkami Asterand JAV (Detroitas, MI, JAV) tokiu būdu: 10 ml kraujo buvo atkreipiamas į BD Vacutainer BPV plius plastikinį vamzdelį (kačių #BEC 367.985 BD , San Chosė, CA, USA). Vamzdelis buvo sumaišyti apverčiant tapo 5 kartus ir paliko krešėti apie 30 minučių vertikalioje padėtyje. Šis žingsnis buvo po kurio 1,100-1,300 g centrifuguojant 10 minučių kambario temperatūroje. Atskirtas serume buvo padalinamas alikvotinėmis dalimis į 1 ml alikvotose steriliame kriogeniniai vamzdžiai (Nalgene) Vamzdžiai ir nedelsiant sušaldyti (-70) ° C temperatūroje. Dėl Asterand šaltinio, badavimo duomenys nebuvo renkami bet kraujo į savo banko atkreipia. Sera mėginiai iš abiejų įmonių buvo vežami sausame lede ir saugomi (-70) ° C temperatūroje iš karto atvykus. Sera mėginiai buvo atšildyti ant ledo apie valandą pusantros, 50 mikrol buvo padalinamas alikvotinėmis dalimis į Lo-įpareigoti vamzdžių (Eppendorf, Hamburgas, Vokietija), ir iš karto vėl sušaldyti (-70) ° C temperatūroje. Visų mėginių mėginiai buvo laikomi (-70) ° C, kol bus perdirbamas. Trečiasis šaltinis serumais buvo gautas mūsų laboratorijoje nuo 12 vėžio nemokamai Izraelio kontrolę. Kraujo buvo parengtas su vamzdžio markės naudojama RNTech (CATLj005, Greiner Bio vienas) ir serumo tvarkymo pasekė RNTech procedūrą. Priešingu atveju gautas mūsų laboratorijoje serumai buvo paimti iš ne-nevalgius asmenims. Abu RNTech ir Asterand bendrovės įsteigta ir vykdoma jų veiklą po reguliavimo ir etikos standartus, įgyvendindama vietos, nacionaliniu, Europos, JAV ir Tarptautinės (JT) taisyklės bei rekomendacijos, ypač kai taikoma biologinės medžiagos rinkimo ir apdorojimo ir mokslinių tyrimų rezultatų panaudojimo. Tai apima rašytinį sutikimą kiekvieno paciento prisidėti prie biologinės ir duomenų banke, ir raštu studijų leidimą etikos komisijos Kiekvieno klinikinio instituto prisideda mėginius kompanijų bankų.

serumo mėginys perdirbimas ir paruošimas MS- MALDI skaitymas

Kiekvienas serumo mėginys buvo apdorojami dviejų iki trijų kartotinių (iš identiškų alikvotose ir atskirų atsitiktinių datas). Peptidai buvo paimti ant granulės padengtos C8, nuplaunama, išplaunama, sumaišyti su CHCA matricos ir nusėda ant MALDI tikslinės plokštės. Serumai buvo apdorojami kartotinių ir nusėda ant MALDI plokštės dublikatų. Dėl išsamesnės aprašyme ieškokite Failo S1.

Duomenų analizė MALDI rezultatai

Duomenų apdorojimas buvo atliktas dviem etapais. Pirmajame etape, intensyvumo matrica buvo atliktas iš žaliavų ASCII failus MALDI-TOF rodmenis iš visų serumai pavyzdžių šaltinių naudojant pakartotinį mėginių ėmimą, derinant ir m /z viršūnės aptikimo, kaip aprašyta Villanueva ir kt
[21]. Antrajame etape, mašina mokymo buvo naudojamas apibrėžti išskirtinį modelį, kuris gali būti naudojamas klasifikuoti pacientams. Šiam tikslui, aprašytą Villanueva proceso ir kt
[21] buvo pakeistas, kaip aprašyta žemiau. Pakeista vamzdynas visiškai priklauso atviro kodo programinės įrangos ir papildomos detalės yra aprašyta bioinformatikos skyriuje Failų S1.

(1) pakartoja sumuojant ir vaidybiniai filtravimo veiksmus buvo įtraukta į mano nulines vertes, kaip ypatingais atvejais. Mūsų originali matrica pateikta nemažai nulines vertes skirtingų funkcijų skirtingų pavyzdžių. Dėl bendro apribojimas MALDI technologija, nemenka šių nulines vertes gali atstovauti trūkstamas reikšmes, o ne tikrąjį nulis intensyvumas. Iš dalies apeiti šį apribojimą mes skaityti kiekvienas mėginys kartotinių ir apskaičiuojamas vidutinis intensyvumas, ignoruojant nulis intensyvumo rodmenis. Po šio atkartoti sumavimo, Gauto matrica vis pateikta nemažai nulines vertes. SVM pagrindu modeliai gali klasifikuoti pagal nulines vertes atstovaujanti trūkstamas reikšmes, o ne tiesa nulis intensyvumas. Todėl, išfiltruodavome funkcijų, kurios vis dar turėjo nulines vertes bent vieną iš pavyzdžių. Nė vienas iš šių pašalintas funkcijų turėjo aiškią pirmenybę nulio vertes konkrečios klinikinės grupės užduotį. Gautas subrangos matrica buvo naudojamas mašina mokymosi klasifikacija.

(2) Naujas požiūris funkcija atrankos parametrų nustatymas buvo sukurtas. Už SVM paremta analizė apibrėžimai iš pradžių buvo taip: RNTech skrandį vs RNTech kontrolės, Asterand skrandžio vs Asterand kontrolę. Mann-Whitney p-reikšmė buvo apskaičiuotas kiekvienos smailės, pagal klinikinių grupių, apibrėžtų analizei. tada mes naudojome Mann-Whitney p-reikšmės ir didžiausio intensyvumo kaip Apipjaustymas pasirinkti funkcijų (viršūnių) poaibį naudojimą mašina mokymosi eksperimentams. Intensyvumo Apipjaustymas nebuvo filtruoti mėginius, kurioje bent vienas vidutinis skaitymo turėjo intensyvumą didesnis už išbandyti piko nukirpimas. Filtruoti vertės buvo optimizuotas geriausių rezultatų į SVM pagrindu klasifikatorių (pagamintas LIBSVM, linijinio branduolio) pagal dešimt kartų kryžminio patvirtinimo protokolu dviejų etapų. Pirmasis žingsnis apibrėžta paieškos svyruoja ir intervalus tiek filtrų ir Iteracja per visas kombinacijas. Tada antrasis etapas pasirinktas vertybes, kuriame numatyta geriausius rezultatus ir mažiausią skaičių savybių derinys.

(3) normalizavimo etapas buvo įtraukta kontroliuoti abipus pavyzdžių ir įvairių eksperimentinių paklaidų. Dėl serumai jų šaltinių palyginimo ir pasirinkimo funkcijos rodomi panašias tendencijas abiejų šaltinių, kryžminio šaltinis normalizavimas intensyvumo atlikta naudojant R funkcija "Kvantas" apibrėžti 9 slenksčiai X _{1
. 9
kad padalinti išaugtų vertybes valdymo klasėje į 10 quantiles.}

Papildomos bioinformatikos metodus su sąlyga, Failų S1.

imuninės remiantis komercinių ir klinikiniai tyrimai už skirtingų apolipoproteinais

Apr-III ir apoB-100 koncentracija buvo matuojama Immunoturbidometry ant Olympus 400 autoanalyzer, naudojant K-testą rinkiniai (kačių # KAI-006 ir 6142, Kamiya Biomedicina, Seattle, WA, Jungtinės Amerikos Valstijos) kaip buvo aprašyta anksčiau [22]. Namas ELISA Apr-III yra aprašytas failo S1. Apr-I koncentracija buvo išbandytas naudojant AssayMax Žmogaus Apolipoproteinų, C-aš ELISA rinkinys (Assaypro, St. Charles, MO, JAV), pagal gamintojo nurodymus. Išgrynintas žmogaus Apr-I standartai buvo įtraukta į rinkinį.

Rezultatai

Naudoti MS pagrįstas metodas, siekiant nustatyti serumo peptidai parašą skrandžio vėžio

Ankstesni tyrimai parodė, kad gerai -designed ir kruopščiai kontroliuojamos serumai peptidomics gali atskirti konkrečių vėžio guolis pacientams ir ne tik vėžio kontrolę remiantis skiriamųjų raštų pasirašymo peptidų serume [10], [11]. Mes ištirti, ar šie rezultatai gali būti kopijuojami į bambą vėžio ir ar toks atskyrimas yra pakankamas analizei serumais iš įvairių šaltinių. Mes pirmą kartą išanalizavo serumas peptidų profilius 62 pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu skirtingais etapais, o taip pat 41 kontrolinio serumo nuo sveikų savanorių. Tai serumas buvo gauti iš dviejų šaltinių: (i) RNTech, įmonę, surinktą serumai Bukarešte, Rumunijoje; ir (ii) Asterand, kompanija, kuri surinko serumai JAV. Už kiekvieną šaltinio, serumai buvo renkami naudojant vieną standartinė klinikinė protokolą. Protokolai buvo panašus pvz vamzdelio tipas, krešėjimo laikas ir pradinis užšalimo serumų (žr metodai), dar kraujo abstinencijos vamzdžiai buvo skirtingi. Amžius platinimas, lytį ir klinikines charakteristikas iš 103 asmenų, įtrauktų į šios studijos yra pateikti 1 lentelėje ir detaliau Failų S1. Klinikinių stadijų skrandžio vėžio kilmės serumai abiejų šaltinių suvestinė pateikta 1 lentelė, mėginio paruošimas po pradinio kolekcija buvo vienodas, įtraukiant 2 šaltyje atšildymo ciklų atlikti pradinį saugoti ir vėliau padalinant peptidai gavybos ir MS analizę. Visi 103 serumo mėginiai buvo apdorojami rankiniu būdu, bet identiškai dirba vieno žingsnio atvirkštinės fazės ekstrakcijos. Sera mėginiai ir imties kartotiniai mėginiai buvo tvarkomi ir skaityti atsitiktinai skirtingomis datomis, siekiant išvengti pagaminimo datą susijęs šališkumo. Visi serumai paruošimas ir nusodinimo buvo atliktas turi tas pats asmuo. Panašiai, visų MALDI rodmenys buvo atlikti tas pats technikas. MALDI-TOF instrumento jautrumas buvo stebimas reguliariai ir nuolat kalibruojami per visus rodmenis.

Analizė MS įsikūrusio serumus peptidome atskleidė 9-peptido parašą, kad atskirti skrandžio adenokarcinoma sirgusių vėžiu nemokamai kontrolės

iš viso 637 masinių viršūnių (funkcijos) buvo nustatyta 103 tirtų mėginių. Šio MALDI rezultatai buvo konvertuojami į matricą, kuriame signalinius intensyvumo 637 masinių viršūnių (funkcijos) kiekvienai tirtų kraujo serumo mėginiuose su kartotinių kiekvienam mėginiui (žr metodus, bioinformatikos). Nors neprižiūrimų hierarchinė grupavimas naudojant visas funkcijas nebuvo atskirti vėžines ir ne tik vėžio pavyzdžius, PCA analizė visų funkcijų kiekvienos serumus šaltinio diferencijuoto tarp vėžio ir ne tik vėžio mėginiai (duomenys S1-S3). Tai rodo, kad funkcija filtravimo ir atranka yra būtina prieš įdarbinant mašina mokymosi pagrindu klasifikacija. Todėl mes (I) pritaikė funkcija filtravimo ir atrankos etapą ir (ii) dirba Mann-Whitney p-reikšmės ir didžiausio intensyvumo kaip Apipjaustymas pasirinkti funkcijų (viršūnių) poaibį naudojimą mašina mokymosi eksperimentams. (Žr metodus, bioinformatikos). Mes tada analizuojami kiekvieno šaltinio (RNTech ir Asterand) ar serumai pacientų ir kontrolės gali būti atskirtos. Gavome gerų rezultatų kiekvienam iš vieno šaltinio klasifikatorių; SVM pagrindu klasifikatoriai už RNTech ir Asterand turėjo 90,0% ir 93,0% prognozavo tikslumas, atitinkamai, pagal dešimt kartų kryžminio patvirtinimo mokymo rinkinys (2A lentelė). Atsitiktinės Maišoma grupės narių lėmė daug didesnės p reikšmės (pvz 0,8) ir mažo prognozuojama tikslumo apmokyti modelių už kiekvieną serumus šaltinį. Tai reiškė, kad klinikinių sąlygų klasifikaciją reikšmę į dvi kliniškai apibrėžtų grupių kiekvienoje serumus šaltinį. Tačiau vieno šaltinio klasifikatoriai neatliko gerai ant kito šaltinio pavyzdžius, prognozuoti teisingai klinikinę būklę tik 35/60 mėginių (Asterand ant RNTech) ir 25/43 (RNTech ant Asterand) (2A lentelė). Todėl šaltinis paklaida peptidome turi didelę įtaką prognozavimo tikslumą.

Modelių apmokyti nuo vieno šaltinio tinkamai prognozuoti klinikines būkles iš skaitymų iš kito šaltinio (2A lentelė) nesugebėjimas geriau pateikti tikrinant kad iš požymių, parinktų iš šio šaltinio-specifinis klasifikatorių (3 lentelė). Kai kurie iš funkcijų, kurios gerai dirbo nuo vieno šaltinio parodė priešingą tendenciją kito šaltinio. Kiti buvo svarbus klasifikavimo vieno šaltinio, tačiau turėjo mažai arba jokio poveikio į kitą. Šie stebėjimai atvedė mus į lyginamosios analizės duomenis, gautus iš abiejų šaltinių. Mes pagaminti langelį sklypus visiems piko intensyvumo, atsižvelgiant į klinikinių grupių. Šie sklypai parodė, kad lyginant kontrolės ir vėžines intensyvumą kiekvienam funkcija per šaltinį, ši tendencija pastebima gali skirtis tarp dviejų šaltinių (pvz m /z 1520, 1A pav.) Net kai tendencija buvo atkaklūs abiejų šaltinių, intensyvumo dydžiai gali skirtis (pvz m /z 6431; RNTech didesnis nei Asterand, 1B pav.) Siekiant sukurti prognozavimo modelį, mums reikia (i) Atmesti šaltinio-specifiniai reiškiniai, ir (ii) pridėti normalizavimo žingsnis, kuris sumažintų įvairių intensyvumo lygių, kur buvo išlaikyta tendencija poveikį.

naudoti mišrių rinkinį su Mann-Whitney-p-vertė nukirpimas už funkcija atrankos gali išmesti šaltinio konkrečiai reiškinius. Viršūnės, kuri tendencijos skyrėsi įvairiuose šaltiniuose nebūtų reikšmingas mišrių rinkinys klinikinės grupės pagrindu atskyrimo; funkcija 1520 pasireiškianti priešingą tendenciją tarp šaltinių, buvo pasirinktas kiekvieno atskiro šaltinio klasifikatoriaus (pav 1A, 3 lentelė). Todėl prisidėjo prie sėkmingos kiekvieno atskiro šaltinio klasifikatoriaus dėl kito šaltinio (2A lentelė) trūkumo. Kaip ir tikėtasi, ši funkcija nebuvo pasirinktas bet kuris modelio, pagrįsto mišrių rinkinį. Mes sukūrėme nustatytus o atsitiktinai pašalinti 21 skrandžio vėžiu mėginius iš mišrių mokymo rinkinys mišrus duomenis ir naudoti šiuos 21 atšaukta pavyzdžių patvirtinimo. Be to, mes naudojo 12 vėžio nemokamai surinktus mūsų laboratorijoje kaip nepriklausoma kontrolės patvirtinimo rinkinys kontrolinius mėginius. Šis modelis buvo pasirinktas laikantis daugiausiai prognozuojama tikslumą pagal dešimt kartų kryžminio patvirtinimo, kaip ir anksčiau. Geriausias vertinimo modelis už mišrių rinkinys buvo naudojant 9 požymiai (Mann-Whitney p reikšmė filtrą 0,044) ir turėjo prognozuojamą tikslumą 84,1% pagal dešimt kartų kryžminio patvirtinimo mokymo rinkinys. Svarbu tai, kad jis tiksliai numatyti, 10/12 Izraelio kontrolę. Tačiau šis klasifikatorius prognozuojama netinkamai (13 21), kad 21 pašalintos mišri skrandžio vėžio mėginiai naudojami įteisinimo.

Todėl, siekiant sumažinti šaltinio susijusių skirtumų intensyvumo lygių poveikį, filtras pasirodymą funkcija atranka buvo sustiprintas įvedant Kvantas normalizavimo žingsnį. Šis normalizacijos buvo atlikta pagal kontrolės kiekvienos serumus šaltinio, nepriklausomai nuo kitų šaltinių (žr metodus, bioinformatiką). Dėl funkcijų, pavyzdžiui, m /z 6431 su patvaria tendencija abiejų šaltinių, šis žingsnis ištaisyti intensyvumo šališkumo (1d pav.) Iš tiesų, 6431 funkcija nebuvo pasirinktas ne normalizuotas mišinio pagrindu klasifikatorių. Tačiau, ji buvo pasirinktas normalizuotą mišinio pagrindu klasifikatoriuje (3 lentelė). Vis dėlto, už funkcijų, tokių kaip m /z 1520 su priešingomis tendencijomis abiejų šaltinių, šis žingsnis negali pakeisti tendenciją, kaip ir tikėtasi (1c pav).

Mes išbandėme Kvantas normalizuoti anketa poveikį taikant jį prieš vidutiniškai ir funkcija pasirinkimas. Siekiant geriau įvertinti prognozavimo tikslumą, mes dirbantys Matthews koreliacijos koeficientas (MKC) priemonė. MKC naudojamas mašinų mokymosi kaip dviejų komponentų (dvi klasės) klasifikacijų kokybės matas ir grąžina reikšmę nuo -1 iki +1. Iš +1 koeficientas reiškia geriausią prognozę, 0 vidutinis atsitiktinis prognozavimas ir -1 atvirkštinis prognozę. MKC paprastai yra laikomas subalansuotą priemonių, kurios gali būti naudojamos, net jei klases yra skirtingų dydžių. Mes taip apskaičiavo MCC įvairių klasifikacinių eksperimentų, kad įrodytų tokį poveikį, kad normalizuoti turėjo klasifikavimo. Rezultatai pateikti 2 lentelėje Atkreipkite dėmesį, kad be normalizavimo, MKC buvo santykinai didelė, mokymo komplekto, dar parodė vidutinišką našumą patvirtinimo rinkinį (2 lentelė). Normalizavimo etapas davė panašius aukštus MKC vertes mokymo ir patvirtinimo rinkiniai (2 lentelė). Normalizavimo žingsnis siekiant kontroliuoti įvairių šaltinių šališkumo nepanaikino už mašinų mokymosi pagrindu klasifikatoriaus apibrėžti labai išskirtinį modelio poreikį; PBS iš dviejų šaltinių, mišrių normalizuotų duomenų rinkinių vėl lėmė prasta atskyrimo skrandžio vėžio ir kontrolinių mėginių (S4 pav.)

imuniteto pagrindu įteisinimas už funkcijų, atstovaujančių Apr-i ir Apr-III

klasifikatoriuje atsirado iš mišrių duomenų rinkinį, po Kvantas normalizavimo žingsnio, dirbo 9 funkcijos (2 lentelė). Trys iš 9 funkcijų, susijusių apolipoproteinais: Apr-III (funkcija 9443) ir Apr-I (funkcijos 6431 ir 6629, 3 lentelė). Norėdami dar kartą patikrinti MALDI pagrindu rezultatus, mes pirmiausia sukurta ELISA tyrimo dėl kokybinio nustatymo Apr-III serume (žr metodus) ir išbandyti visas serumai mėginius iš Asterand ir RNTech. Rezultatai ELISA pasekė MALDI rezultatų tendenciją (2a pav B); Intensyvumas Apr-III buvo reikšmingai didesnis kontrolinėje grupėse, palyginti su vėžio grupių abiejų serumo šaltinių. Mes taip pat tiriami tarp Apr-III ELISA ir 9443 MALDI rezultatų per kiekvieno mėginio koreliaciją; Elisa MALDI rezultatai parodė, koreliacija (p < 0,0001, Kendall Ran koreliacija Tau). tada mes išsiuntėme serumai mėginiai iš beveik visų mėginių (pats užšaldyti valstija) prie išorinio klinikinėje laboratorijoje immunoturbidity pagrindu kiekybinį tyrimą dėl Apr-III [22]. Rezultatai buvo gauti mg /dL (2C paveikslas) ir, kaip nurodyta pirmiau, kiekis Apr-III buvo reikšmingai didesnis kontrolinės grupių abiejų serumo šaltinių.

Jei patikrinti Apr-aš MALDI rezultatus, dirbo komercinės kiekybinė IFA rinkinys, kuris apima Apr-i standartus, ir pripažįsta abu 6431 ir 6629 variantus Apr-I. Rezultatai buvo gauti mikrogramai /ml (3b pav) ir po modelio pastebėta MALDI rezultatų (duomenys 1D ir 3a); Intensyvumas Apr-I buvo žymiai didesnis kontrolinės grupės, palyginti su vėžio grupės abiejose serumo šaltinių. Įvertinti Apr-I ir Apr-III sumažinti skrandžio vėžys-guolių pacientų serumu specifiškumą, mes tiriami apoB-100 lygius. Į tiriami dėl Apr-III išorės klinikinių laboratorinių mėginiai buvo tiriami lygiagrečiai už apoB-100 lygių, naudojant immunoturbidity pagrindu kiekybinį tyrimą. Rezultatai buvo gauti mg /dL (Fig.3C) ir neparodė reikšmingos tendencijos tarp kontrolės ir skrandžio vėžio guolis grupes. Todėl mes galime pasinaudoti apoB-100 rezultatus kaip normalizuoti veiksnys bioinformatikos analizės kiekybinius Apr-I ir Apr-III rezultatų (skaičiais 3C, 3b, 2C, atitinkamai).

analizuojami kliniškai Apr-i, Apr-III ir apoB-100 už papildomus mėginius iš skrandžio vėžiu sergantiems pacientams ir vėžio nemokamai kontrolę (RNTech šaltinis, tas pats freeze-būklę; įskaitant 10 gastritas pacientų vėžio nemokamai kontrolę; 1 pastaba lentelė viso pavyzdžių numeriai). Mes taip pat išanalizavo klinikai CA19-9 ir CRB koncentracija visų mėginių (pats šaltyje valstybės). tada mes dirbantiems Clementine 10.0 programinę įrangą RNTech mėginių įvertinti, ar taisyklės, nustatytos remiantis apoB-100-sunormintas CI ir C-II, III, CA19-9 ir CRB koncentracija serume gali būti naudojamas klasifikuoti tarp serume kontrolės ir skrandžio vėžio grupių RNTech šaltinis kaip mokymo šaltinį. Visų 4 parametrų derinio davė geriau numatymo tikslumą, palyginti su derinys mažiau nei 4 parametrų (4 pav ir duomenų neparodyta). Prognozė tikslumas mokymo komplekto buvo 88,4%. Mes dirbo su RNTech-gautus taisykles, nustatytus Asterand šaltinio ir prognozavimo tikslumas buvo 74,4% (4 pav.) Tiek mokymą bei jautrumas buvo puikus (87/90 kombinuotas), tačiau specifiškumas buvo mažiau tikslūs (37/52 kartu).

Diskusijos

Pastaraisiais metais nemažai ataskaitos aprašant MS nustatyti serumo biologiniai žymenys /parašų vėžinių narių buvo įrodyta negerai [5], [18]. Įvairūs šaltiniai šališkumo buvo aprašyta įskaitant atrankai, tvarkymo, apdorojimo, skaityti ir analizuoti [18], [20], [21]. Po pašalinimo šališkumo prisideti veiksnių, buvo įrodyta, kad SELDI-TOF MS Visa serumas PROTEOMIKOS profiliavimas su IMAC paviršiaus nebuvo patikimai aptikti prostatos vėžį [23]. Todėl, autoriai teigė, kad tai yra mažai tikėtina, kad masių spektrometrija požiūris naudojant neperdirbtų serumą būtų atskirti vyrai su ir be prostatos vėžio [24]. Kita vertus, kiti naujausi MALDI-TOF pagrindu tyrimai, vengti šališkumo prisideti veiksnius ir dirbo vieno žingsnio serumai apdorojimo techninėmis priemonėmis nustatytą diskriminuoti biologinis parašus skirtingiems vėžio, įskaitant prostatos vėžio [11].

tai tyrimas mes priėmėme vienas žingsnis serumai apdorojimo metodą identifikavimo peptidome pagrindu pasirašyti diferencijuoti serumai, gautų iš skrandžio adenokarcinoma sirgusių pacientų. Mes padarėme pagrįstas pastangas, kad būtų išvengta anksčiau pateiktoms šališkumo prisidėti veiksnius [18]. Tyrėme serumai iš dviejų biorepositories. Mes pastebėjo, kad net tada, kai serumai apdorojimo, perdirbimo, MALDI skaitymas ir analizė yra tas pats, peptidome analizė linkusi į biorepository. Be socialinių ir geografinius skirtumus (Rumunija ir JAV kaip už į RNTech ir Asterand atitinkamai pavyzdžių šaltinis), šaltinis susijusių šališkumo gali būti dėl kraujo pašalinimo vamzdelis ženklo, naudojamo įvairiose biorepositories.

tada naudojamas mišrus mėginio rinkinį iš dviejų serumo šaltinių funkcija atrankos ir pridėjo kryžminio šaltinio normalizavimo žingsnį kompensuoti šaltinio šališkumo. Mes nustatėme, kad (i) mišrių rinkinį naudoti su Mann-Whitney-p-vertė nukirpimas už funkcija atrankos gali išmesti šaltinio konkrečių funkcijų, ir (ii) kvantilio normalizavimas žingsnis padeda pasirinkti (mašininiam mokymosi) iš dalies sutinkantis funkcijų , kuriame tendencijos yra Współbrzmieniowy tarp šaltinių, bet intensyvumo lygiai yra skirtingi tarp šaltinių. Už normalizuoti reikia, kai sprendžiami su mėginių iš įvairių šaltinių, jau buvo rodomas mikrogardeliq pagrindu didelio našumo technologijas [25]. Jis yra gerai nustatyta, kad svyravimų eksperimentinių procedūrų ir nekontroliuojamomis sąlygomis (pvz socialinę-geografinė kilmė mėginių) gali sukelti sisteminių matavimo paklaidų.

Po pakeitimus, mes sukūrėme įvairių šaltinių serumas peptido parašą atskirti skrandį vėžiu sergantiems pacientams iš ne vėžio kontrolę. Trys iš peptidų atitiko Apr-I ir Apr-III. Mes patvirtinti mūsų MALDI pagrindu rezultatus su nepriklausomais analizės metodus, kurie remiasi imuniniai [26]. Peptidas parašas įtraukti Apr-III ir Apr-I, gautų funkcijų. Rezultatai nuo nepriklausomos kiekybinio jų koncentracija serume po šios tendencijos identifikuoja MS metodu.

Mūsų tyrimas yra pirmasis pranešti, kad serume Apr-I ir Apr-III gali būti naudojamas kaip potencialių biologinių žymenų bambą vėžys. Tiesa, kad naujausiose ataskaitose nurodė, kad apolipoproteinais "kiekis kraujyje gali būti potencialūs biologiniai žymenys įvairių vėžio. Apr-man buvo identifikuoti kaip potencialus biologinis žymuo dėl storosios žarnos vėžio, hormonų atsparus prostatos vėžio ir kepenų fibrozės [27] serume - [29]. Kitos ataskaitose nurodyta, kad Apr-III taip pat gali būti potencialus biologinis kasos vėžio ir krūties vėžio [30], [31]. Tačiau visų šių pranešimų dirba MALDI atrankinės patikros ir nepatikrino savo rezultatus su imuninė pagrindu arba kitais tyrimais. Taip pat jie studijuoja serumai iš kito šaltinio, kaip patvirtinimo grupei.

Mūsų išvados turėtų būti toliau išeikvojo ir patvirtinti, kaip aprašyta [32], [33]. Tačiau klinikinė įteisinimas Apr-I ir Apr-III rezultatų skatina mus dar labiau ištirti diagnostinė analizė remiantis kraujo serumo biologinių žymenų, kurie gali būti tiriami klinikoje be MS technologijų poreikį. Taisyklių rinkinį, naudojant apoB-100-normalizuotą C-i ir C-III, CA19-9 ir CRB, kiekybiniai koncentraciją serume, gautos RNTech šaltinį ir įteisintas nepriklausomos Asterand šaltinio turėjo prognozavimo tikslumą 88,4% ir 74,4%, atitinkamai. Todėl, šių 4 klinikiniais požymiais naudojimas iš dalies įveikia šaltinio šališkumo.

• PLoS ONE: kiekybinis Chitinase iRNR lygiui žmogaus ir pelės audiniuose realiojo laiko PGR: Rūšys-konkretizacija Rūgštinis žinduolių Chitinase skrandžio audinių
• PLoS ONE: Molekulinė genetinė analizė skrandžio turinį atskleidžia Laukiniai Atlanto menkė minta Piscine reoviruso (PRV) infekuotų Atlanto lašišų, kilusią iš komercinių žuvų ferma