flujo fenilalanina y el vaciado gástrico no se ven afectados por la sustitución de la caseína con proteína de suero en la dieta de los gatos adultos que consumen frecuente pequeño flujo meals

fenilalanina y el vaciado gástrico no se ven afectados por la sustitución de la caseína con proteína de suero en la dieta de los gatos adultos consumir comidas pequeñas frecuentes Resumen Antecedentes


la disminución de la tasa de proteína de vaciado del estómago puede mejorar la eficiencia de la utilización de los aminoácidos en la dieta para la deposición de proteínas. Algunos estudios en ratas y en humanos han demostrado la caseína que se libera más lentamente del estómago que la proteína de suero de leche. Para probar si la caseína induce una menor velocidad de vaciado gástrico en los gatos que la proteína de suero de leche, L- [1- 13C] fenilalanina (Phe) se dosificó por vía oral en 9 gatos adultos para estimar el vaciado gástrico y de todo el cuerpo de flujo Phe.
Resultados
Las concentraciones de aminoácidos indispensables en plasma no se vieron afectados significativamente por la fuente de proteínas en la dieta. De primer paso de extracción de esplácnica Phe no fue diferente entre las dietas y un promedio de 50% (SEM = 3,8%). El tiempo medio para el vaciado gástrico promedio de 9,9 minutos con caseína y 10.3 min con proteína de suero, y no fue significativamente diferente entre las dietas (SEM = 1,7 min). flujos de fenilalanina eran 45,3 y 46,5 mol /(min · kg) para la caseína y las dietas a base de suero, respectivamente (SEM = 4,7 mol /(min · kg)).
Conclusiones Hoteles en gatos adultos alimentados con comidas pequeñas y frecuentes , la sustitución de la caseína con proteína de suero en la dieta no afecta el suministro o la utilización de aminoácidos. Estas dos proteínas de la leche parecen ser igualmente capaz de satisfacer las necesidades de aminoácidos en la dieta de los gatos.
Palabras clave
gato vaciamiento gástrico: La caseína proteína de suero de leche fenilalanina Antecedentes flujo
Los gatos son carnívoros obligados y requieren un alto nivel de proteínas en la dieta para mantener el balance de nitrógeno, en comparación con las especies omnívoras y herbívoros [1]. Este alto requisito es debido a tasas más rápidas de catabolismo de los aminoácidos. La velocidad a la que la proteína dietética se vacía desde el estómago hacia el intestino delgado para la absorción puede influir en la tasa de catabolismo de aminoácidos y, por lo tanto, la capacidad de cumplir con el requisito de alta proteína del gato. La caseína y el suero se han designado las proteínas de lento y de vaciado rápido, respectivamente, en otras especies. Daniel et al. [2] reportaron una media promedio de tiempo de 78 minutos para el vaciado gástrico de suspensiones de caseína en ratas, en comparación con 21 minutos para suero. La velocidad de vaciado lento de la caseína de la dieta puede conducir a la entrega de menos acelerado y más prolongada de aminoácidos a los tejidos periféricos para la deposición de la proteína corporal [3]. En contraste, el rápido aumento de la absorción de aminoácidos de suero de leche como resultado significativamente mayores pérdidas oxidativas de los aminoácidos indispensables en los seres humanos [3]. Sin embargo, Calbet y Holst [4] no encontraron diferencias en el vaciado gástrico de la caseína vs suspensiones de suero de leche en los seres humanos, lo que sugiere que la designación rápida vs lenta no es consistente. Estas diferencias pueden ser el resultado de la ingesta total de las proteínas, la frecuencia de que las proteínas y macronutrientes acompañan son alimentados, la forma en la que están incluidos en la dieta, o los métodos de procesamiento que estas proteínas están expuestos. Además, las pérdidas oxidativas de aminoácidos indispensables pueden tener menos de un efecto sobre la deposición de proteínas en los gatos que los omnívoros porque los gatos normalmente catabolizar una gran proporción de la ingesta dietética de aminoácidos independientemente de la frecuencia de alimentación [5].
A nuestro conocimiento, los efectos de las proteínas rápidas lenta vs. no han sido investigados en los gatos. Para probar si la caseína induce una menor velocidad de vaciado gástrico en los gatos que la proteína de suero de leche, y por lo tanto podría ser una adición atractiva a las dietas comerciales felino, hemos utilizado administra por vía oral L- [1- 13C] fenilalanina (Phe) para estimar el vaciado tarifas y de todo el cuerpo cinética de fenilalanina en gatos adultos alimentados con caseína y las dietas a base de suero.
Métodos
gatos y vivienda
Nueve castrados,, gatos de pelo corto domésticos libres de patógenos específicos propiedad de Procter and Gamble, Inc . (5 varones, 4 mujeres) se utilizaron en este estudio. Los gatos fueron 9,5 ± 1,2 años (media ± DE) y se pesaron 5,0 ± 0,4 kg. Evaluación física estándar por el veterinario a cargo de la salud en general de todos los gatos se completó antes del inicio del estudio, y todos fueron considera saludable. Los gatos fueron identificados por su nombre y microchip, y se alojaron en el Procter and Gamble Pet Care, Salud de las mascotas y el Centro de Nutrición, Lewisburg, OH, EE.UU.. Antes del comienzo del estudio, los gatos se aclimataron a la vivienda del grupo en la colonia de gatos que era un ambiente controlado donde los gatos sólo tenían acceso interior. Los gatos fueron expuestos a la luz natural y artificial (de 0600 a 1800 h), la temperatura ambiental interior se mantuvo a 22 ° C, y las habitaciones se limpian a diario. Los gatos fueron alimentados una vez al día en jaulas individuales dentro de su habitación de alojamiento en grupo. Una vez que los gatos completaron su alimentación que se pusieron de nuevo en el entorno de alojamiento en grupo y todos los gatos completaron su asignación diaria de alimentos dentro de 5 horas. Si alguna comida fue dejado después de 5 horas, se pesó y se calculó la verdadera ingesta de alimentos. Todos los procedimientos fueron revisados ​​y aprobados por el P & G Pet Care Cuidado de Animales y el empleo y en cumplimiento con los requisitos de USDA y AALAC. Informe de la metodología en este manuscrito se adhiere a las directrices llegar.
Diseño experimental
El vaciado gástrico se calcula mediante la comparación de la cinética de la excursión Phe marcado a través del plasma de una oral frente a una dosis IV [6]. El método también produce estimaciones de extracción de primer paso por el lecho esplácnico, y el flujo de todo el cuerpo de Phe. La fenilalanina es un aminoácido indispensable dietético para la síntesis de proteínas y no se cataboliza en cualquier medida excepto en el hígado donde se convierte en el aminoácido tirosina, que puede ser incorporado en la proteína del cuerpo o más cataboliza en el hígado para producir ATP o glucosa [ ,,,0],7]. Debido a su baja y contenía el catabolismo y el tamaño pequeño de la piscina, con la etiqueta Phe a menudo se ha usado como trazador para la medición de la síntesis de proteínas y la rotación en los animales [8]. , condiciones de estado estacionario alimentado se utilizan para simplificar los cálculos de flujo Phe. cinética intravenosa de Phe se midieron primero, y luego los gatos fueron asignados a caseína y las dietas a base de suero en un diseño cruzado para la evaluación de la cinética de Phe orales.
Antes de la estimación de la cinética IV Phe, todos los gatos se alimentaron con una comercial estándar dieta del adulto (Iams Multi-Cat, P & g Pet Care, Mason, OH) a 60 g /día una vez al día a las 07:00 h durante 7 días. Este nivel de ingesta históricamente resultó en ningún cambio de peso en ninguno de los gatos y, por tanto, se utilizó como el requerimiento de energía metabolizable para mantener el peso de los gatos en este estudio ya que queríamos los gatos de mantener, no perder o ganar, de peso. En el día 8, después de 18 horas de ayuno, los catéteres SurFlo (18 ga × 2 "; Terumo Medical Corp., Somerset, NJ) fueron insertados en una vena cefálica bajo sedación Propofol (Hospira Inc., de Lake Forest, IL). La asignación diaria de alimentos se divide en 24 pequeñas comidas. Después de dos comidas pequeñas fueron alimentados con 15 minutos de diferencia, las muestras de sangre de línea base se recogieron desde el catéter y luego un bolo de 12 mg /kg BW L- [1- 13C] Phe (99% de átomos 1- 13C) se administró por vía intravenosa (IV) a través del catéter y se inundó con solución salina heparinizada. A partir de entonces, los gatos fueron alimentados con 1/24 de su ración diaria de comida cada ½ hora de mantener un estado de equilibrio fisiológico en el que la cinética de Phe no cambiarían durante su medición. Las muestras de sangre se recogieron en tubos heparinizados aproximadamente 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 300, 480, 600, y 720 minutos después del bolo IV. Los tiempos reales de la muestra se registraron. Las muestras se centrifugaron inmediatamente a 5000 rpm y el plasma se congeló a -20 ° C para su posterior análisis. El hematocrito se evaluó cada 6 ª muestra para asegurar que el volumen de la masa globular no disminuyó. No hay gatos fueron retirados debido a una disminución en el hematocrito.
Después del estudio IV Phe, gatos fueron asignados al azar a caseína isonitrogenado y isocalórico o dietas a base de suero (Tabla 1) en un diseño cruzado. Las dos dietas felinas extruidos secos (Tabla 1) se realizaron sobre una extrusora de doble husillo (APV MPF-65, Baker Perkins Limited, Reino Unido), utilizando las condiciones de acondicionamiento, extrusión, secado y procesamiento de la mejora del sabor y similares estándar. Ambas dietas fueron formuladas para cumplir o exceder Asociación de Oficiales Controladores de Alimentos Americanos (Champaign, IL) y recomendaciones serían considerados "completa y equilibrada" para gatos adultos. Los gatos se mantuvieron con estas dietas durante 23 días, y se alimentaron 30 g en 0700 y 1500 h al día. En los días 21 y 23, 5 y 4 gatos, respectivamente, fueron sometidos a un protocolo de cinética de Phe oral de acuerdo con el protocolo IV se ha descrito anteriormente, donde /kg BW L- [1- 13C] Phe se administró 12 mg por vía oral por jeringuilla. Los gatos fueron alimentados posteriormente la dieta estándar para 7 d, cambiaron a la dieta experimental opuesto durante 21 y 23 días, y se repitió el protocolo oral de la cinética de Phe. La asignación de los gatos a un muestreo en los días 21 o 23 sigue siendo el mismo, tanto en periods.Table 1 Ingrediente y composición química de caseína y las dietas a base de suero (como alimentado base)
Ingredientes (%) guía empresas La caseína del suero

maíz amarillo
37,2 35,2

caseína
20,0
0
de suero
0
21.6
grasa de pollo
9.7 9.1

harina de gluten de maíz
6.1 6.2

harina de subproductos de pollo
10,7 10,7

pollo
5.0
5.0
pulpa de remolacha
2.4
2.4
hidrolizado de pollo
fosfato 1,4
1.4
dicálcico
1,04 1,05

arenas de maíz
0.95
0,96
arroz de cerveza
0,94 0,96

huevo
0,81 0,82

la levadura de cerveza
0,76 0,77

sodio bisulfito
0,76 0,77

cloruro de potasio 0,64

0.65
El carbonato de calcio
0,64 0,65

cloruro de sodio
0
0,48
Mineral Premix1
0,42 0,42

El cloruro de colina
0.20 0.21

El aceite de pescado
0.20 0.20

DL-metionina
0,12 0,12

vitamina Premix2
0,09 0,09

contenido de nutrientes analizados (como Fed) guía empresas de energía metabolizable (MJ /kg) 3
15,5 16,1

Materia seca
81,3 82,6
sobre Fat
15,4 17,1

fibra bruta
1.5
1.2
Ash
6.2 6.2
extracto libre de N

34,5 34,0

crudo Protein
33.7
34.0
Arginine
1.67
1.80
Histidine
0.76
0.62
Isoleucine
1.39
1.50
Leucine
3.34
3.41
Lysine
2.02
2.07
Methionine
0.97
1.00
Phenylalanine
1.54
1.15
Tryptophan
0.46
0.58
Tyrosine
1.33
0.95
Valine
1.74
1.72
1Mineral Premezcla contenía:. 40,4% de potasio, cloruro de 38,1%, 3 500 ppm de cobre, 16 120 ppm de manganeso, 60 000 Zinc, Yodo 420 ppm, 150 ppm de cobalto
2Vitamin Premezcla contenía: 36 300 K UI /kg Vitamina A, 1 725 000 UI /kg vitamina D3, 148 650 UI /kg vitamina E, 22 575 ppm de tiamina, 89 130 ppm de niacina, 19 200 ppm de piridoxina, ácido 25 935 ppm pantoténico, ácido fólico 2.430 ppm, 189 ppm de vitamina B12, 5520 ppm inositol, 54 000 ppm de vitamina C, 540 ppm de biotina, riboflavina 5940 ppm.
3Calculated mediante el uso de coeficientes de Atwater modificados (1).
Los procedimientos analíticos
se determinaron las concentraciones de [ 13C] Phe en el plasma con un espectrómetro de triple cuadrupolo de masas (API 4000; Applied Biosystems /MDS Sciex, Concord, ON, Canadá) acoplado a un sistema de HPLC Agilent 1100 (Agilent, Mississauga, ON, Canadá; LC-MSMS), como se describe anteriormente por Turner et al . [9]. Para la determinación de las concentraciones de aminoácidos, 25 l de plasma se mezclaron con 200 l de metanol en tubos de microcentrífuga. Estos se centrifugaron a 13.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se secó bajo una corriente de N 2, reconstituida en 5 ácido l 0,1% fórmico en agua doblemente destilada y ácido fórmico 0,1% en acetonitrilo, y se somete a derivatización con isotiocianato de fenilo y separación por HPLC [10], [11 ].
el contenido de nutrientes de las dietas se determinaron en muestras por duplicado utilizando el método AOAC [12] procedimientos para la materia seca (934.01), proteína cruda (990.03), aminoácidos (999.12), ácido grasa hidrolizada (954.02), fibra cruda (969.33) y cenizas (942,05). La concentración de extracto libre de nitrógeno (NFE) se calculó por diferencia (ENF = 100 -. (Ceniza bruta + proteína cruda + ácido hidrolizado grasa + fibra cruda)
Estimación de la cinética de isótopos
parámetros de la cinética de Phe y el vaciado gástrico se calcula usando los métodos descritos anteriormente para perros [6]. para determinar el número de compartimentos necesarios para simular la eliminación de Phe a partir de plasma, única P
1 | e
-
k
1 | t
y doble P
1 | e
-
k
1 | t
+
P
2
e
-
k
2
t
ecuaciones exponenciales fueron instalados en el plasma [ 13C] concentraciones de fenilalanina, tras la administración IV (P V (t)) mediante la función Solver de Microsoft Office Excel 2007 para reducir al mínimo las sumas de cuadrados residuales. Se evaluaron ajustes de curva basada en el medio de la raíz cuadrada del error de predicción (rMSPE) como porcentaje de la media P V (t), calculado como: rMSPE
%
=
Σ
i
=
1 | n
pre
d
i
-
ob
s
i
2
n
Σ
i
=
1 | n
ob
s
i
n
, España (1), donde pred i es la predicción de orden i, obs i es la observación i-ésima, y ​​n es el número de observaciones. Debido a que las dos ecuaciones contenían diferentes números de parámetros (q), la decisión de qué ecuación se ajusten mejor a los datos se basó en el criterio de información de Akaike (AIC), calculado como: AIC
=
NLN
Σ
i
=
1 | n
pre
d
i
-
ob
s
i
2
2
q
gratis (2) el volumen de distribución Phe (vol) se calcula a partir de valores de los parámetros ajustados como: vol.
=
IV
dosis
P
1 | +
P
2
. gratis (3) al igual que en nuestra anterior conclusión en perros [6], el análisis identificado un modelo de dos compartimentos como el mejor ajuste. Por lo tanto, plasma Phe se supuso para intercambiar de forma reversible con una piscina de tejido (Figura 1). Con el fin de estimar los parámetros de la cinética de Phe a partir de curvas de [ 13C] concentraciones de Phe después de la dosificación oral (P O (t)) del trazador, el vaciado gástrico y la extracción de primer paso de [ 13C] Phe por el lecho esplácnico se consideraron. El modelo asume la dosificación oral de primer orden, el vaciado gástrico continua, 100% de absorción de post-gástrico, y una extracción constante irreversible (ex) del trazador Phe por el lecho esplácnico. ecuaciones diferenciales para el sistema que se muestra en la Figura 2 son: DG
dt
=
-
k
emp
G
, España (4) dP dt

=
k
emp
G
1
-
ex
+
k
P
T
-
k
P
P
-
k sobre El
P
, España (5) y dT dt

=
k
P
P
-
k
P
T
, España (6) Figura 1 [13 C] fenilalanina (Phe) dilución parcelas. El plasma se midió [13C] Phe (▲) siguiente (a) o intravenosa (b, c) la administración oral de una dosis en bolo de L- [1-13C] Phe en un gato alimentado ya sea a (b) caseína o (c ) dieta a base de proteína de suero. las concentraciones de [13C] Phe se predijo (línea continua) con un modelo compartimental.
donde G, P y T son [ 13C] concentraciones de fenilalanina en el intestino, plasma y tejidos, respectivamente, k EMP es la constante de velocidad de vaciado gástrico, k P es la constante de velocidad para el intercambio reversible entre el plasma y los tejidos, y k eL es la constante de velocidad de eliminación irreversible a partir de plasma. Francia el área bajo [ 13C ] curvas de concentración de Phe se relaciona con la dosis de [ 13C] Phe inyecta en la mezcla de plasma y su velocidad de eliminación. aclaramiento Suponiendo es idéntica, la relación de las áreas bajo observado P O (t) (AUC O) y P V (t) (AUC V) curvas es equivalente a la proporción de [ ,,,0], 13C] dosis de fenilalanina introducidas en la circulación sistémica. Debido a la anatomía vascular, la entrada de [ 13C] administrado por vía oral Phe en la circulación sistémica requiere que se escapa el secuestro por los tejidos gastrointestinales y hepática del lecho esplácnico, que implica principalmente la incorporación en proteínas secretadas y catabolismo Phe. administrado por vía intravenosa [ 13C] Phe no se somete a una extracción esplácnico de primer paso. Por lo tanto, el valor de ex por cada gato y la dieta se estimó a partir de la relación de AUC O para AUC V como: ex
=
1 | - sobre Au
C
O sobre Au
C
V
, España (7 ) donde los valores de AUC se calcula utilizando el método trapezoidal.
para estimar k emp, k P y K eL para cada gato y la dieta, las soluciones analíticas a las ecuaciones diferenciales 4, 5 y 6 eran obtenido con el software de arce 13 (Waterloo Maple Inc. de Waterloo, Canadá) y equipado con Excel® Solver para observar P O curvas (t). El vaciado gástrico de media hora se calcula como ln (2) /k emp. Todo el cuerpo de flujo Phe se calculó como el producto de k el, la concentración plasmática en estado estacionario Phe, y la distribución media estimada a partir de la cinética vol IV Phe (ecuación 3) analiza.
Estadístico
Las diferencias entre los modelos y las dietas en la bondad de los ajustes y estimaciones de los parámetros fueron evaluados por análisis unidireccional de varianza utilizando PROC GLM de SAS (SAS versión 9.3; SAS Institute Inc, Cary, NC). Las variables que no se distribuyen normalmente eran naturales log-transformado para obtener P-valores
. Los valores de p ≤ 0,05
se consideraron significativos y 0,05 < P ≤ 0,10
se consideraron las tendencias.
: Resultados de la A lo largo de los protocolos de bolo Phe intravenosa y oral, todos los gatos permanecieron sanos, mostraron el consumo de alimentos completa y mantuvieron su peso corporal. Debido a la obstrucción del catéter, la cinética IV Phe no se obtuvieron para un gato y los resultados de este animal no se analizaron. La media de las concentraciones de aminoácidos indispensables de plasma en los últimos 3 muestras recogidas durante 1 alimentación /2-hora de las dietas (Tabla 2) no fueron diferentes entre caseína y suero de leche (P
> 0,31), aunque hubo una tendencia para la metionina a ser menor (P = 0,09
) y Phe a ser mayor (P = 0,12
) con suero de leche. De los aminoácidos prescindibles en el plasma, aspartato y glutamato fueron mayores (P Hotel < 0,03) en la dieta a base de suero de leche, mientras que otros no se vieron afectados (P Hotel > 0,36) las concentraciones .Tabla 2 aminoácido ( μ M) en el plasma de los gatos adultos
aminoácido
caseína del suero

agrupado SEM
P

Alanine
654
678
48
0.74
Arginine
133
136
8
0.80
Aspartate
21
38
4
0.01
Citrulline
66
43
8
0.09
Cysteine
28
34
4
0.36
Glutamate
64
88
7
0.03
Histidine
134
122
11
0.45
Isoleucine
90
104
12
0.42
Leucine
174
187
13
0.50
Lysine
218
210
15
0.70
Methionine
139
73
22
0.09
Ornithine
49
56
5
0.38
Phenylalanine
87
103
7
0.12
Taurine
55
57
9
0.87
Tryptophan
103
108
15
0.83
Tyrosine
92
98
14
0.78
Valine
251
301
33
0.31
Indispensable Aminoácidos
1242
1123
81
0,37
prescindible Aminoácidos
973
1005
65
0,74
total Aminoácidos
2215
2114
150
0,67
los datos son medias de 8 a 12 h después de iniciar el consumo de caseína o dietas a base de suero en intervalos de 30 minutos (n = 8).
Modelado de la P V (t) curvas con una ecuación exponencial doble resultó en un menor rMSPE (P = 0,04
) y AIC (P Hotel < 0,01) en comparación con la ecuación exponencial simple (Tabla 3). Los valores más bajos indican un mejor ajuste. Las estimaciones de volumen de distribución Phe no fueron diferentes entre las ecuaciones (P
= 0,15). Un mejor ajuste con dos exponentes indica dos compartimentos para el intercambio de Phe, que fueron identificados tentativamente como las mezclas de plasma y tejidos. constantes de velocidad de flujo del plasma a los tejidos (k PT) y de tejido a plasma (k TP) se estimaron a partir de los ajustes exponenciales duales, según Shipley y Clark [13], tal como 0,037 ± 0,008 y 0,041 ± 0,016, respectivamente. Debido a que estos valores no fueron significativamente diferentes entre sí (P
= 0,77), se asumió que una sola constante de velocidad (k P) se podría usar para describir el intercambio bidireccional entre el plasma y los tejidos (Figura 2) . Por consiguiente, P O (t) las curvas se ajustaron con k P que representa el plasma de los tejidos exchange.Table 3 Ataques de las ecuaciones 1 y 2 de exponente a concentraciones plasmáticas de [13C] Phe

1-exp
2-exp
agrupado SEM
P
rMSPE (% de media)
13,6
2.4
3,6
0,02
AIC
79,4 40,9

5.4 Hotel < 0,01
volumen de distribución Phe (L /kg)
0,43 0,31

0,05 0,15

datos son la media de 8 curvas. rMSPE, raíz media cuadrada del error de predicción; AIC, criterio de información de Akaike; Phe, fenilalanina.
Figura 2 modelos compartimentales de distribución [13 C] fenilalanina siguientes intravenosa (O) de dosificación (IV) o oral. Cajas representan variables de estado, las flechas representan flujos, p representa plasma, T representa el tejido, G representa intestino, kP es la constante de velocidad para el intercambio reversible entre los bancos de plasma y tejidos, kemp es la constante de velocidad para el vaciado gástrico, ex es la primera de paso extracción esplácnico, y kel es la constante de velocidad de eliminación irreversible de la circulación.
Curvas de P O (t) fueron equipados igualmente bien entre las dietas, sin diferencias en la AIC (Tabla 4). No hubo diferencias entre caseína y las dietas a base de suero en k P, K el, o k emp. De primer paso de extracción de esplácnica Phe no fue diferente entre las dietas y un promedio de 50%. Pico P O (t) produjo 18,0 y 19,6 minutos después de [ 13C] orales Phe dosificación de caseína y suero dietas, respectivamente (datos no mostrados). El tiempo medio para el vaciado gástrico promedio de 9.9 min con caseína y 10,3 min con suero de leche, pero los tratamientos de dieta no eran diferentes entre sí. flujos de fenilalanina eran 45,3 y 46,5 mol /(min · kg) para caseína y las dietas a base de suero, respectively.Table 4 Parámetros de la cinética de Phe después de la administración oral de una dosis en bolo de L- [1- 13 C] Phe

oral
agrupado SEM
P
caseína del suero

rMSPE (% de media)
10.9
12,4
3.0
0,74
AIC
42,4 42,6

7,4
0,91
kP (/min)
0,039 0,063

Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

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