PLoS ONE: Serum apolipoproteïnen CI en C-III worden gereduceerd in maagkankerpatiënten: Resultaten uit MALDI-Based Peptidoomanalyse en Immuno-gebaseerde klinische Assays

Abstract

Het vinden van nieuwe peptide biomarkers voor maagkanker in humane sera die kan worden geïmplementeerd in een klinisch haalbare voorspelling methode voor het bewaken van maagkanker. We bestudeerden het serum peptidoom uit twee verschillende biorepositories. We hebben eerst gebruik van een C8-omgekeerde fase vloeistofchromatografie benadering voor monster zuivering, gevolgd door massaspectrometrie analyse. Deze werden aangebracht op serummonsters van kanker-vrije controles en maagkanker patiënten in verschillende klinische stadia. Vervolgens creëerde een bio-informatica analyse pipeline en geïdentificeerd peptide handtekening discrimineren maag adenocarcinoom patiënten met kanker-vrije controles. Matrix Assisted Laser desorptie /ionisatie-Time of Flight (MALDI-TOF) de resultaten van 103 monsters bleek 9 handtekening peptiden; met voorspelling nauwkeurigheid van 89% in de training set en 88% in de validatie set. Drie van de discriminerende peptiden ontdekt werden fragmenten van apolipoproteïnen C-I en C-III (apoC-I en C-III); we verder gekwantificeerde de serumspiegels, alsmede CA19-9 en CRP, gebruik kwantitatief commerciële klinische assays 142 monsters. ApoC-I en apoC-III kwantitatieve resultaten gecorreleerd met de MS resultaten. Vervolgens hebben we in dienst apoB-100-genormaliseerd apoC-I en apoC-III, CA19-9 en CRP niveaus om regels te stellen voor maagkanker voorspelling te genereren. Voor training, gebruikten we sera van de ene repository, en voor de validatie, we gebruikten sera van de tweede repository. Voorspelling nauwkeurigheid van 88,4% en 74,4% verkregen in de training en validatie sets, respectievelijk. Serum niveaus van apoC-I en apoC-III in combinatie met andere klinische parameters kunnen dienen als basis voor de formulering van een diagnostische score voor maagkanker patiënten

Visum:. Cohen M, Yossef R, Erez T, Kugel A, Welt M, Karpasas MM, et al. (2011) Serum apolipoproteïnen C-I en C-III worden gereduceerd in maagkankerpatiënten: Resultaten uit MALDI-Based Peptidoomanalyse en-Immuno gebaseerde klinische testen. PLoS ONE 6 (1): e14540. doi: 10.1371 /journal.pone.0014540

Editor: Hana Algül, Technische Universität München, Duitsland

Ontvangen: 1 juli 2010; Aanvaard: 22 november 2010; Gepubliceerd: 18 januari 2011

Copyright: © 2011 Cohen et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. De financiering was die door de Europese Gemeenschap (FP6 GLYFDIS 037.661). RNTech France SAS is staat financier omdat dat JT en HB worden /zijn medewerkers van het bedrijf; de bijdragen van JT en HB worden gedefinieerd als definitieve goedkeuring van de versie bekend te maken en ze waren niet betrokken bij de bijdrage aan het bedenken en vormgeven, of overname van gegevens, of analyse en interpretatie van gegevens of het opstellen van het manuscript. De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen. Het feit dat de twee voormalige of huidige medewerkers van RNTech SAS Frankrijk zijn auteurs van dit manuscript niet de hechting te veranderen om alle PLoS ONE beleid op het delen van gegevens en materialen zoals beschreven in de online gids voor auteurs.

Introductie

de sterftecijfers van vele kankers zijn niet drastisch veranderd in de laatste 20 jaar [1]. Vroege detectie werd aangetoond dat de effectiviteit van kankerbehandeling sterk verbeteren, maar detectie vaak alleen mogelijk na het verschijnen van de eerste klinische symptomen die bij sommige kankers optreedt te laat voor succesvolle interventie. Dit is grotendeels te wijten aan het ontbreken van specifieke en gevoelige tests die vroegtijdige screening en monitoring van kankercellen staten laten. Daarom is de ontdekking van nieuwe tumor biomarkers steeds beschouwd als essentieel voor het verbeteren behandeling van kanker. In de afgelopen tien jaar hebben veel studies gericht op de ontdekking van biomarkers. Een van de meest veelbelovende bronnen voor biomarker ontdekking is het menselijk bloed, in het bijzonder serum en plasma, te reflecteren veel gebeurtenissen in het lichaam, in real time. Ondanks enorme inspanningen, slechts een zeer klein aantal plasmaproteïnen bewezen hebben diagnostische waarde [2] - [5]. Vaak hebben deze biomarkers niet op zichzelf staan ​​en worden begeleid door andere tests voor controle en diagnose. De meesten van hen zijn niet specifiek en gevoelig genoeg voor breedbeeld diagnose [6], [7].

Een mogelijke bron van nieuwe kankertherapie biomarkers is de peptidoom. De grondgedachte achter serum gericht op peptiden zijn gebaseerd op bewijs dat vorming en ontwikkeling van kanker behelst veranderingen in eiwitten en peptiden metabolisme, en de verhoogde beschikbaarheid van de methodologie voor het screenen van de hele peptidoom. In termen van kanker, kunnen veranderingen optreden in de reeks intra- en extracellulaire peptiden weergegeven in het bloed peptidoom, die specifiek zijn voor de kankercellen tot eindproducten, en dus een diagnostische waarde [2], [4], [ ,,,0],5]. Qua detectietechnologie, recente ontwikkelingen in MS technologie mogelijk de detectie van honderden peptiden uit een paar microliter serum [8], [9]. Sterker nog, de vorige bloed peptidoom studies rapporteerde een scala van ondertekening peptiden in serum dat gezond van kankerpatiënten hadden onderscheiden (beoordeeld in [5]). Dit werd aangetoond voor prostaat-, blaas-, borst- en schildklierkanker door Villanueva et al
[10], [11]. Zij rapporteerden 61 signatuur peptiden die kon onderscheiden van gezonde individuen 3 verschillende kankerpatiënten. Hoewel al deze peptiden en /of hun fragmenten worden normaal in het serum worden verschillen in hoeveelheid tussen gezonde en aangetaste individuen waargenomen. Hoewel deze resultaten tonen het potentieel van peptidoom profielen voor kankerdiagnose, blijft nog worden aangetoond dat deze benadering kan worden uitgebreid tot biomarkers geschikt voor de vroege diagnose en consequent toezicht te ontdekken. Ten eerste werd het vermogen van deze sera peptide biomerkers patiënten onderscheiden van controles vooral aangetoond bij patiënten met zeer gevorderde of metastatische tumoren. Bovendien heeft de robuustheid van deze biomarkers is aangevochten; ongecontroleerde variabelen meestal toegeschreven aan verschillen in behandeling monster verwerkingsprotocollen en gegevensanalyse, is aangetoond dat de resultaten van deze assays [11] drastisch wijzigen - [19]. Door grote nadruk op het monster acquisitie, hanteren, verwerken, MS signaalverwerking en statistische analyses meer robuuste en reproduceerbare resultaten kunnen worden bereikt [18], [20], [21].

In dit werk, hebben we ons gericht op het ontdekken van een scala van ondertekening peptiden die diagnostische waarde voor maagkanker kunnen hebben. Om dit te bereiken, gebruikten we drie verschillende serum bronnen met maagkanker patiënten in verschillende stadia. Een strikt protocol voor serum verzameling en verwerking werd [18], met een samenhangende werkwijze van peptide extractie en MALDI-TOF metingen, met een aangepaste analyse pipeline. Samen de verbeterde pijpleiding toegestaan ​​voor de identificatie van een peptide patroon die een onderscheid maakt tussen kanker en controlemonsters. Deze resultaten werden bevestigd op het origineel en sera drie geïdentificeerde kenmerken van het patroon, apoC-I (twee elementen) en apoC-III, middels immuno-gebaseerde testen. Vervolgens hebben we in dienst serum niveaus van apoC-I en apoC-III in combinatie met CRP en CA19-9 markers maag adenocarcinoom patiënten onderscheiden van kanker-vrije controles.

Materialen en methoden

Serum oogsten en handling

Sera werden verkregen uit twee commerciële bronnen. 79 sera monsters van pre-operatie maagkanker patiënten en 33 sera monsters van kanker-vrije geëvenaard controles (inclusief 10 gastritis patiënten) werden verzameld door RNTech (Parijs, Frankrijk) in Roemenië. Sera vorm kanker en niet kankerpatiënten werden na overnacht vasten als volgt: 5 ml bloed werd in een VACUETTE serum buis (CatLj005, Greiner Bio One, Kremsmuenster, Oostenrijk) en liet men stollen gedurende 30 minuten, waarna de buis werd gecentrifugeerd bij 3000 rpm op een Hettich EBA 20S centrifuge (Hettich Ag, Tuttlingen, Duitsland) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De afgescheiden serum werd verdeeld in 1 ml porties in steriele cryogene buisjes (Nalgene, Rochester, NY, USA) en onmiddellijk ingevroren bij (-70) ° C. 22 pre-operatie maagkanker sera en 21 controles werden verzameld door Asterand in de Verenigde Staten (Detroit, MI, USA) als volgt: 10 ml bloed werd in een BD Vacutainer SST plus kunststofbuis (cat #BEC 367.985, BD , San Jose, CA, USA). De buis werd gemengd door deze 5 keer en liet men stollen gedurende 30 minuten in een verticale positie. Deze stap werd gevolgd door een centrifugatie van 1,100-1,300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. De afgescheiden serum werd verdeeld in 1 ml porties in steriele cryogene buisjes (Nalgene) buizen en onmiddellijk ingevroren bij (-70) ° C. Voor de Asterand bron, werd het vasten geen gegevens verzameld op een van de bloed trekt in hun bank. Sera monsters van beide bedrijven werden vervoerd op droog ijs en bewaard bij (-70) ° C direct na aankomst. Sera monsters werden op ijs ontdooid voor ongeveer een uur en een half, 50 pi werd verdeeld in lo-bind buizen (Eppendorf, Hamburg, Duitsland) en onmiddellijk opnieuw ingevroren bij (-70) ° C. Alle monster monsters werden opgeslagen bij (-70) ° C tot en met verwerking. Een derde bron van sera werd in ons laboratorium verkregen van 12 kanker-vrije Israëlische controles. Bloed werd getekend met de buis merk gebruikt door RNTech (CatLj005, Greiner Bio One) en de behandeling serum volgde de procedure van RNTech. De sera verkregen in ons laboratorium werden uit niet-nuchtere individuen. Zowel RNTech en Asterand bedrijven hebben opgezet en uitgevoerd hun activiteiten naar aanleiding van regelgeving en ethische normen, de uitvoering van plaatselijke, nationale, Europese, Amerikaanse en internationale (VN) de regels en aanbevelingen in het bijzonder wanneer van toepassing zijn op biologisch materiaal inzameling en verwerking en onderzoeksresultaat uitbuiting. Dit omvat zowel schriftelijke toestemming van elke bijdragende patiënt naar de biologische en data bank, en schriftelijke studie toestemming van de ethische commissie van elk klinisch instituut bijdragen monsters aan de banken van de bedrijven.

Serum monster verwerking en de voorbereiding voor MS- MALDI lezen

Elk serummonster werd verwerkt in 2-3 herhalingen (van identieke monsters en op aparte willekeurige data). Peptiden werden geëxtraheerd op parels bekleed met C8, gewassen, geëlueerd, gemengd met CHCA matrix, en afgezet op de MALDI richtplaat. Sera werden verwerkt in herhalingen en afgezet op de MALDI plaat in duplo. Voor een gedetailleerde beschrijving zie File S1.

Data analyse van MALDI resultaten

Data processing werd uitgevoerd in twee stappen. In de eerste stap werd een intensiteit matrix uitgevoerd vanaf de ASCII bestanden van MALDI-TOF metingen uit alle sera monster apparaten via herbemonstering, uitlijnen en m /z pieken detectie zoals beschreven in Villanueva et al
[21]. In de tweede stap werd machine learning gebruikt om een ​​onderscheidend patroon dat kan worden gebruikt om patiënten te classificeren definiëren. Hiertoe is de werkwijze beschreven in Villanueva e.a.
[21] werd gemodificeerd zoals hieronder beschreven. De gewijzigde pijplijn vertrouwt volledig op open source software en aanvullende details worden beschreven in het gedeelte bioinformatica in S1 Bestand.

(1) Een herhaling sommatie en functie filter stappen werden toegevoegd aan nul waarden als speciale gevallen te overwegen. Onze originele matrix bevatte een aanzienlijke hoeveelheid nulwaarden voor verschillende functies in verschillende monsters. Door algemene beperking van MALDI-technologie, kan een aanzienlijke fractie van deze nulwaarden vertegenwoordigen ontbrekende waarden in plaats van echte nul intensiteit. Om deze beperking te lezen we elk monster in duplo gedeeltelijk te overwinnen, en berekende de gemiddelde intensiteit, het negeren van nul intensiteit lezingen. Naar aanleiding van deze repliceren sommatie, de resulterende matrix bevatte nog aanzienlijke hoeveelheid nul waarden. SVM-gebaseerde modellen kunnen indelen naar nul waarden die ontbrekende waarden en niet waar nul intensiteiten. Daarom hebben we uitgefilterd kenmerken hadden nog steeds nulwaarden in ten minste één monster. Geen van deze verwijderd functies had duidelijke voorkeur van nul waarden aan een specifieke klinische groepsopdracht. De resulterende sub-matrix werd gebruikt in een machine learning classificatie.

(2) Een nieuwe benadering van selectie parametrering voorzien werd ontwikkeld. De definities voor de SVM-gebaseerde analyse waren aanvankelijk als volgt: de maag RNTech vs. RNTech control, maag Asterand vs. Asterand controle. Mann-Whitney p-waarde werd berekend voor elke piek volgens klinische groepen gedefinieerd voor de analyse. Vervolgens gebruikt Mann-Whitney p-waarden en piekintensiteiten cutoffs als een subset van kenmerken (pieken) selecteren voor gebruik in de machine learning experimenten. Een intensiteit cutoff niet filteren monsters waarin ten minste een gemiddelde waarde hadden intensiteit boven de cutoff voor de geteste piek. Filter waarden werden geoptimaliseerd voor de beste prestaties in SVM-gebaseerde classifiers (geproduceerd door libsvm, lineaire kernel) volgens tienvoudig kruis validatie door een twee-staps protocol. De eerste stap gedefinieerde zoekbereiken en intervallen voor zowel de filters en herhalen over alle combinaties. Dan is de tweede stap gekozen voor de combinatie van waarden, die de beste prestaties en het kleinste aantal kenmerken voorzien.

(3) Een normalisering stap werd toegevoegd om te controleren voor cross-sample en cross-experiment vooroordelen. Voor vergelijking en selectie van functies met soortgelijke tendensen in beide bronnen sera bronnen, cross-bronnormalisatie intensiteiten werd uitgevoerd met de functie R "quantile" definiëren 9 drempels X _{1
. 9
dat de geschaalde waarden in de controlegroep klas te verdelen in 10 kwantielen.}

Extra bioinformatica methoden zijn te vinden in S1 Bestand.

-Immuno gebaseerde commerciële en klinische testen voor de verschillende apolipoproteïnen

apoC-III en apoB-100 niveaus werden gemeten door Immunoturbidometry op een Olympus 400 Autoanalyzer, met behulp van de K-testkits (cat # KAI-006 en 6142, Kamiya Biomedical, Seattle, WA, USA) zoals eerder beschreven [22]. In het huis van ELISA voor apoC-III is beschreven in S1 File. ApoC-I niveaus werden getest met behulp van een AssayMax Human Apolipoprotein C-I-ELISA-kit (Assaypro, St. Charles, MO, USA) volgens de instructies van de fabrikant. Gezuiverd menselijk apoC-I-normen werden opgenomen in de kit.

Resultaten

Het gebruik van MS-gebaseerde methode om serum peptiden handtekening te identificeren voor maagkanker

Eerdere studies toonden aan dat goed -ontworpen en zorgvuldig gecontroleerde sera peptidomische kunnen specifieke kanker-dragende patiënten en controles zonder kanker scheiden op basis van onderscheidende patronen van signatuur peptiden in serum [10], [11]. We hebben onderzocht of deze resultaten reproduceerbaar maagkanker en of een dergelijke scheiding is voldoende voor de analyse van sera uit verschillende bronnen. We hebben eerst onderzocht het serum peptide profielen van 62 patiënten met maagkanker in verschillende stadia, en 41 controlesera van gezonde vrijwilligers. Deze sera werden verkregen uit twee bronnen: (i) RNTech, een bedrijf dat sera in Boekarest, Roemenië verzameld; en (ii) Asterand, een bedrijf dat sera verzameld in de USA. Voor elke bron werden de sera met één standaard klinische protocol. De protocollen waren vergelijkbaar bijv. het type van de buis, de stollingstijd en de eerste bevriezing van de sera (zie werkwijzen), maar de bloedafname buizen waren verschillend. Leeftijdsverdeling, geslacht en klinische kenmerken van de 103 personen die in deze studie worden weergegeven in Tabel 1 en in meer detail S1 File. Een samenvatting van klinische stadia van maag-kanker afgeleide sera beide bronnen wordt gegeven in tabel 1. Monster behandeling na beginverzameling uniform was, waarbij 2 vries-dooicycli initiële opslag en daaropvolgende aliquoteren voor peptide extractie en MS analyse bewerkstelligen. Alle 103 serummonsters werden met de hand bewerkt, maar op dezelfde manier in dienst one-step omgekeerde fase extractie. Sera monsters en sample herhalingen werden verwerkt en willekeurig lezen op verschillende data aan de voorbereiding-date bijbehorende vooringenomenheid te voorkomen. Alle sera bereiding en depositie werd uitgevoerd door dezelfde persoon. Evenzo werden alle MALDI metingen door dezelfde technicus. De gevoeligheid van de MALDI-TOF instrument werd routinematig gecontroleerd en voortdurend geijkt gedurende alle metingen.

Analyse van MS-gebaseerde sera peptidoom bleek een 9-peptide handtekening die maag adenocarcinoom patiënten te onderscheiden van kanker vrije controles

totaal van 637 massa pieken (functies) werden geïdentificeerd in de 103 onderzochte monsters. De resultaten van de MALDI werden omgezet in een matrix die de signaalintensiteiten van 637 massapieken (functies) voor elk van de onderzochte serummonsters met duplo voor elk monster (zie werkwijzen bioinformatica). Terwijl onbewaakte hiërarchische clustering met behulp van alle functies niet scheiden van kanker en niet-kanker monsters, PCA analyse van alle functies voor elke sera bron gedifferentieerd tussen kanker en niet-kanker monsters (figuren S1-S3). Dit suggereerde dat de functie filtratie en selectie is essentieel voor het gebruik van de machine-learning gebaseerde classificatie. Dus we (i), welke een functie filtratie en selectiestap en (ii) toegepaste Mann-Whitney p-waarden en piekintensiteiten cutoffs als een subset van kenmerken (pieken) selecteren voor gebruik in de machine learning experimenten. (Zie methoden, bio-informatica). We vervolgens geanalyseerd binnen elke bron (RNTech en Asterand) de vraag of sera van patiënten en controles kunnen worden gescheiden. We kregen goede resultaten voor elk van de single-source classifiers; SVM-gebaseerde classifiers voor RNTech en Asterand had 90,0% en 93,0% van de voorspelde nauwkeurigheden, respectievelijk, volgens tienvoudige kruis validatie van de training set (tabel 2A). Random schuifelen van de leden van de groep resulteerde in veel hogere p-waarden (bijv. 0,8) en lage voorspelde nauwkeurigheid bij getrainde modellen per elke sera bron. Dit gaf de betekenis van klinische voorwaarden voor indeling in twee klinisch-gedefinieerde groepen binnen elke sera bron. Echter, de single-source classifiers niet goed presteren op monsters van de andere geluidsbron, correct voorspellen klinische toestand slechts in 35/60 monsters (Asterand op RNTech) en 25/43 (RNTech op Asterand) (Tabel 2A). Daarom bron voorspanning van peptidoom heeft een significant effect op de nauwkeurigheid van de voorspelling.

Het onvermogen modellen getraind op een bron adequaat voorspellen van klinische metingen van de andere bron (tabel 2A) wordt beter weergegeven bij het controleren de door de bron-specifieke classifiers (tabel 3) functies. Enkele van de functies die goed gewerkt aan de ene bron toonde een tegenovergestelde trend op de andere bron. Anderen waren van belang voor indeling in één bron, maar had weinig of geen effect op de andere. Deze waarnemingen leidde ons naar een vergelijkende analyse van de gegevens uit beide bronnen. We geproduceerd boxplots voor alle piek intensiteiten, volgens de klinische groepen. Deze percelen is gebleken dat bij het vergelijken van de controle en kanker intensiteiten voor elke functie binnen een bron, de trend waargenomen kunnen verschillen tussen de twee bronnen (bijvoorbeeld m /z 1520, Figuur 1A). Zelfs wanneer de trend persistent in beide bronnen, kan de intensiteitswaarden verschillen (bijvoorbeeld m /z 6431; RNTech boven Asterand figuur 1B). Om een ​​predictiemodel maken, moesten we (i) discard bronspecifieke verschijnselen, en (ii) voeg een normalisatiestap die het effect van verschillende intensiteitsniveaus wanneer de trend gehandhaafd zou verminderen.

De het gebruik van de gemengde dataset met een Mann-Whitney p-waarde cutoff voor functie selectie source-specifieke verschijnselen kunnen weggooien. Peaks waaruit bleek verschillende trends in de verschillende bronnen zou niet significant in de gemengde set voor klinisch-groep op basis van scheiding; feature 1520 manifesteren tegenovergestelde trend tussen bronnen, werd geselecteerd door één bron classifier (Figuur 1A, tabel 3). Daarom heeft bijgedragen aan het gebrek aan succesvolle uitvoering van één bron classifier anderzijds bron (Tabel 2A). Zoals verwacht, is deze functie niet door een model op basis van de gemengde set geselecteerd. We hebben een gemengde data instellen terwijl willekeurig verwijderen van 21 maagkanker monsters uit de gemengde training set, en gebruikt deze 21 verwijderd monsters voor validatie. Daarnaast gebruikten we de 12 kanker-vrije controlemonsters in ons laboratorium verzameld als een onafhankelijke controle validatieset. Het model werd geselecteerd in overeenstemming met een maximale nauwkeurigheid voorspeld volgens een tienvoudige kruisvalidatie, zoals voorheen. De best scorende model voor de gemengde set was met behulp van 9 functies (Mann-Whitney p-waarde filter van 0,044) en had een voorspelde nauwkeurigheid van 84,1% volgens tienvoudige kruis validatie van de training set. Belangrijker is dat het nauwkeurig voorspeld 10/12 Israëlische controles. Echter classifier voorspelde onvoldoende (13 van 21) de 21 verwijderd gemengde maagkanker monsters ter validatie.

Daarom, om het effect van-source verschillen in intensiteit te verminderen, de prestaties van de filter in feature selection was versterkt door de invoering van een kwantiel normalisatie stap. Deze normalisatie werd uitgevoerd volgens de controle van elke sera bron onafhankelijk van de andere bronnen (zie methoden, bio-informatica). Voor elementen, zoals m /z 6431 met een aanhoudende trend in beide bronnen, deze stap gecorrigeerde intensiteit vertekening (figuur 1D). Er werd 6431 eigenschap niet voor de niet-genormaliseerde-mix gebaseerd classifier geselecteerd. Er werd echter geselecteerd voor de genormaliseerde-mix gebaseerd classifier (tabel 3). Maar toch, voor functies zoals m /z 1520 met tegengestelde trends in beide bronnen, deze stap kon niet de trend te veranderen, zoals verwacht (figuur 1C).

We hebben het effect van de quantile normalisering's getest door toe te passen voor het gemiddelde en feature selectie. Om beter te kunnen beoordelen de voorspelling nauwkeurigheid we de Matthews Correlatie Coëfficiënt (MCC) maatregel toegepast. MCC wordt gebruikt in machine learning als maat voor de kwaliteit van binaire (twee klasse) classificaties en een waarde tussen -1 en 1 retourneert. Een coëfficiënt van 1 staat voor een perfecte voorspelling, 0 een gemiddelde random voorspelling en -1 een inverse voorspelling. MCC wordt algemeen beschouwd als een evenwichtige maatregel die kan worden gebruikt, zelfs als de klassen van verschillende grootte. We aldus berekende het MCC voor diverse indeling experimenten om het effect dat de normalisering had over de indeling te laten zien. De resultaten zijn weergegeven in tabel 2. Merk op dat zonder normalisering, MCC was relatief hoog voor de training set, maar toch toonde middelmatige prestaties op de validatie set (tabel 2). De normalisatie stap gaf vergelijkbare hoge MCC waarden voor training en validatie sets (tabel 2). De normalisatie stap om cross-source vooringenomenheid controle niet nietig te verklaren de behoefte aan machine-learning gebaseerde classifier een onderscheidend patroon te definiëren; PCA van de twee bronnen gemengde genormaliseerde datasets resulteerde opnieuw in een slechte scheiding tussen maagkanker en controlemonsters (figuur S4).

-Immuno basis validatie voor de functies die apoC-I en apoC-III

de classifier het gevolg van de gemengde data set, na kwantiel normalisering stap, in dienst 9 functies (tabel 2). Drie van de 9 functies betrokken apolipoproteïnen: apoC-III (functie 9443) en apoC-I (kenmerken 6431 en 6629, tabel 3). Om de MALDI-gebaseerde resultaten verder te verifiëren, hebben we eerst een ELISA-test voor de kwalitatieve detectie van apoC-III in het serum ontwikkeld (zie methoden) en getest alle sera monsters uit Asterand en RNTech. Resultaten van de ELISA volgde de trend van de MALDI resultaten (Figuur 2A, B); Intensiteit van apoC-III was significant hoger in de controlegroep vergeleken met kanker groeperingen in sera bronnen. We verder onderzocht de correlatie tussen apoC-III ELISA en 9443 MALDI resultaten per elk monster; ELISA en MALDI resultaten toonden significante correlatie (p < 0,0001, Kendall's liep correlatie tau). Vervolgens stuurde porties sera van bijna alle monsters (zelfde bevriezen state) naar een externe klinisch laboratorium-immunoturbidity gebaseerde kwantitatieve assay voor apoC-III [22]. Resultaten werden verkregen in mg /dl (figuur 2C) en zoals hierboven hoeveelheid apoC-III was significant hoger bij controlegroepen beide sera bronnen.

De apoC-I MALDI resultaten te verifiëren, gebruikten we een commercieel kwantitatieve ELISA kit die apoC-I normen omvat en erkent zowel 6431 en 6629 varianten van apoC-I. Resultaten werden verkregen in mg /ml (Figuur 3B) en volgde het patroon waargenomen voor de MALDI resultaten (Figuren 1D en 3A); Intensiteit van de apoC-I was significant hoger in de controlegroep vergeleken met kanker groeperingen in sera bronnen. Om de specificiteit van apoC-I en apoC-III vermindering van de sera van maagkanker dragende patiënten evalueren, we getest apoB-100 niveaus. De getest op apoC-III in de externe klinisch laboratorium monsters werden parallel getest voor apoB-100 niveaus met behulp immunoturbidity-gebaseerde kwantitatieve assay. Resultaten werden verkregen in mg /dl (figuur 3C) en toonde geen significante trend tussen controle en maag-kanker dragende groepen. Daarom kunnen we gebruik maken van de apoB-100 resultaten en een normaliserende factor voor de bioinformatica analyse van de kwantitatieve apoC-I en apoC-III resultaten (Figuren 3C, 3B, 2C respectievelijk).

We analyseerden klinisch apoC-I, apoC-III en apoB-100 voor aanvullende monsters van maagkanker patiënten en vrij van kanker controles (RNTech bron, dezelfde freeze-staat, met inbegrip van 10 gastritis patiënten in de kanker-vrije controles; note tabel 1 voor de totale aantallen monsters). We hebben ook geanalyseerd klinisch CA19-9 en CRP niveaus voor alle monsters (zelfde freeze-state). Vervolgens gebruikt Clementine 10.0 software op de RNTech monsters te beoordelen of regels basis van apoB-100-genormaliseerde Cl en C-III, CA19-9 en CRP serumniveaus kunnen worden gebruikt in te delen tussen sera van controle en maagkanker groepen RNTech source als een training bron. De combinatie van 4 parameters leverden betere voorspelling nauwkeurigheid ten opzichte combinatie van minder dan 4 parameters (figuur 4 en data niet getoond). Voorspelling juistheid van de training set was 88,4%. We gebruikten de RNTech verkregen regels voor Asterand bron en voorspellingsnauwkeurigheid was 74,4% (figuur 4). Voor zowel training en validatie was de gevoeligheid uitstekend (87/90 gecombineerd) maar de specificiteit was minder nauwkeurig (37/52 gecombineerd).

Discussie

In de afgelopen jaren een flink aantal rapporten beschrijven MS-geïdentificeerde serum biomarkers /handtekeningen voor kankercellen staten werden bewezen verkeerd [5], [18]. Verschillende bronnen van partijdigheid werden beschreven met inbegrip van steekproefsgewijze selectie, behandeling, verwerking, lezen en te analyseren [18], [20], [21]. Bij verwijdering van diagonaal-factoren, werd aangetoond dat SELDI-TOF MS hele serum eiwitprofilering met IMAC oppervlak niet betrouwbaar detecteren prostaatkanker [23]. Daarom is de auteurs gesuggereerd dat het onwaarschijnlijk is dat een massaspectrometrie benadering met behulp onbewerkte serum een ​​verschil wordt gemaakt tussen mannen met en zonder prostaatkanker [24]. Anderzijds, andere recente MALDI-TOF-gebaseerde studies bias factoren vermeden en werkzaam in één stap sera verwerkingstechniek die discrimineren biomerkers voor verschillende kankers waaronder prostaatkanker [11].

In deze studie we nam de ene stap sera verwerking aanpak voor de identificatie van een peptidoom gebaseerde handtekening aan sera afkomstig uit de maag adenocarcinoom patiënten onderscheiden. We maakten een redelijke inspanning om eerder gerapporteerde vooringenomenheid factoren [18] te voorkomen. We analyseerden sera van twee biorepositories. We vonden dat zelfs wanneer sera behandeling, verwerking, MALDI lezen en analyse hetzelfde is Peptidoomanalyse voorgespannen door biorepository. In aanvulling op de sociaal-geografische verschillen (Roemenië en de Verenigde Staten als de bron voor de monsters in RNTech en Asterand, respectievelijk), de-source gerelateerde vertekening kan te wijten zijn aan het merk van de bloedafname buis, die in de verschillende biorepositories.

vervolgens hebben we gebruik gemaakt van een mengmonster set van twee sera bronnen voor feature selectie en voegde een cross-source normalisatie stap om te compenseren voor de bron vooringenomenheid. We vonden dat (i) het gebruik van de gemengde dataset met een Mann-Whitney p-waarde cutoff voor functieselectie bronspecifieke kenmerken kunnen verwijderen, en (ii) een kwantiel normalisatiestap helpt te selecteren (machine learning) gedeeltelijk concordant functies , waarin de trends zijn concordante tussen bronnen, maar de intensiteit verschillend zijn tussen de bronnen. De behoefte aan normalisatie, bij de behandeling van monsters van verschillende bronnen, werd al aangetoond voor microarray-gebaseerde high throughput technologie [25]. Het staat vast dat de variaties in de experimentele procedures en ongecontroleerde omstandigheden (bv sociaal-geografische herkomst van de monsters) kan leiden tot een systemische meting vooroordelen.

Naar aanleiding van de wijzigingen, een cross-source serum peptide signatuur is, die we voor het onderscheiden van de maag kankerpatiënten van controles zonder kanker. Drie van de peptiden overeen met apoC-I en apoC-III. We gevalideerd onze MALDI gebaseerde resultaten onafhankelijke analytische methoden die zijn gebaseerd op immunoassays [26]. De handtekening peptide opgenomen apoC-III en apoC-I-afgeleide functies. De resultaten van onafhankelijke kwantificering van de serumniveaus volgde de trend die door de MS benadering.

Onze studie is de eerste te melden dat serumniveaus van apoC-I en apoC-III kan worden gebruikt als potentiële biomarkers voor maag kanker. Weliswaar recente rapporten hebben aangegeven dat niveaus apolipoproteïnen in bloed kunnen zijn potentiële biomarkers voor verschillende kankers. APOC-I werd geïdentificeerd als een potentiële serum biomarker voor colorectale kanker, hormoon-refractaire prostaatkanker en leverfibrose [27] - [29]. Andere verslagen dat apoC-III ook een potentiële biomarker bij alvleesklierkanker en borstkanker [30], [31] kan zijn. Echter, al deze rapporten gebruikt MALDI-gebaseerde screening en leverde de resultaten te verifiëren met immuno-gebaseerde of andere testen. Evenmin heeft ze studeren sera uit een andere bron als een validatie groep.

Onze bevindingen moeten verder worden uitgegeven en gevalideerd, zoals beschreven [32], [33]. Toch is de klinische validatie van apoC-I en apoC-III leidt ons aanleiding om een ​​diagnostische assay gebaseerd op serum biomarkers die in de kliniek kan worden getest zonder dat MS techniek verder te onderzoeken. Regels te stellen gebruik te maken van apoB-100-genormaliseerde C-I en C-III, CA19-9 en CRP kwantitatieve serum niveaus gegenereerd voor de RNTech bron en gevalideerd op de onafhankelijke Asterand bron had voorspelling nauwkeurigheid van 88,4% en 74,4% respectievelijk. Daarom is het gebruik van deze 4 klinische kenmerken dele overwint de voorspanning bron.

• PLoS ONE: Kwantificering van Chitinase mRNA Levels bij mens en muis weefsels door Real-Time PCR: Species-specifieke expressie van de zure zoogdieren Chitinase in de maag weefsels
• PLoS ONE: Moleculair genetische analyse van de maaginhoud onthult Wild Kabeljauw voeden met Piscine reovirus (PRV) Infected Atlantische zalm van oorsprong uit een Commercial Fish Farm