flusso fenilalanina e lo svuotamento gastrico non sono influenzati dalla sostituzione di caseina con proteine del siero nella dieta dei gatti adulti che consumano piccoli pasti frequenti
Abstract
sfondo
Diminuendo il tasso di proteine svuotamento dello stomaco può migliorare l'efficienza di utilizzo di aminoacidi alimentari per deposizione di proteine. Alcuni studi su ratti e gli esseri umani hanno dimostrato caseina per essere rilasciato più lentamente dallo stomaco di proteine del siero. Per verificare se la caseina induce un tasso più lento di svuotamento gastrico nei gatti di proteine del siero, L- [1-
13C] fenilalanina (Phe) è stato somministrato per via orale in 9 gatti adulti per stimare lo svuotamento gastrico e Phe flusso di tutto il corpo.
Risultati
concentrazioni di aminoacidi indispensabili nel plasma non sono stati influenzati in modo significativo da fonte di proteine nella dieta. First-pass di estrazione splancnico di Phe non era differente tra diete e una media di 50% (SEM = 3,8%). Il tempo di mezzo per lo svuotamento gastrico in media 9,9 minuti con caseina e 10.3 min con proteine del siero di latte, e non era significativamente differente tra le diete (SEM = 1.7 min). flussi di fenilalanina erano 45,3 e 46,5 mmol /(min · kg) per caseinati e le diete a base di siero, rispettivamente (SEM = 4,7 mmol /(min · kg)).
Conclusioni
in gatti adulti alimentati piccoli pasti frequenti , la sostituzione della caseina con proteine del siero nella dieta non influisce fornitura o utilizzazione di aminoacidi. Queste due proteine del latte sembrano essere ugualmente in grado di soddisfare le esigenze alimentari di aminoacidi di gatti.
Parole
Cat Lo svuotamento gastrico caseina del siero proteine fenilalanina Sfondo flusso
gatti sono carnivori obbligati e richiedono un alto livello di proteine nella dieta per mantenere l'equilibrio di azoto, rispetto alle specie onnivore ed erbivori [1]. Questo alto requisito è dovuto a tassi più rapidi del catabolismo degli amminoacidi. La velocità con cui proteine alimentari viene svuotato dallo stomaco all'intestino tenue per assorbimento può influenzare la velocità del catabolismo degli aminoacidi e, quindi, la capacità di soddisfare elevato fabbisogno proteico del gatto. Caseina e il siero di latte sono stati designati proteine Slow e rapido svuotamento rispettivamente, in altre specie. Daniel et al. [2] hanno riportato un primo tempo medio di 78 min per lo svuotamento gastrico di sospensioni caseina nel ratto, rispetto ai 21 min per siero. Il tasso di svuotamento più lento di caseina alimentare può portare alla consegna meno accelerata e più prolungato di aminoacidi per tessuti periferici per la deposizione di proteine del corpo [3]. Al contrario, il rapido aumento dell'assorbimento aminoacido dal siero comportato significativamente maggiori perdite ossidative di aminoacidi indispensabili nell'uomo [3]. Tuttavia, Calbet e Holst [4] non hanno trovato differenze di svuotamento gastrico di caseina rispetto sospensioni di siero di latte in esseri umani, suggerendo che il lento denominazione veloce rispetto non è coerente. Queste differenze possono essere il risultato della assunzione totale di proteine, frequenza proteine e macronutrienti accompagnamento sono alimentati, la forma in cui sono inclusi nella dieta, oi metodi di trasformazione che queste proteine sono esposti. Inoltre, le perdite ossidative di aminoacidi indispensabili possono avere meno di un effetto sulla deposizione di proteine nei gatti di onnivori perché i gatti di solito nel catabolismo gran parte della loro assunzione di aminoacidi nella dieta indipendentemente dalla frequenza di alimentazione [5].
A nostra conoscenza, gli effetti delle proteine veloce lento vs. non sono state studiate nei gatti. Per verificare se la caseina induce un tasso più lento di svuotamento gastrico nei gatti di proteine del siero, e, quindi, potrebbe essere un'aggiunta interessante per diete feline commerciali, abbiamo usato per via orale somministrato L- [1- 13C] fenilalanina (Phe) per stimare lo svuotamento prezzi e di tutto il corpo cinetica Phe in gatti adulti alimentati caseinati e le diete a base di siero di latte.
Metodi
gatti e abitazioni
Nove sterilizzati, specifici esenti da organismi patogeni, gatti a pelo corto domestici di proprietà di Procter and Gamble, Inc . (5 maschi e 4 femmine) sono stati utilizzati in questo studio. I gatti erano 9,5 ± 1,2 anni (media ± SE) e pesati 5.0 ± 0.4 kg. valutazione fisica standard da parte del veterinario che si occupa della salute generale di tutti i gatti è stata completata prima dell'inizio dello studio, e tutti furono ritenuti in buona salute. I gatti sono stati identificati per nome e microchip, e alloggiati in Procter &Gamble Pet Care, Pet Health e Nutrition Center, Lewisburg, OH, Stati Uniti d'America. Prima dell'inizio dello studio, i gatti erano acclimatati habitat collettivo nella colonia gatto che era un ambiente controllato in cui i gatti hanno avuto accesso solo al coperto. I gatti sono stati esposti a luce naturale e artificiale (0600-1800 h), la temperatura ambientale interna è stata mantenuta a 22 ° C, e le camere vengono pulite ogni giorno. I gatti sono stati alimentati una volta al giorno in gabbie individuali all'interno del loro gruppo di stanza abitazioni. Una volta che i gatti hanno completato la loro alimentazione sono stati messi giù nell'ambiente stabulazione in gruppo e tutti i gatti hanno completato la loro assegnazione giornaliera di cibo entro 5 ore. Se un cibo è stato lasciato dopo 5 ore, è stato pesato e vera assunzione di cibo è stato calcolato. Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dal P & G Pet Care cura degli animali e del Comitato Usa e in conformità con i requisiti USDA e AALAC. Segnalazione della metodologia in questo manoscritto aderisce alle linee guida arrivare. Design in Sperimentale
Lo svuotamento gastrico è stata stimata confrontando la cinetica di etichettato escursione Phe attraverso il plasma da un orale rispetto a una dose IV [6]. Il metodo produce anche le stime di estrazione di primo passaggio accanto al letto splancnico, e il flusso di tutto il corpo di Phe. Fenilalanina è un aminoacido indispensabile dietetico per la sintesi proteica e non è catabolizzata in misura tranne nel fegato dove viene convertito in tirosina, che può essere incorporato in proteine corpo o ulteriore catabolizzato nel fegato per produrre ATP o glucosio [ ,,,0],7]. A causa della sua bassa e contenuta catabolismo e piccole dimensioni della piscina, etichettato Phe è stato spesso usato come tracciante per misure di sintesi proteica e turnover negli animali [8]. , le condizioni a stato alimentato costante sono stati usati per semplificare i calcoli di flusso Phe. cinetiche endovenosa Phe sono stati misurati prima, e poi i gatti sono stati assegnati a caseinati e le diete a base di siero di latte in un disegno crossover per la valutazione della cinetica Phe orali.
Prima stima delle cinetiche IV Phe, tutti i gatti sono stati alimentati con una commerciale standard dieta degli adulti (Iams Multi-Cat, P & g Pet Care, Mason, OH) a 60 g /die una volta al giorno a 0700 ore per 7 giorni. Questo livello di assunzione storicamente comportato alcun cambiamento di peso in qualsiasi gatti ed è stato quindi utilizzato come il fabbisogno di energia metabolizzabile per il mantenimento del peso dei gatti su questo studio perché volevamo i gatti di mantenere, non perdere o guadagno di peso. Il giorno 8, dopo 18 ore di digiuno, cateteri Surflo (18 ga × 2 "; Terumo Medical Corp., Somerset, NJ) sono stati inseriti in una vena cefalica sotto Propofol sedazione (Hospira Inc., Lake Forest, IL). L'assegnazione cibo quotidiano è stato diviso in 24 piccoli pasti. Dopo due piccoli pasti sono stati alimentati con 15 minuti a parte, i campioni di sangue al basale sono stati raccolti dal catetere e poi un bolo di 12 mg /kg di peso corporeo L- [1- 13C] Phe (99% atomo 1- 13C) è stato somministrato per via endovenosa (IV) attraverso il catetere e lavata con soluzione salina eparinizzata. Da allora in poi, i gatti sono stati alimentati 1/24 della loro razione giornaliera di cibo ogni mezz'ora per mantenere uno stato di equilibrio fisiologico in cui la cinetica Phe non cambierebbe durante la sua misurazione. I campioni di sangue sono stati raccolti in provette eparinizzate circa 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 480, 600, e 720 minuti dopo il bolo IV. sono stati registrati volte campione reale. I campioni sono stati immediatamente centrifugati a 5000 rpm e plasma è stato congelato a -20 ° C per una successiva analisi. L'ematocrito è stata valutata ogni 6 th campione per assicurarsi che ematocrito non diminuì. Non sono i gatti sono stati rimossi a causa di un calo dell'ematocrito.
Dopo lo studio IV Phe, i gatti sono stati assegnati in modo casuale a caseinati isonitrogenous e isocalorica o diete a base di siero di latte (tabella 1) in un disegno crossover. I due a secco diete feline estruso (Tabella 1) sono state effettuate su un estrusore bivite (APV MPF-65, Baker Perkins Limited, Regno Unito) con condizioni di condizionamento, di estrusione, essiccazione e lavorazione di valorizzazione sapore simile e standard. Entrambe le diete sono state formulate per soddisfare o superare Associazione degli agenti di controllo feed americani (Champaign, IL) raccomandazioni e sarebbe considerato "completo e bilanciato" per gatti adulti. I gatti sono stati mantenuti nelle diete per 23 giorni, e alimentati 30 g in 0700 e 1500 h al giorno. Nei giorni 21 e 23, 5 e 4 gatti, rispettivamente, sono stati sottoposti ad un protocollo orale cinetica Phe secondo il protocollo IV sopra descritto, dove 12 mg /kg BW L- [1- 13C] Phe è stato somministrato oralmente siringa. I gatti sono stati successivamente alimentati con la dieta standard per 7 d, passati alla dieta sperimentale opposta per 21 e 23 giorni, e l'orale Phe protocollo cinetica è stata ripetuta. Assegnazione dei gatti a campionamento nei giorni 21 o 23 è rimasto lo stesso in entrambi i periods.Table 1 Ingrediente e la composizione chimica dei caseinati e le diete a base di siero (come nutriti base)
Ingredienti (%)
caseina
siero di latte
mais giallo
37,2
35,2
caseina
20,0
0
siero di latte
0
21.6
grasso di pollo
9,7
9.1
glutine di mais
6.1
6.2
pasto pollo sottoprodotto
10,7
10,7
pollo
5.0
5.0
polpa di barbabietola
2,4
2,4
proteine del pollo
1.4
1.4
fosfato bicalcico
1.04
1.05
grane Corn
0.95
0.96
riso di birra
0.94
0,96
Egg
0.81
0.82
lievito di birra
0,76
0,77
sodio bisolfato
0,76
0,77
cloruro di potassio
0.64
0.65
Il carbonato di calcio
0.64
0.65
sodio cloruro
0
0.48
minerale Premix1
0.42
0.42
cloruro di colina
0.20
0,21
L'olio di pesce
0.20
0.20
DL-metionina
0.12
0,12
La vitamina Premix2
0,09
0,09
contenuto di nutrienti analizzati (come Fed)
metabolizzabile energia (MJ /kg) 3
15,5
16.1
Dry Matter
81,3
82,6
Fat
15,4
17,1
grezza fibra
1.5
1.2
Ash
6.2
6.2 estratto
N-gratis
34.5
34,0
greggio Protein
33.7
34.0
Arginine
1.67
1.80
Histidine
0.76
0.62
Isoleucine
1.39
1.50
Leucine
3.34
3.41
Lysine
2.02
2.07
Methionine
0.97
1.00
Phenylalanine
1.54
1.15
Tryptophan
0.46
0.58
Tyrosine
1.33
0.95
Valine
1.74
1.72
1Mineral Premix conteneva:. 40,4% di potassio, 38,1% cloruro, 3 500 ppm di rame, 16 120 ppm di manganese, zinco 60 000, 420 ppm di iodio, 150 ppm di cobalto
2Vitamin Premix contenuta: 36 300 K UI /kg di vitamina A, 1 725 000 UI /kg di vitamina D3, 148 650 UI /kg di vitamina E, 22 575 ppm tiamina, 89 130 ppm niacina, 19 200 ppm piridossina, 25 935 ppm di acido pantotenico, 2430 ppm di acido folico, 189 ppm di vitamina B12, 5520 ppm inositolo, 54 000 ppm di vitamina C, 540 ppm biotina, 5940 ppm riboflavina.
3Calculated utilizzando coefficienti Atwater modificati (1).
procedure di analisi
concentrazioni di [ 13C] Phe nel plasma sono stati determinati con uno spettrometro a triplo quadrupolo di massa (API 4000; Applied Biosystems /MDS SCIEX, Concord, ON, Canada) accoppiato ad un sistema HPLC Agilent 1100 (Agilent, Mississauga, ON, Canada; LC-MSMS), come precedentemente descritto da Turner et al . [9]. Per la determinazione delle concentrazioni di aminoacidi, 25 ml di plasma sono stati mescolati con 200 ml di metanolo in provette da microcentrifuga. Questi sono stati centrifugati a 13.000 rpm per 5 minuti. Il surnatante è stato essiccato sotto flusso di N 2, ricostituito in acido 5 microlitri 0,1% formico in acqua bidistillata e acido formico 0,1% in acetonitrile, e sottoposto a derivatizzazione con isotiocianato di fenile e separazione mediante HPLC [10], [11 ].
contenuto di nutrienti delle diete sono stati determinati su campioni duplicato utilizzando i AOAC [12] procedure di sostanza secca (934,01), proteina grezza (990,03), aminoacidi (999.12), di acidi grassi idrolizzato (954,02), fibra grezza (969,33) e cenere (942,05). La concentrazione di estratto gratuito di azoto (NPC) è stata calcolata per differenza (NPC = 100 -. (Ceneri gregge + proteina grezza + acido grasso idrolizzato + fibra grezza)
Stima della cinetica degli isotopi
parametri della cinetica Phe e lo svuotamento gastrico sono stati stimati utilizzando i metodi descritti in precedenza per i cani [6]. per determinare il numero di compartimenti necessari per simulare l'eliminazione Phe dal plasma, singolo P
1
e
-
k
1
t
e doppio P
1
e
-
k
1
t
+
P
2
e
-
k
2
t
equazioni esponenziali sono stati montati al plasma [ 13C] concentrazioni Phe seguente IV dosaggio (P V (t)) utilizzando la funzione Risolutore di Microsoft® Office Excel® 2007 per ridurre al minimo le somme residue dei quadrati. fits Curve sono stati valutati in base alla radice della media errore di predizione quadrato (rMSPE) come percentuale del valore medio di P V (t), calcolato come: rMSPE
%
=
Σ
i
=
1
n
pre
d
I
-
ob
s
i
2
n
Σ
I
=
1
n
ob
s
i
n
,
(1) dove pred i è la previsione i-esimo, obs i è l'osservazione i-esima, ed n è il numero di osservazioni. Dato che le due equazioni contenevano un diverso numero di parametri (q), la decisione di cui all'equazione meglio si adattano i dati si è basata su criterio di informazione di Akaike (AIC), calcolato come: AIC
=
NLN
Σ
i
=
1
n
pre
d
i
-
ob
s
i
2
2
q
(2) volume di distribuzione Phe (vol) è stata calcolata dai valori dei parametri a muro come: vol.
=
IV
dosi
P
1
+
P
2
.
(3) simile alla nostra precedente scoperta nei cani [6], l'analisi identificato un modello a due compartimenti, come la soluzione migliore. Pertanto, plasma Phe è ipotizzato di scambiare reversibilmente con una piscina tissutale (Figura 1). Per stimare i parametri della cinetica Phe da curve di [ 13C] concentrazioni Phe seguenti somministrazione orale (P O (t)) del tracciante, lo svuotamento gastrico e l'estrazione di primo passaggio di [ 13C] phe accanto al letto splancnico sono stati considerati. Il modello somministrazione orale assume primo ordine, continuo svuotamento gastrico, 100% assorbimento post-gastrica e un'estrazione costante irreversibile (ex) del tracciante Phe al letto splancnico. equazioni differenziali per il sistema illustrato nella figura 2 sono: dG
dt
=
-
k
EMP
G
,
(4) dP
dt
=
k
EMP
G
1
-
ex
+
k
P
T
-
k
P
P
-
k
el
P
,
(5) e DT
dt
=
k
P
P
-
k
P
T
,
(6) Figura 1 [13 C] fenilalanina (Phe) diluizione trame. Plasma [13C] Phe stata misurata (▲) seguente (a) o endovenosa (b, c) la somministrazione orale di una dose di bolo di L- [1-13C] Phe in un gatto o un alimentato (b) caseinati o (c ) la dieta a base di proteine del siero. Le concentrazioni [13C] Phe sono stati previsti (linea continua), con un modello compartimentale.
dove G, P e T sono [ 13C] concentrazioni Phe in budello, plasma e nei tessuti, rispettivamente k emp è il costante di velocità per lo svuotamento gastrico, k P è la costante di velocità per lo scambio reversibile tra plasma e dei tessuti, e k el è la costante di velocità per l'eliminazione irreversibile dal plasma.
l'area sotto [ 13C ] Andamento della concentrazione Phe è legata alla dose di [ 13C] Phe iniettato nel pool di plasma e il suo tasso di gioco. pallone Supponendo è identico, il rapporto delle superfici osservata P O (t) (AUC O) e P V (t) (AUC V) curve è equivalente al rapporto di [ ,,,0], 13C] dosi Phe introdotti nella circolazione sistemica. Grazie alla anatomia vascolare, entrata di somministrazione orale [ 13C] Phe nella circolazione sistemica richiede che sfugge sequestro dai tessuti gastrointestinale ed epatica del letto splancnico, che coinvolge principalmente incorporazione nelle proteine secrete e Phe catabolismo. Dopo somministrazione endovenosa [ 13C] Phe non è sottoposto ad un primo passaggio di estrazione splancnico. Pertanto, il valore di ex per ogni gatto e la dieta è stata stimata dal rapporto tra AUC O per AUC V come: ex
=
1
-
AU
C
O
AU
C
V
,
(7 ) dove i valori di AUC sono stati stimati con il metodo trapezoidale.
per stimare k emp, k P e K el per ogni gatto e la dieta, soluzioni analitiche alle equazioni differenziali 4, 5 e 6 sono stati ottenuto con Maple 13 software (Waterloo Maple Inc. Waterloo, Canada) e dotato di Excel® Risolutore per O (t) le curve P osservato. Svuotamento gastrico primo tempo è stato calcolato come ln (2) /k emp. Tutto il corpo Phe flusso è stato stimato come il prodotto di k el, allo stato stazionario della concentrazione plasmatica Phe, e il volume di distribuzione media stimata da cinetica IV Phe (Eq 3) Analisi
. Statistica
differenze tra i modelli e le diete in bontà di attacchi e stime dei parametri sono stati valutati mediante analisi della varianza ad una via utilizzando PROC GLM di SAS (SAS versione 9.3; SAS Institute Inc, Cary, NC). Le variabili che non erano normalmente distribuiti erano naturali log-trasformati per ottenere P
-Valori. I valori di P
≤ 0,05 sono stati considerati significativi e 0,05 < P
≤ 0,10 sono stati considerati tendenze
. Risultati
corso protocolli di bolo Phe via endovenosa e orale, tutti i gatti sono rimasti sani, esposti consumi pieno di cibo e mantenuto le loro peso corporeo. A causa di blocco del catetere, la cinetica IV Phe non sono stati ottenuti per un gatto e risultati di questo animale non sono stati analizzati. Le concentrazioni plasmatiche di aminoacidi indispensabili negli ultimi 3 campioni raccolti durante 1 alimentazione /2-oraria delle diete (tabella 2) non erano differenti tra caseina e il siero di latte (P
> 0,31), anche se c'è stata una tendenza per la metionina ad essere più bassi (P
= 0,09) e Phe ad essere più elevato (P
= 0,12) con siero di latte. Degli amminoacidi superflui nel plasma, aspartato e glutammato erano più alti (P
< 0,03) sulla dieta a base di siero, mentre non sono stati colpiti altri (P
> 0,36) concentrazioni .table 2 amminoacidi ( μ M) nel plasma di adulti gatti
Amino acid
caseina
siero di latte
pool SEM
P
Alanine
654
678
48
0.74
Arginine
133
136
8
0.80
Aspartate
21
38
4
0.01
Citrulline
66
43
8
0.09
Cysteine
28
34
4
0.36
Glutamate
64
88
7
0.03
Histidine
134
122
11
0.45
Isoleucine
90
104
12
0.42
Leucine
174
187
13
0.50
Lysine
218
210
15
0.70
Methionine
139
73
22
0.09
Ornithine
49
56
5
0.38
Phenylalanine
87
103
7
0.12
Taurine
55
57
9
0.87
Tryptophan
103
108
15
0.83
Tyrosine
92
98
14
0.78
Valine
251
301
33
0.31
Indispensable Aminoacidi
1242
1123
81
0.37
Dispensable Aminoacidi
973
1005
65
0,74
totale Aminoacidi
2215
2114
150
0.67
dati sono mezzi 8-12 ore dopo l'inizio del consumo di caseinati o di diete a base di siero di latte in 30 minuti intervalli (n = 8).
Modellazione P V (t) curve con una equazione esponenziale doppia provocato inferiore rMSPE (P
= 0.04) e AIC (P
< 0,01) rispetto alla singola equazione esponenziale (Tabella 3). Valori più bassi indicano adatta meglio. Le stime del volume di distribuzione Phe non erano diversi tra le equazioni (P
= 0,15). Una misura meglio con due esponenti indica due scomparti per lo scambio Phe, che sono stati provvisoriamente identificato come pool di plasma e dei tessuti. costanti di velocità per il flusso dal plasma al tessuto (k PT) e da tessuto a plasma (k TP) sono stati stimati dai doppi attacchi esponenziali, secondo Shipley e Clark [13], come 0,037 ± 0,008 e 0,041 ± 0,016, rispettivamente. Poiché questi valori non erano significativamente differenti tra loro (P
= 0,77), si è ipotizzato che un singolo costante di velocità (k P) potrebbe essere usato per descrivere lo scambio bidirezionale tra plasma e nel tessuto (figura 2) . Di conseguenza, P O (t) curve sono state in forma con k P rappresenta plasma-tessuto exchange.Table 3 Fits di equazioni 1 e 2 esponente a concentrazioni plasmatiche di [13 C] Phe
1-exp
2-exp
pool SEM
P
rMSPE (% di media)
13,6
2.4
3.6
0,02
AIC
79,4
40,9
5.4
< 0,01
Phe volume di distribuzione (L /kg)
0.43
0.31
0.05
0.15
I dati sono mezzi da 8 curve. rMSPE, radice della media dell'errore di predizione piazza; AIC, criterio di informazione di Akaike; Phe, fenilalanina.
Figura 2 modelli compartimentali di distribuzione [13 C] fenilalanina seguenti per via endovenosa (IV) o per via orale (O) dosaggio. Scatole rappresentano variabili di stato, frecce rappresentano flussi, P rappresenta plasma, T rappresenta il tessuto, G rappresenta intestino, Kp è la costante di velocità per lo scambio reversibile tra il pool di plasma e dei tessuti, Kemp è la costante di velocità per lo svuotamento gastrico, ex è il primo passaggio l'estrazione splanchnic, e Kel è la costante di velocità per l'eliminazione irreversibile dalla circolazione.
Curve di P O (t) sono stati montati altrettanto bene tra le diete, senza differenze di AIC (Tabella 4). Non ci sono state differenze tra caseinati e le diete a base di siero di latte in k P, K el, o k emp. -Pass prima estrazione splancnico di Phe non era differente tra diete e una media del 50%. Peak P O (t) si sono verificati 18,0 e 19,6 minuti dopo orale [ 13C] dosaggio Phe per caseina e siero di latte diete, rispettivamente (dati non riportati). Il tempo metà per lo svuotamento gastrico media 9.9 min con caseina e 10.3 min con siero di latte, ma trattamenti dietetici non erano diversi tra loro. flussi di fenilalanina erano 45,3 e 46,5 mmol /(min · kg) per caseinati e le diete a base di siero, respectively.Table 4 parametri di cinetica Phe dopo somministrazione orale di una dose bolo di L- [1- 13 C] Phe
orale
pool SEM
P
caseina
siero di latte
rMSPE (% di media)
10,9
12.4
3.0
0,74
AIC
42,4
42,6
7.4
0.91
kp (/min)
0,039 0,063
Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.