PLoS ONE: Serum apolipoproteina CI i C-III su smanjene u želuca bolesnika: Rezultati MALDI-Based Peptidome i Immuno-Based Klinička Assays

Sažetak pregled

Pronalaženje novih peptidnih biomarkera za rak želuca u ljudskom serumu koji može se provoditi u klinički izvedivo metode predviđanja za praćenje raka želuca. Proučavali smo u serumu peptidome iz dva različita biorepositories. Mi smo prvi put zaposlen C8-reverznom kromatografijom pristup faza tekućina za čišćenje uzorka, a nakon masovne spektrometrije analize. Oni se primjenjuju na uzorcima seruma oboljelih od raka, bez kontrole i oboljelima od raka želuca u različitim kliničkim fazama. Zatim smo stvorili bioinformatika analiza plinovod i identificirati peptida potpis diskriminira pacijente želudac adenokarcinoma od kontrole raka-free. Matrix Assisted Laser desorpcija /ionizacija-Vrijeme leta (MALDI-TOF) rezultati iz 103 uzoraka otkrio 9 potpis peptida; s točnošću predviđanja od 89% u trening setu i 88% u setu validacije. Tri od diskriminacije na peptida otkriveni su fragmenti apolipoproteina C-I i C-III (apoC-I i C-III); možemo dodatno kvantitativno njihove razine u serumu, kao i CA19-9 i CRP, zapošljava kvantitativne komercijalne kliničkih pokusa u 142 uzoraka. Otk-i i Otk-III kvantitativni rezultati koreliraju s rezultatima MS. Zatim smo zaposleni apoB-100-normalizira Otk-I i Otk-III, CA19-9 i razine CRP-a za generiranje pravila koja su postavljena za predviđanje raka želuca. Za obuku, koristili smo serume iz jednog spremišta, a na provjeru, koristili smo serume iz drugog spremišta. Predviđanja točnosti od 88,4% i 74,4% dobiveni su na obuku i validacije setovima, respektivno. serumske razine apoC-I i apoC-III u kombinaciji s drugim kliničkim parametrima mogu poslužiti kao osnova za formuliranje dijagnostičkog rezultat za pacijente s karcinomom želuca pregled

Izvor:. Cohen M, Yossef R, Erez T, Kugel A, Welt M Karpasas MM i sur. (2011) Serum apolipoproteina C i C-III su smanjene u rak želuca bolesnika: Rezultati MALDI-Based Peptidome i imuno-Based klinički testovi. PLoS ONE 6 (1): e14540. doi: 10,1371 /journal.pone.0014540 pregled

Urednik: Hana algul, Technische Universität München, Njemačka pregled

Primljeno: 1. srpnja 2010; Prihvaćeno: 22. studenoga 2010; Objavljeno: 18 siječanj 2011 pregled

Copyright: © 2011 Cohen i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Financiranje:. Financiranje je pod uvjetom da Europska zajednica (FP6 GLYFDIS 037.661). RNTech SAS Francuska navodi kao financijer s obzirom na činjenicu da je JT i HB su /bili su zaposlenici ove tvrtke; doprinosi JT i HB su definirani kao Konačno odobrenje od verzije koja će biti objavljena, a oni nisu bili uključeni u prilog koncepciji i dizajnu, odnosno prikupljanja podataka, odnosno analizu i interpretaciju podataka ili izrade rukopisa. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

suprotstavljenih interesa. Činjenica da dva bivša ili sadašnjih zaposlenika RNTech SAS Francuskoj su autori ovog rukopisa ne mijenja pridržavanje svih PLoS ONE politike na razmjenu podataka i materijala kao što je opisano u online vodič za autore. pregled

Uvod pregled

stope smrtnosti od mnogih vrsta raka nisu dramatično promijenila u posljednjih 20 godina [1]. Rano otkrivanje je pokazala da uvelike poboljšati učinkovitost liječenja raka, ali otkrivanje je često moguće tek nakon pojave prvih kliničkih simptoma, koji se u nekih vrsta raka pojavljuje prekasno za uspješnu intervenciju. To je uglavnom zbog nepostojanja specifičnih i osjetljivih testova koji omogućuju rano screening i praćenje kancerogenih stanja. Stoga, otkriće novih tumorskih biljega sve smatra presudno za poboljšanje liječenja raka. U posljednjih desetak godina, mnoge studije su usmjerene na otkrivanje biomarkera. Jedan od najperspektivnijih izvora za otkrivanje biomarkera je ljudska krv, posebno serumu i plazmi, što može odražavati mnoge događaje u tijelu, u realnom vremenu. Ipak, unatoč ogromnim naporima, samo vrlo mali broj proteine ​​plazme su dokazali da imaju dijagnostičku vrijednost [2] - [5]. Često, ovi biomarkeri ne stoje sami i popraćena drugim testovima za praćenje i dijagnostiku. Većina njih nisu specifični i dovoljno osjetljivi za široku dijagnoze zaslona [6], [7]. Pregled

Jedan mogući izvor novih biomarkera raka je peptidome. Razlog za fokusiranje na serumske peptidi se temelji na dokazima da je formiranje i razvoj raka uključuje promjene u metabolizmu bjelančevina 'i peptidi', a na povećanu dostupnost metodologije prikazivanja cijeli peptidome. U pogledu razvoja raka, promjene mogu pojaviti u nizu intra- i ekstra-stanične peptide zastupljenih u peptidome krvi, što može biti specifičan za kancerozne fazi, a time imati dijagnostički potencijal [2], [4], [ ,,,0],5]. U smislu detekcije tehnologije, nedavna dostignuća u tehnologiji MS omogućuju detekciju stotine peptida od nekoliko mikrolitara seruma [8], [9]. Doista, prethodne studije peptidome krvi izvijestio niz potpis peptida u serumu koje su istakli zdrava od pacijenata oboljelih od raka (prikaz u [5]). To su pokazale za prostate, mjehura, dojke i raka štitnjače od Villanueva i sur
[10], [11]. Oni su izvijestili 61 potpisa peptide koji bi mogao razlikovati zdrave pojedince od 3 različite vrste pacijenata oboljelih od raka. A svi od tih peptida i /ili njihovih fragmenata se normalno nalaze u serumu mogu se uočiti razlike u količini između zdravih i oboljelih ljudi. Međutim, iako ovi rezultati pokazuju potencijal da peptidome profili za dijagnozu raka, ona i dalje ostaje da se pokazalo da ovaj pristup može biti produžen za otkrivanje biomarkera za rano dijagnosticiranje i dosljedan nadzor. Prvo, sposobnost tih sera peptidnih biomarkera razlikovati pacijenata iz kontrolnih uglavnom pokazana kod pacijenata s visoko razvijenim ili metastatskih tumora. Štoviše, robusnost ovih biomarkera je izazvao; nekontrolirane varijable, uglavnom pripisati razlikama u postupanju uzorka za obradu protokola i analizu podataka, su pokazala da dramatično izmijeniti rezultate tih ispitivanja [11] - [19]. Stavljanjem veliki naglasak na stjecanju uzorka, rukovanje, obradu, preradu MS signala i statističke analize više robustan i ponovljivi rezultati mogu se postići [18], [20], [21]. Pregled

U ovom radu, usredotočili smo na otkrivanju niz potpis peptida koji bi mogli imati dijagnostičku vrijednost za rak želuca. Da bi se to postiglo, koristili smo tri različita izvora u serumu uključuju oboljelima od raka želuca u različitim fazama. Strogi protokol za prikupljanje i obradu seruma primijenjena [18], pomoću kohezivni postupak ekstrakcije peptida i MALDI-TOF čitanja, s modificiranom analize cjevovoda. Zajedno, poboljšana plinovod omogućio identifikaciju uzorka peptida koji diskriminiraju između raka i kontrolnih uzoraka. Ovi rezultati su potvrđeni na izvornom i novom seruma za tri identificirana značajki s uzorkom, apoC-I (dvije mogućnosti) i apoC-III, pomoću imuno-analiza. Zatim smo zaposleni razine u serumu od apoC-I i apoC-III u kombinaciji s CRP-a CA19-9 markera za diskriminirati bolesnika želudac adenokarcinoma od kontrole raka-free. pregled

materijali i postupci

Serum žetvu i rukovanje pregled

Serumi su dobiveni od dviju komercijalnih izvora. 79 uzoraka seruma iz pre-operation pacijenata oboljelih od raka želuca i 33 uzoraka seruma od raka, bez usporednih nadzora (uključujući 10 gastritisa bolesnika) sakupljeni su RNTech (Pariz, Francuska) u Rumunjskoj. Sera rak oblik i bolesnici rak ne uzeti su nakon noći posta na sljedeći način: 5 ml krvi je nacrtan u epruvetu vacuette seruma (MačkaLj005, Greiner Bio One, Kremsmuenster, Austrija) i ostavi da se zgruša oko 30 minuta, nakon čega se cijev centrifugira na 3000 okretaja u minuti na Hettich EBA 20-centrifugu (Hettich Ag, Tuttlingen, Njemačka) tijekom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Odvojeni serum podijeli u alikvote od 1 ml u sterilnim kriogene epruvete (Nalgene, Rochester, NY, USA) i odmah zamrznuti na -70 () ° C. 22 prije operacije raka želuca sera i 21 kontrola su sakupljeni Asterand u SAD-u (Detroit, MI, USA) na sljedeći način: 10 ml krvi uvučen u BD Vacutainer SST plus plastične cijevi (mačka #BEC 367.985, BD San Jose, CA, USA). Cijev se prevrtanjem promućka ga 5 puta i ostavljena da se zgruša na oko 30 minuta, u vertikalnom položaju. Ovaj je korak nakon čega slijedi centrifugiranje 1,100-1,300 g kroz 10 minuta na sobnoj temperaturi. Odvojeni serum podijeli u alikvote od 1 ml u sterilnoj kriogene epruvete (Nalgene) cijevi i odmah zamrznuti na -70 () ° C. Za izvor Asterand, post podaci nisu sakupljena je na bilo koji od krvi privlači u svoje banke. Uzorci seruma iz obje tvrtke su prebačene na suhom ledu i uskladišten kod (-70) ° C odmah po dolasku. Sera uzorci stavljeni su na led oko sat i pol, 50 ul se podijeli u lo-vežu cijevi (Eppendorf, Hamburg, Njemačka) i odmah ponovno zamrznuti na -70 () ° C. Svi alikvota uzorka su pohranjeni na -70 () ° C do obrade. Treći izvor seruma je dobiven u našem laboratoriju od 12 oboljelih od raka, bez izraelske kontrole. Krv je uzimana s markom cijevi koriste RNTech (CatLj005, Greiner Bio One) i postupanje u serumu slijedi postupak RNTech. Serum dobiven u našem laboratoriju su uzeti iz ne-posta pojedinaca. Oba RNTech i Asterand tvrtke uspostavile i provode svoje aktivnosti sljedeće regulatorne i etičke standarde, provedba lokalnih, nacionalnih, europskih, američkih i međunarodnih pravila i preporuke (UN) osobito kada se primjenjuje na biološke prikupljanje materijala i obrade i iskorištavanja rezultata istraživanja. To uključuje i pismenu suglasnost svaka doprinosi pacijenta na biološke i banke podataka, te pismeno odobrenje studija iz etičkog povjerenstva svakog kliničkog zavoda pridonosi uzoraka u tvrtki banaka. Pregled

Serum za obradu uzoraka i priprema za MS- MALDI čitanje pregled

Svaki uzorak seruma obrađen u dva do tri ponavljanja (od identičnih alikvota i na zasebnim slučajnim datume). Peptidi su izdvojeni na kuglicama obloženim C8, isprana, isprano, pomiješana s CHCA matricom, i odlaže se na MALDI ciljne ploče. Serumi su obrađeni u ponavljanja i deponiran na MALDI pločicu u duplikate. Za detaljniji opis pogledajte File S1. Pregled

Analiza podataka o MALDI rezultira pregled

Obrada podataka izvršena je u dva koraka. U prvom stupnju, neki matrica intenzitet je izvedena iz sirovih ASCII datoteka MALDI-TOF čitanja iz svih izvora sera uzorka pomoću ponovno uzimanje uzoraka, poravnavanja, i otkrivanje m /z maksimumi, kako je opisano u Villanueva sur pregled [21]. U drugom koraku, strojno učenje se koristi za definiranje razlikovnu uzorak koji se može koristiti za klasifikaciju pacijenata. Za ovu svrhu, postupak je opisan u Villanueva sur pregled [21] je modificirana kako je opisano u nastavku. Modificirani cjevovod se u potpunosti oslanja na open source softvera i dodatne pojedinosti opisane su u poglavlju bioinformatike u File S1. Pregled

(1) Doda se repliciraju zbrajanje i imaju filter korake kako bi uzeti u obzir nula vrijednosti kao posebne slučajeve. Naša izvorna matrica sadrži znatnu količinu nula vrijednosti za različite mogućnosti u različitim uzorcima. Zbog općeg ograničenja MALDI tehnologije, značajan dio tih nula vrijednosti može predstavljati vrijednosti koje nedostaju, a ne pravi nula intenziteta. Za djelomično riješili problem ograničenja čitamo svaki uzorak u ponavljanja, a izračunava se prosječni intenzitet, ignorirajući nula čitanja intenziteta. Nakon ovog replicirati sumiranje je rezultiralo matrica sadrži još znatnu količinu nula vrijednosti. SVM-based modeli mogu klasificirati prema nula vrijednosti predstavljaju vrijednosti koje nedostaju i nisu pravi nula intenzitetima. Dakle, filtrira se kroz značajke koje još uvijek ima nula vrijednosti u barem jednom od uzoraka. Niti jedan od tih ukloniti značajke imala jasnu prednost od nula vrijednosti do određenog kliničkog raspoređivanja u grupe. Nastala pod-matrica se koristi u stroju za učenje klasifikaciju. Pregled

(2) razvijen je novi pristup imaju izbor parametrizaciju. Definicije za SVM-based analize su u početku kako slijedi: RNTech želudac vs RNTech kontrole, Asterand želudac vs Asterand kontrole. Mann-Whitney p-vrijednost je izračunata za svakog vrha prema kliničkim skupine definirane za analizu. Mi smo tada koristili Mann-Whitney p-vrijednosti i intenzitetu pikova odrezanim trapericama odabrati podskup značajke (vrhovi) za korištenje u pokusima strojnog učenja. Intenzitet prekidni nije filtrira uzoraka u kojima je barem jedan prosjek čitanje imala jačinu iznad prekinuta na vrh testiranih. Filtriranje vrijednosti su optimizirane za najbolje performanse u SVM-based klasifikatora (u produkciji LIBSVM, linearno kernel) u skladu s deseterostruko unakrsna validacija u dva koraka protokol. Prvi korak je definirano u rasponu pretraživanja i intervale za oba filtera i ponavljanjem nad sve kombinacije. Zatim, drugi korak odabrali kombinaciju vrijednosti, koje pružaju najbolje performanse i najmanji broj mogućnosti. Pregled

(3) normalizacija korak je upisan u kontrolu za cross-uzoraka i cross-eksperiment predrasuda. Za usporedbu i odabir značajki koje pokazuju slične trendove u oba izvora Sera izvora ', cross-source normalizacija intenziteta izvedena je pomoću R funkcije "kvantilnih" definirati 9 pragovi X _{1
. 9
da podijelite smanjenih vrijednosti u kontrolnoj razredu u 10 kvantilima.}

Dodatne metode bioinformatičkih su u File S1.

Immuno-based poslovnih i klinički testovi za različitih apolipoproteina

Otk-III i apoB 100 razina izmjerene su Immunoturbidometry na Olympus 400 autoanalizatoru, pomoću K-pribore za analizu (mačka # KAI-006 i 6142, Kamiya biomedicinskih, Seattle, WA, USA) kao što je opisano [22]. U kući ELISA za apoC-III je opisano u File S1. Razine Otk-I su ispitani pomoću AssayMax ljudski apolipoprotein C-ja ELISA kita (Assaypro, St. Charles, MO, USA) prema uputama proizvođača. Pročišćeni ljudski standardi Otk-ja bili uključeni u kompletu. Pregled

Rezultati

Korištenje MS-based metode identificiranja serumu peptida potpisa za rak želuca pregled

Prethodne studije su pokazale da je dobro -designed i pažljivo kontrolirana sera peptidomics može odvojiti posebne pacijenata oboljelih od raka koji nose i kontrole bez raka temelje se na prepoznatljivim uzorcima potpisa peptida u serumu [10], [11]. Istraživali smo da li su ovi rezultati mogu se reproducirati za rak želuca i da li takvo odvajanje je dovoljan za analizu seruma iz različitih izvora. Prvo smo analizirali serum peptidnih profile 62 pacijenata rak želuca u različitim fazama, te 41 kontrolni serumi iz zdravih dobrovoljaca. To serumi dobiveni su iz dva izvora: (i) RNTech, tvrtku koja prikupljene seruma u Bukureštu, Rumunjska; i (ii) Asterand, tvrtka koja prikupljaju seruma u SAD-u. Za svaki izvor, serumi su prikupljeni pomoću jednog standardnog klinički protokol. Protokoli su usporedivi primjer tip cijevi, vrijeme zgrušavanja i inicijalni zamrzavanje seruma (vidi Metode), a povlačenje cijevi krvi su različite. Raspodjela dob, spol i kliničke karakteristike od 103 pojedinaca uključenih u ovu studiju su navedeni u tablici 1 i detaljnije File S1. Sažetak kliničkih stadija raka dobivena iz želuca seruma na oba izvora prikazan je u tablici 1. držanje uzoraka nakon početnog Zbirka ujednačen, uključujući 2 ciklusa zamrzavanja-topljenja ostvariti primarne pohrane i zatim alikvotiranje za ekstrakciju peptida i MS analize. Svi 103 serumski uzorci obrađeni su ručno, ali jednako upotrebom jednog koraka ekstrakcije reverzne faze. Sera uzoraka i uzorak ponavljanja su obrađeni i pročitao nasumce na različite datume kako biste izbjegli pripreme Datum povezane pristranost. Sve pripreme sera i taloženje je izvedena od istog pojedinca. Slično tome, svi MALDI čitanja su izvedene od strane istog tehničar. Osjetljivost MALDI-TOF instrumenta praćena je rutinski i stalno kalibriran tijekom svih očitanja. pregled

Analiza MS-based sera peptidome otkrila 9-peptid potpis koji razlikovati pacijente želudac adenokarcinoma od raka slobodnih kontrola

ukupno 637 masovnih vrhova (features) identificirani su u 103 istraživanih uzoraka u. Rezultati MALDI pretvaraju se matriksa koji sadrži signalne intenzitete 637 masenih vršaka (značajke) za svaki od ispitivanih uzoraka seruma s replikata za svaki uzorak (vidi metoda bioinformatika). Iako bez nadzora hijerarhijska grupiranje koristiti sve značajke nisu odvojile od raka i ne-raka uzoraka, PCA analize svih mogućnosti za svaki izvor sera diferencirani između raka i uzorcima ne-raka (Slika S1-S3). Pretpostavlja se da je značajka filtriranja i izbor je bitno prije zapošljava strojnog učenja temelji na klasifikaciju. Stoga (i) primjenjuje korak značajka filtriranja i selekcije i (ii) zaposleni Mann-Whitney p-vrijednosti i intenzitetu pikova razgraničenja odabrati podskup značajke (vrhovi) za korištenje u pokusima strojnog učenja. (Vidi metode, bioinformatika). Zatim smo analizirali unutar svakog izvora (RNTech i Asterand) da li serumi bolesnika i kontrola mogu biti odvojeni. Dobili smo dobre rezultate za svaku od jednog izvora klasifikatora; SVM-based klasifikatora za RNTech i Asterand imala 90,0% i 93,0% predviđenog točnosti, odnosno, u skladu s deseterostruko unakrsnog vrednovanja trening seta (Tablica 2). Random miješanje članova grupe rezultiralo znatno većim p-vrijednosti (npr 0.8) i niskim predvidjeti točnosti obučeni modela po svakom izvoru sera. To ukazuje na važnost kliničkih uvjeta za razvrstavanje u dvije klinički definiranih skupina unutar svakog izvora sera. Međutim, single-source klasifikatori nije dobro izvoditi na na drugi izvor uzorcima, predviđajući točno klinički status tek u 35/60 uzoraka (Asterand na RNTech) i 25/43 (RNTech na Asterand) (Tablica 2). Dakle, izvor pristranosti peptidome ima značajan utjecaj na točnost predviđanja. Pregled

Nesposobnost modela obučenih o jednom izvoru na odgovarajući način predvidjeti kliničke uvjete iz čitanja iz drugog izvora (Tablica 2A) se bolje predstavili prilikom provjere značajke odabrani od strane izvornih specifične klasifikatora (tablica 3). Neke od značajki koje su radili i na jednom izvoru pokazali suprotan trend na drugog izvora. Drugi su bili važni za razvrstavanje u jednom izvoru, ali je imao mali ili nikakav učinak na druge. Ova zapažanja nas je na temelju komparativne analize podataka iz oba izvora. proizveli smo kutija parcele za sve maksimalnih intenziteta, u skladu s kliničkim skupinama. Ove parcele je pokazala da kada se uspoređuju kontrole i raka intenziteta za svaku značajku unutar izvora, trend promatra mogu razlikovati između dva izvora (npr m /z 1520, Slika 1A). Čak i kada je trend bio uporan u oba izvora, vrijednosti intenziteta mogu biti različiti (npr m /z 6431; RNTech veći od Asterand, Slika 1B). Da bi se stvorio model predviđanja, morali smo (i) Odbaci source-specifične fenomene, i (ii) dodati normalizacije korak koji će smanjiti utjecaj različitih razina intenziteta, gdje se održava trend. Pregled

korištenje miješanog skupa podataka s Mann-Whitney p-vrijednosti prekidom za izbor značajki može odbaciti source-specifične fenomene. Vrhovi koji su pokazali različite trendove u različitim izvorima ne bi bio značajan u mješovitoj set za kliničku odvajanja grupe bazi; Značajka 1520 manifestira suprotan trend među izvorima, bio je izabran od strane svakog pojedinog izvora klasifikatora (Slika 1A, Tablica 3). Stoga je doprinio nedostatak uspješno djelovanje svakog jednog izvora klasifikatora na drugog izvora (Tablica 2). Kao što se očekivalo, ova značajka je izabran od strane bilo kojeg modela na temelju mješoviti set. imali smo mješovito skup podataka, a slučajno uklanjanje 21 uzoraka raka želuca s mješovitim seta treninga, a koristi se tih 21 uklonjene uzoraka za provjeru valjanosti. Osim toga, koristili smo 12 raka bez uzorke kontrolne prikupljenih u našem laboratoriju kao samostalna set kontrola valjanosti. Model je izabran u skladu s maksimalno predvidio točnosti u skladu s deseterostruko unakrsna validacija, kao i prije. Najbolji bodovanja model za mješoviti set je korištenjem 9 mogućnosti (Mann-Whitney p-vrijednost filter 0.044) i imao predviđenu točnost 84,1% prema deseterostruko unakrsnog vrednovanja trening seta. Važnije, točno predvidjeti 10/12 izraelske kontrole. Međutim, to klasifikatora predvidio neadekvatno (13 od 21) u 21 uklonjene uzorci raka mješoviti u trbuhu koji se koriste za provjeru valjanosti. Pregled

Stoga, kako bi se smanjio učinak izvora vezanih uz razlike u razinama intenziteta, izvedba filtera da u odabiru značajka poboljšana uvođenjem kvantilnih korak normalizacije. Ovaj normalizirajući provedeno je prema kontrolama svaki izvor seruma neovisno od drugih izvora (vidi metoda bioinformatika). Za značajke, kao što su m /z 6431 sa uporni trend u oba izvora, ovaj korak ispravio pristranost intenziteta (Slika 1D). Doista, 6431 značajka nije izabran za ne-normalizirana mix-based klasifikatora. Međutim, što je odabrana za normalizirane mix bazi klasifikatora (Tablica 3). Ipak, za značajke kao što su m /z 1520 sa suprotnim trendovima u oba izvora, ovaj korak nije mogao promijeniti taj trend, kako se i očekivalo (slika 1C). Pregled

Mi smo testirali učinak na kvantilnih normalizacije tako što ga primjenjuju prije prosjeku i izbor svojstava. Da bi se bolje procijeniti točnost predviđanja smo zaposleni u Matthews Koeficijent korelacije (MCC) mjere. MCC koristi u strojnom učenju kao mjera kvalitete binarnih (dva razreda) klasifikacije i vraća vrijednost između -1 i +1. Koeficijent +1 predstavlja savršen predviđanja, 0 prosječan slučajni predviđanja i -1 obrnuti predviđanja. MCC općenito smatra uravnoteženim mjera koja se može koristiti čak i ako su razredi su različitih veličina. tako smo izračunali MCC za razne eksperimente klasifikacije kako bi se pokazalo da je učinak normalizacije imala na klasifikaciji. Rezultati su prikazani u tablici 2. Imajte na umu da bez normalizacije, MCC je relativno visoka za trening seta, ali je pokazivala osrednji nastup na setu validacije (Tablica 2). Korak normalizacije dao slične visoke vrijednosti MCC za obuku i setovi validacije (tablica 2). Korak normalizacije za kontrolu cross-source pristranost nije poništiti potrebu za strojno učenje se temelji razvrstavanje definiranja razlikovnu uzorak; PCA od dva izvora-mješovitim normalizirala skupova podataka opet rezultira slabom razdvajanje od raka želuca i kontrolnih uzoraka (Slika S4). Pregled

Immuno-based valjanosti za značajke koje predstavljaju Otk-I i Otk-III pregled

klasifikator proizlazi iz mješovitog skupa podataka, nakon kvantilnih korak normalizacije, zaposlen 9 značajke (tablica 2). Tri od 9 značajki uključenih apolipoproteina: apoC-III (igrani 9443) i apoC-I (Features 6431 i 6629, Tablica 3). Kako bi se dodatno potvrditi rezultate MALDI-based, prvo smo razvili ELISA test za kvalitativno otkrivanje apoC-III u serumu (vidi metoda) i ispitani svi uzorci seruma iz Asterand i RNTech. Rezultati za ELISA test slijedi trend MALDI rezultata (slika 2a, b); Intenzitet apoC-III bila je značajno viša u kontrolnim skupinama u odnosu na skupine od raka u oba izvora Sera. Mi i dalje ispituju povezanost Otk-III ELISA i 9443 MALDI rezultata po svakom uzorku; ELISA i MALDI rezultati pokazuju značajnu korelaciju (p < 0.0001, Kendall je Ran korelacija tau). Zatim smo poslali alikvota sera iz gotovo svih uzoraka (isti zamrzavanje državnih) na vanjski kliničkom laboratoriju za immunoturbidity bazi kvantitativne analize za apoC-III [22]. Rezultati su dobiveni u mg /dl (Slika 2C) i kao što je gore, količina apoC-III bila je značajno viša u kontrolnim skupinama oba izvora Sera. Pregled

Kako bi se potvrdilo rezultate Otk-ja MALDI, zaposleni smo reklamu kvantitativni ELISA kit koji uključuje standarde Otk-i i prepoznaje oba 6431 i 6629 varijante apoC-i. Rezultati su dobiveni u ug /ml (Slika 3b) i slijedio obrazac opažen za MALDI rezultata (slike 1D i 3a); Intenzitet Otk-ja bila je značajno veća u kontrolnim skupinama u odnosu na skupine od raka u oba izvora Sera. Za procjenu specifičnost apoC-I i smanjenje Otk-III u serumu u želucu pacijenata oboljelih od raka nose, izmjerili smo apoB-100 razinama. Uzorci testiraju na apoC-III u vanjskom kliničkom laboratoriju su testirani paralelno apoB-100 razina koristeći immunoturbidity bazi kvantitativnog ispitivanja. Rezultati su dobiveni u mg /dl (slika 3c) i ne pokazuju značajne trend između raka koje nose kontrolne i želuca grupa. Dakle, mogli bismo iskoristiti apoB 100 rezultata kao normalizirajućih faktor za analizu Bioinformatika kvantitativnih Otk-I i Otk-III rezultata (slike 3C, 3B, 2C, respektivno). Pregled

Analizirali smo klinički Otk-ja, Otk-III i apoB-100 za dodatne uzorke od pacijenata oboljelih od raka želuca i kontrola raka bez (RNTech izvora, isto smrznutog-države, uključujući i 10 gastritis bolesnika u kontrolnoj skupini bez raka, imajte na umu Tablica 1 za ukupno uzorak brojevi). Također smo analizirali klinički CA19-9 i CRP razina za sve uzorke (isto zamrzavanjem državnih). tada korišten klementine 10,0 softver na uzorcima RNTech da ocijeni je li pravila postavljena na temelju ApoB-100-normalizirana Cl i C-III, CA19-9 i CRP nivoi mogu se koristiti za klasifikaciju između seruma kontrolnih i raka želuca skupina RNTech izvor kao izvor za vježbanje. Kombinacija svih parametara 4 dobije se bolja točnost predviđanja u odnosu na kombinaciju manje od 4 parametra (slika 4 i podaci nisu prikazani). Predviđanje točnost trening seta bio je 88,4%. zaposleni smo RNTech-dobivenih pravila postavljena za Asterand izvora i predviđanja točnost bio 74,4% (Slika 4). Za oba treninga i validacije osjetljivost bila odlična (87/90 kombinirani), ali je specifičnost bila je manje točna (37/52 kombinirani). Pregled

Rasprava pregled

U posljednjih nekoliko godina, vrlo malo izvještaja koji opisuje MS-identificirani seruma biomarkera /potpisi za kancerogenih stanja su dokazali u krivu [5], [18]. Različiti izvori pristranosti opisani su, uključujući odabir uzorka, rukovanje, obradu, čitanje i analizu [18], [20], [21]. Nakon uklanjanja pristranosti-pridonoseći čimbenici, pokazalo se da je SELDI-TOF MS cijeli serum proteomic profiliranje s IMAC površine nije pouzdano otkrivanje raka prostate [23]. Stoga su autori predložili da je malo vjerojatno da će masene spektrometrije pristup pomoću neprerađeni serum bi razlikovati između muškaraca sa i bez raka prostate [24]. S druge strane, drugi nedavni MALDI-TOF-based studija koje izbjegavati pristranost-pridonoseći čimbenici i zaposleni jedan korak tehnike za obradu sera identificiran diskriminirati biomarkera potpisa za različite oblike raka, uključujući rak prostate [11]. Pregled

U ovom studija usvojili smo jedan korak obrade sera pristup za identifikaciju peptidome bazi potpis na razlikovanja serum dobiven iz želuca adenokarcinoma pacijenata u. Napravili smo razuman napor kako bi se izbjegle prethodno iskazane pristranosti faktori koji pridonose [18]. Analizirali smo serume dva biorepositories. Uočili smo da čak i kada serumi za rukovanje, obradu, MALDI čitanje i analiza su isti, analiza peptidome ima odstupanja zbog biorepository. Osim društveno-geografskim razlikama (Rumunjska i SAD-a kao izvor za uzorke u RNTech i Asterand, odnosno), izvor vezane uz odstupanje može biti s obzirom na brand vađenje krvi cijevi, koja se koristi u različitim biorepositories.

Nakon toga se koristi mješoviti uzorak set od dva izvora seruma za odabir značajki i dodao cross-source normalizacije korak kako bi se nadoknadila izvor pristranosti. Našli smo da (i) korištenje miješanog skupa podataka s Mann-Whitney p-vrijednosti prekidom za odabir značajki može odbaciti source-specifične značajke, i (ii) kvantilnih korak normalizacije pomaže za odabir (za strojno učenje) djelomično podudaraju značajke , u kojem se trendovi su suglasne između izvora, ali razina intenziteta razlikuju između izvora. Potreba za normalizaciju, kada se radi o uzorcima iz različitih izvora, već je prikazan na microarray bazi visoko protočan tehnologija [25]. Dobro je poznato da je varijacija u eksperimentalnim postupcima i nekontroliranim uvjetima (npr društveno-zemljopisno podrijetlo uzorka) može dovesti do sustavnih mjerenja pristranosti. Pregled

Nakon izmjene, uspostavili smo cross-source serum peptida potpisa za razlikovanje želudac oboljeli od raka od kontrola ne-raka. Tri od peptida odgovara apoC-I i apoC-III. ovjeren smo naše MALDI-based rezultate s nezavisnim analitičkim metodama koje se temelje na imuno pretraga [26]. Peptid potpis uključen Otk-III i Otk-I-izvedene značajke. Rezultati iz nezavisnog kvantifikaciju njihovih razina u serumu slijedi trend koji je identificiran pomoću MS pristupa. Pregled

Naša studija je prva koja je izvješće koje razine u serumu apoC-I i apoC-III može se koristiti kao potencijalni biomarkeri za želudac Rak. Istina je da su nedavna izvješća pokazala da je razina apolipoproteina 'u krvi može biti potencijalni biomarkeri za različite oblike raka. Otk-ja je identificiran kao potencijalni serumu biomarker za rak debelog crijeva, hormonima vatrostalne raka prostate i jetrene fibroze [27] - [29]. Ostala izvješća ukazuju da Otk-III također može biti potencijalni biomarkera u rak gušterače i raka dojke [30], [31]. Međutim, sve ove izvještaje zaposlenih MALDI-based probir i nisu potvrdili svoje rezultate s imuno-based ili drugim testovima. Niti uče serume iz još jednog izvora kao validacije grupi. Pregled

Naša otkrića treba dalje potroše i potvrđena kao što je opisano [32], [33]. Međutim, klinička validaciju apoC-I i apoC-III dovodi potiču nas za daljnje istraživanje dijagnostički test temelji se na serumske biomarkera koji mogu biti testirani u klinici, bez potrebe za MS tehnologiju. Pravila postavljaju pomoću apoB-100-normalizirana C-I i C-III, CA19-9 i CRP kvantitativne razine u serumu je generirana za izvor RNTech i validirani na nezavisnoj Asterand izvora imala točnost predviđanja od 88,4% i 74,4%, respektivno. Stoga upotreba tih 4 kliničkih značajki djelomično nadilazi izvor pristranosti.