PLOS ONE: klinisk-patologisk Betydelsen av MicroRNA-214 i Gastric Cancer och dess effekt på Cellbiologiska Behaviour

Abstrakt

Ackumulerande bevis tyder på att ett stort antal mikroRNA är involverade i tumörbildning och utvecklingen av magcancer, medan den kliniska betydelsen av microRNA-214 i magsäckscancer är dåligt förstådd och den exakta roll mikroRNA-214 i magcancer fortfarande oklar. I föreliggande studie var uttrycksnivåer av microRNA-214 i 80 gastriska karcinomvävnader, 18 nontumourous gastriska vävnader och 4 typer av gastriska cancercellinjer kvantifieras genom omvänd transkription följt av realtids kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR), och förhållandet mellan mikroRNA-214 uttryck och cliniopathological egenskaper inklusive prognos undersöktes. För att undersöka den potentiella rollen av mikroRNA-214 i magcancer cellbiologiska beteende, utförde vi cell proliferation, apoptos, migration och invasionsanalyser i fyra gastric cancercellinjer och en odödlig gastric cellinje In vitro
. Våra resultat visar att mikroRNA-214 dramatiskt var nedregleras i magcancer vävnader och magcancer cellinjer, jämfört med nontumourous gastric vävnader. Stegvis nedreglering av microRNA-214 uttryck observerades bland nontumourous magslemhinnan, nonmetastasis magcancer vävnader och metastasering magcancer vävnader. Uttrycket av microRNA-214 var signifikant omvänt korrelerade med lymfkörtelmetastaser och tumörstorlek men hade ingen korrelation med patientens prognos. Ektopiskt uttryck av microRNA-214 kan hämma cellmigration och invasion förmåga SGC7901 och MKN45 gastric cancerceller. Och knockdown av microRNA-214 underlättas väsentligt celltillväxt, migration och invasion i ett cellspecifikt sätt i MKN28, BGC823 och GES-1-celler. Kolonistimulerande faktor 1 (CSF1) identifierades som en målgen av microRNA-214. Sammanfattningsvis visade våra data att mikroRNA-214 är en lovande ny biomarkör för lymfkörtel metastas hos patienter med magcancer. Och vi upptäckt att nedreglering av mikroRNA-214 kan reglera proliferation, invasion och migrering av gastric cancerceller genom att direkt rikta CSF1

Citation. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) klinisk-patologisk Betydelsen av MicroRNA-214 i Gastric Cancer och dess effekt på Cellbiologiska biologiska~~POS=HEADCOMP Behaviour. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10.1371 /journal.pone.0091307

Redaktör: Terence Lee, University of Hong Kong, Hongkong

Mottagna: 25 april 2013, Accepteras: 11 februari 2014. Publicerad: 10 mars 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation i Kina (nr 81.172.351 och 81.372.856). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer (GC) är den fjärde vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerdödlighet i världen [1]. Trots stora studier av tumörbildning och progression av GC, är patogenesen för detta komplex sjukdom dåligt kända. Således är det av avgörande kliniskt värde för att identifiera och karakterisera den exakta molekylära mekanism som är involverad i utvecklingen och utvecklingen av magcancer.

Förutom konventionell genetisk och epigenetisk förändring av proteinkodande onkogener och tumörsuppressorgener i från cancer GC, icke-proteinkodnings RNA, särskilt mikroRNA (miRNA), har dykt upp som en ny spelare att belysa mekanismen för GC utveckling [2]. MiRNA är endogena 19-25 nt icke-kodande RNA som negativt reglerar proteinuttryck genom att främja mRNA nedbrytning eller förtränga proteintranslation genom interaktion med 3'-UTR av mål mRNA. Ett växande antal miRNA har rapporterats delta i cancer och utveckling av cancer hos människa, inklusive GC [2] - [4]. Dessa miRNA brukar oreglerad och funktion antingen som tumörsuppressorer eller onkogener i initiering och progression av humana karcinom. Till exempel, Tsukamoto et al. har visat att MIR-375 nedregleras i magcancer och utövar sin proapoptotisk effekt genom nedreglering PDK1, ett kinas som fosforylerar Akt, och i sin tur undertrycker PI3K /Akt signalvägen [5]. Medan miR-21 har visat sig främja tumörproliferation och invasion i GC genom att negativt reglera viktiga tumörsuppressorer såsom PTEN, PDCD4 och RECK, och sedan ge GC-celler med ökad invasiv förmåga och förmåga att undvika anoikis [6] - [8 ]. Tidigare har vi funnit att MIR-145 var nedregleras i mångahanda mänskliga cancerceller och undertryckte invasionen-metastas kaskaden i GC genom att hämma N-cadherin protein translation [9], [10].

För närvarande kliniska betydelsen av microRNA-214 (mIR-214) i prognosen för patienter med GC är dåligt känd, och den exakta roll miR-214 i GC är fortfarande oklart. Här undersökte vi sambandet mellan MIR-214 uttryck och cliniopathological parametrar samt bedömt effekten av MIR-214 på biologiska beteenden inklusive celltillväxt, apoptos, migration och invasion av GC-celler.

Material och metoder

Vävnadsprover prover~~POS=HEADCOMP

Vävnadsprover prover~~POS=HEADCOMP framställdes på ett liknande sätt som beskrivits tidigare [9]. I korthet, 80 prover (från 65 män, 15 kvinnor, 58,3 ± 17.49 och 61,5 ± 9,162 år, respektive) av GC vävnader erhölls från patienter som genomgick kirurgisk resektion på Qi Lu sjukhuset i Shandong University från 2004 till 2006. Nontumourous magslemhinnan mer än 3 cm från tumörer valdes slumpmässigt från 18 av dessa patienter och används som kontroller. Ingen av patienterna erhöll preoperativ behandling, såsom strålningsterapi eller kemoterapi. Prover skrivit histologiskt enligt Laurens och Världshälsoorganisationen (WHO) s klassificeringar (IARC Press, Lyon, 2000), och kategoriseras enligt UICC 2002 TNM klassificering.

Etik uttalande

studien godkändes av den etiska kommittén i School of Medicine, Shandong University, Shandong, Kina (godkännandekoden: 201.101.015). Vi fick skriftligt informerat samtycke från alla inblandade i vår studie deltagarna.

Cellodling

Fyra typer av GC cellinjer mänskliga erhölls från American Type Culture Collection (MKN28 och MKN45, Manassas, VA , USA) och Shanghai Cancer Institute (BGC823 och SGC7901, Shanghai, Kina). Den odödliggjorda gastrisk mukosal epitelcellinje GES-1 erhölls från Beijing ComWin Biotech Co, Ltd (Beijing, Kina). Cellerna upprätthölls i RPMI 1640 odlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) i en fuktad cellinkubator med en atmosfär av 5% CO _{2 vid 37 ° C.}

miRNA extraktion

med hjälp av en miRNeasy FFPE Kit (Bioteke, Beijing, Kina), isolerade vi miRNA från paraffininbäddade vävnader enligt tillverkarens anvisningar. Totalt RNA av cellinjer extraherades med användning av Trizol-reagens (TaKaRa, Dalian, Kina) genom att följa tillverkarens protokoll. Kvalitet och kvantitet av RNA-proverna bedömdes genom standard spektrofotometriska metoder (BioPhotometer plus, Eppendorf, Hamburg, Tyskland) och späddes till 2 ng /l för RT-qPCR analys

omvänd transkription följt av realtid. kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) katalog

Mirna uttrycksnivåer kvantifierades med hjälp av en SYBR Primescript miRNA RT PCR Kit (Takara, Dalian, Kina) enligt tillverkarens anvisningar med Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Real -tid systemet. I korthet, de RNA-prover omvandlas till cDNA genom en One-steg Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, Kina), följt av realtids-qPCR och normaliserad med hjälp av U6 snrna (RNU6B) av 2 ^{-ΔCT metod. Primers för MIR-214 och U6 var från GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Alla reaktioner kördes i duplikat.}

Cell transfektion

Exponentiellt växande celler (1,5 x 10 ^{5) såddes i 12-brunnsplattor 12 timmar före transfektion och transfekterades med 30 nM mIR-214-prekursor (mIR-214), anti-mIR-214-inhibitor (mIR-214-hämmare), eller den negativa kontrollen (Ambion, Austin, TX, USA) med användning av X-tremeGENE transfektionsreagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) enligt tillverkarens instruktioner. Transfektion effektivitet övervakades av RT-qPCR vid 24, 48, och 72 timmar efter transfektion.}

För stabil expression av MIR-214, var SGC7901 och MKN45 celler transfekterade med lentivirus miR-214-uttryckande vektor LV3-HSA -miR-214 eller en negativ kontroll LV3NC, som har GFP som en markör protein, enligt tillverkarens protokoll (GenePharma, Shanghai, Kina). Tre dagar efter transfektion, var expressionen av GFP-proteinet övervakas enligt fluorescensmikroskop. De transfekterade cellerna underkastades screening med puromycin (1,5 mikrogram /ml) för de som stabilt uttrycker miR-214.

cellprolifereringsanalys

Efter transfektion fick cellerna trypsiniserades, räknades och såddes på 96 -Ja plattor vid en densitet av 5 x 10 ^{3 celler /brunn. Och sedan cellproliferation mättes med användning av edu proliferationsanalys såsom tidigare rapporterats [11]. I korthet, 24 h efter transfektion odlades cellerna i triplikat vid 5 x 10 3 celler per brunn i 96-brunnars plattor dagen före edu inkubation (Ribobio, Guangzhou, Kina). Efter edu märkning, behandlades cellerna med 100 mikroliter av en × Apollo reaktionscocktailen, färgades med 100 mikroliter av Hoechst 33342 (5 | j, g /ml) och visualiserades under ett fluorescensmikroskop (Olympus, Japan). Den procentuella andelen av edu positiva celler definierades som den proliferationshastighet. Data erhölls från tre oberoende experiment och presenteras som medelvärden ± standardavvikelse (SD).}

Cell apoptos analys

Tre dagar efter transfektion av MIR-214 prekursor eller inhibitor, celler samlades och färgades med hjälp av Annexin V-FITC /PI Apoptos Detection Kit (BestBio, Shanghai, Kina) som tidigare beskrivits [12]. I korthet trypsinerades cellerna, samlas in och sedan färgas med hjälp av Annexin V-FITC /PI Apoptos Detection Kit enligt tillverkarens instruktioner. Efter inkubation med Annexin V-FITC och PI, var de apoptotiska cellerna omedelbart analyserades med flödescytometri. Tidigt apoptotiska celler definierades som befolkningen som var PI negativ och Annexin V-FITC positiv, medan sent apoptotiska celler var PI positiva och Annexin V-FITC positiv. Den totala apoptotiska beräknades som den tidiga apoptotiska takt plus sent apoptotiska takt. Annexin V-PE /7-AAD Apoptos Detection Kit (keygen, Nanjing, Kina) användes för apoptos-analys av lentivirus vektor transfekterade celler, liknande de ovanstående protokoll. Varje experiment utfördes i tre exemplar och data presenterades som medel ± SD.

Cellmigration och invasionsanalyser

Cell migration och invasionsanalyser utfördes som tidigare beskrivits [13]. Migrations analys utfördes med Transwell skär med 8,0 mm porstorlek membran (24 brunnar, Corning, New York, USA). För att mäta invasion förmåga GC-celler, de tidigare nämnda skären i förväg belagda med Matrigel matris (BD Science, Sparks, MD, USA). Cellerna (1 x 10 ^{5) återsuspenderades i serumfritt medium och ympas till den övre kammaren. De nedre kamrarna fylldes med fullständigt odlingsmedium innehållande 10% FBS. Efter inkubation vid 37 ° C under 24 h, ades de migrerade celler närvarande på den undre sidan av membranet fixerades, färgades och räknades. Varje experiment utfördes i triplikat.}

Luciferasanalys

Dual-luciferas-analyser utfördes såsom tidigare beskrivits [9]. 3'-UTR-fragment av CSF1 genen som innehåller miR-214-bindningsstället amplifierades genom PCR från MKN45 cell-RNA med användning av primrarna i tabell S1, och sattes in i Xba1-stället i pmirGLO miRNA mål-expressionsvektor (Promega, San Lius Obispo, CA, USA). Den resulterande vektorn benämndes pmirGLO-CSF1. För luciferas reporteranalysen, var MKN45 och BGC823 celler ympades i en 12-brunnsplatta dagen innan transfektion. Cellerna samtransfekterades med 30 nM MIR-214 prekursor eller MIR-214-hämmare, negativ kontroll och 30 ng pmirGLO-CSF1 med X-tremeGENE transfektionsreagens (Roche Applied Science). Efter 48 h transfektion var luciferasaktiviteten mättes med hjälp av dubbla luciferas analyssystem (Promega) och normaliserades till Renilla luciferas aktivitet. Varje experiment utfördes i triplikat.

Western blot

Vid 48 h efter transfektion med MIR-214-prekursor eller inhibitor ades celler utsattes för Western blot-analys såsom beskrivits tidigare [19]. I korthet framställdes protein som extraherats från celler eller vävnader. Lysaten separerades genom elektrofores, överfördes till nitrocellulosamembran och blottades med antikroppar mot CSF1 (1:1000, Epitomics) eller β-aktin (1:1000, Santa). Data erhölls från tre oberoende experiment.

Statistisk analys

Analyser utfördes med hjälp av statistikpaketet Prism 5 programvara (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Skillnader analyserades med Students t
-test mellan två grupper eller med envägs ANOVA mellan tre grupper. Korrelationen mellan MIR-214 uttryck och tumörstorleken i primär GC beräknades genom Spearmans korrelation. I överlevnadskurvan, användes data analyserades med log-rank test. För att avgöra i vilken utsträckning ett uttryck för MIR-214 kan effektivt separera olika kliniska subsettings, Receiver Operating Characteristic (ROC) kurvan analys konstruerades och området under kurvan (AUC) beräknades för att bedöma förmågan hos MIR-214 uttryck för att skilja mellan cancerfall och nontumourous fall och för att skilja metastatiska vävnader och icke-metastaserad vävnader. P
-värden mindre än 0,05 ansågs statistiskt signifikant.

Resultat

MIR-214 nedregleras i magcancer vävnader och fyra GC cellinjer, jämfört med nontumourous magslemhinnan

i jämförelse med 18 nontumourous magslemhinnan prover, mIR-214 signifikant nedreglerad (ungefär sex gånger) i 80 primära gastriska vävnadsprover (Figur 1A, P
= 0,0001). Mottagaren arbetar karakteristiska (ROC) kurvor från Mir-214 reflekterade stark åtskillnad mellan GC vävnader och nontumourous vävnader, med en yta under kurvan (AUC) av 0,7764 (Figur S1A, 95% konfidensintervall (CI), 0,6466-0,9062). Genomgående var nedreglering av MIR-214 valideras i fyra gastric cellinjer. Såsom visas i Figur 1C, det miR-214-expressionsnivån i de GC cellinjerna MKN28, BGC823, MKN45, och SGC7901 märkbart försvagade jämfört med 18 nontumourous gastriska vävnadsprover ( P
< 0,05).

Men upptäckte vi ännu lägre uttryck av mIR-214 i GES-1, en odödliggastrisk epitelceller linje, än fyra GC cellinjer (Figur 1C, P Hotel < 0,05). Vi spekulerar i obalans kan bero åtminstone delvis på skillnaden mellan kliniska prover och cellinjer, eftersom en cellinje isolerad från en patient med en viss sjukdom, representerar miRNA uttryck tecknandet av endast ett kliniskt prov och maj förändringar under cell kultur in vitro
; med andra ord, vävnadsprover är mycket mer som det mänskliga sammanhang än cellinjer. Således, kommentera vi att MIR-214 uttryck i humana GC vävnader var mer representativt och trovärdigt än den som finns i cellinjer.

Minskad miR-214 uttryck i GC förknippas med lymfkörtelmetastaser och tumörstorlek men har ingen korrelation med patientens prognos

för att bestämma de potentiella kliniskt patologiska konsekvenserna av förändrade miR-214 uttryck, vi kombinerat qPCR resultat och kliniska parametrar. Samband mellan MIR-214 uttryck nivå och kliniskt patologiska egenskaper hos GC sammanfattas i tabell 1. MIR-214 uttryck omvänt korrelerad med tumörstorlek (tabell 1, t
-test, P
= 0,0265; Figur 1D, Spearman r = -0,2673, P
= 0,0083) och lymfkörtel metastas (Tabell 1, Figure1A, t
-test, P
= 0,0164). Det fanns dock ingen signifikant skillnad i andra kliniskt patologiska egenskaper som kön, distala metastaser, WHO histologiska klassificering och Laurens histologiska typen mellan dessa två grupper.

Intressant, fann vi stegvis nedreglering av MIR-214 bland nontumourous gastric slemhinna, nonmetastasis vävnader, och metastas vävnader (Figur 1A, en-vägs ANOVA, P
= 0,0006). För att utvärdera miR-214 uttryck i GC som en ny biomarkör för lymfkörtel metastas, var ROC kurvorna bestämmas. Vi observerade tydliga separationer mellan patienter med lymfkörtelmetastaser och de utan lymfkörtel metastas, med en AUC av 0,5880 (Figur S1B, 95% CI, 0,4526-0,7166). De primära gastriska vävnader vidare uppdelade i en låg metastas grupp och en hög metastas grupp enligt antalet lymfkörteln metastaser (LNM): låg metastaser definierades som fall med mindre än sex LNM och fall med mer än sex LNM ansågs vara hög metastas. Som väntat var miR-214 uttryck minskat dramatiskt i hög metastas gruppen jämfört med den låga metastas grupp (Figur 1B, P
= 0,045).

I enlighet med vävnadsprovet data som indikerar sambandet mellan mIR-214 uttryck och LNM, fann vi att jämfört med måttligt väl differentierad cellinje MKN28, mIR-214 uttryck var betydligt mindre i dåligt differentierade cellinjer MKN45 och BGC823, och särskilt metastatisk cellinje SGC7901 [14] ( P Hotel < 0,05) katalog

Men visade våra data ingen signifikant skillnad i mIR-214 uttryck i 18 primära gastric vävnadsprover och deras sekundära metastaser loci (Figur 1B. , P
= 0,2676). Dessa resultat tyder på att nedreglering av MIR-214 uttryck inträffade i ett tidigt skede av LNM utveckling och förblev stabil utan ytterligare dämpning i det sena stadiet av metastaser.

För att ytterligare undersöka effekten av MIR-214 på prognosen för patienter, analyserade vi de uttrycksnivåer av mIR-214 i fall med olika återfall status och överlevnad förhållanden. Men våra data visade att det inte fanns någon uttalad skillnad mellan återfall gruppen och nonrelapse gruppen, eller mellan överlevnad gruppen och död gruppen (Figur 2A-B, t
-test, P
> 0,05). Notera vi delat upp patienterna i hög uttryck och låg uttrycks grupper baserat på mediannivå Mir-214 uttryck, och Kaplan-Meier överlevnadskurvor visade ingen signifikant korrelation mellan MIR-214 uttryck och återfall överlevnad (figur 2C , hazard ratio (HR) 1,23, 95% konfidensintervall (CI) ,6596-2,285; P
= 0,5781) eller total överlevnad (figur 2D, HR 1,20, 95% CI ,6667-2,151; P
= 0,5832) hos patienter med GC.

Effekt av mIR-214 på cellförökning av GC celler

för att kontrollera transfektionseffektiviteten, bestämd vi miR-214-expression genom RT-qPCR på 24, 48, och 72 timmar efter transfektion i MIR-214-prekursor eller inhibitor transfekterade celler och kontinuerligt detekteras miR-214 uttryck av lentivirus vektorer behandlade celler i 4 veckor. Som väntat, transfektion av Mir-214 föregångare effektivt resulterat i betydande överuttryck av MIR-214 (Figur S2A-B, P Hotel < 0,05) och MIR-214-hämmare slående reducerad miR-214 uttryck i MIR 214 hämmare-transfekterade celler än de negativa grupperna (figur S3E-F, figur S4 A, P Hotel < 0,05). Dessutom fann vi att celler transfekterade med lentivirus vektor LV3-HSA-MIR-214 skulle kunna leda till en 7-96-faldig förändring av MIR-214 uttryck i SGC7901 och MKN45 celler (Figur S3A-D, P
< 0,05), med 80% -90% celler som uttrycker GFP markörproteinet (Figur S3A, B) katalog

för att bestämma huruvida mIR-214 kan påverka spridningen av GC-celler, EDU proliferationsanalys var van vid. detektera celltillväxtförmåga. Våra data visade att överuttryck av MIR-214 med lentiviurs vektorer eller MIR-214 föregångare inte påverka celltillväxt av SGC7901 (Figur 3A-B, Figur S2C-D, P > 0,05) och MKN45 cellinjer (Figur S2E-F, figur S5A-B, P > 0,05). Vi hittade dock att downregualtion Mir-214 kan främja spridningen av BGC823 (Figur 3C-D, P
= 0,0010) och GES-1 (Figur s4b-C, P
= 0,0474), men inte MKN28 cellinje (Figur S5C-D, P
= 0,0938), i ett cellspecifikt sätt

roll miR-214 i cellmigration och invasion av GC. celler

som miR-214 uttryck omvänt samband med lymfkörtelmetastaser, var vi särskilt intresserade av förmågan mIR-214 att påverka cellmigration och invasion. Våra resultat indikerade att SGC7901 och MKN45-celler transfekterade med LV3-HSA-miR-214 visade en signifikant minskade migration och invasion kapacitet, jämfört med LV3NC behandlade celler (figur 4A-B, figur S6A-B, P
< 0,05). Och vi observerat att downregualtion Mir-214 skulle kunna underlätta migration och invasion av MKN28 (Figur 4C-D, P
= 0,0491 och P
= 0,0127, respektive). Även knockdown av MIR-214 inte påverkar migrationen av GES-1-celler (Figur S4D-E, P
= 0,0879), tysta MIR-214 ledde till en ökning av invasiva egenskaper mer än 40% av dessa celler ( P
= 0,0046). Men våra data visade att transfektion av MIR-214 föregångare inte har en robust effekt på cellmigration och invasion i SGC7901 (Figur S2G-H, P Hotel > 0,05) och MKN45 (figur S2I-J, P Hotel >. 0,05) celler, jämfört med respektive negativa kontroller

inverkan av mIR-214 på cell apoptos av GC celler

för att undersöka effekten av mIR 214 på cell apoptos, utförde vi apoptosanalyser med hjälp av Annexin V-FITC /PI färgningsmetod. Våra resultat visade att överuttryck (MIR-214 föregångare och lentivirus vektor) och knockdown av MIR-214 inte skulle kunna påverka cell apoptos uppenbarligen jämfört med negativa kontroller i fyra GC cellinjer (Figur 5, Figur S2K-N, P
> 0,05) och immortaliserade gastric cellinje GES-1 (data ej visade). I själva verket fann vi en tendens att pro-apoptos förmåga miR-214 föregångare i MKN45 cellinje (Figur S2M-N, P
= 0,0606), men skillnaden var inte statistiskt signifikant.

mIR-214 riktar sig direkt och nedreglerar CSF1 i gastric cancerceller

för att identifiera mål av mIR-214, som används vi TargetScan algoritm för att förutsäga miR-214 mål i human magcancer. Bland de många tänkbara kandidater vi plockat ut de överuttryckt i cancer och proliferation- och metastasering associerade gener, inklusive NOTCH2, FGFR1, CSF1 (Figur 6A), AGAP2, CREB1, för vidare analys. Våra resultat visade att miR-214 prekursor transfektion minskade signifikant aktiviteten av en luciferas reportergen fuserad till CSF1 3'-UTR, med 29,60% och 30,61% minskning, jämfört med de negativa kontrollgrupperna (Figur 6B, P
= 0,0227 och 0,0093, respektive, för MKN45 och BGC823 cellinjer). Medan när miR-214-hämmare transfekterades var luciferasaktivitet ökade med 34,49% och 42,25% i MKN45 och BGC823 celler jämfört med kontrollerna (Figur 6C, P
= 0,0115 och 0,0085, respektive).

Vi vidare fastställas uttrycket av CSF1 protein genom Western blöt i GC-celler transfekterade med mIR-214 prekursor eller inhibitor. I överensstämmelse med de luciferas resultat, var ett uttryck för CSF1 protein minskat betydligt i SGC7901 och MKN45 celler (Figur 6D-E, P
= 0,0037 och 0,0066, respektive) transfekterades med MIR-214 föregångare och ökade i MKN28 och BGC823 celler (Figur S7A-B, P
= 0,0049 och 0,0416, respektive) transfekterades med mIR-214-hämmare, jämfört med respektive kontroller. Dessa data tyder på att MIR-214 hämmar CSF1 översättning i gastric cancerceller.

Diskussion

Emerging bevis har visat den avgörande inverkan miRNA dysreglering på tumörbildning av humana karcinom [3], [4] . MiRNA dysreglering befrämjar cellproliferation, ger resistens mot apoptos, och förbättrar invasivitet och metastasering, genom trycka nedströms tumörsuppressorer eller inducera ackumulering av mål-onkogener och sålunda är involverad i initiering, progression, och metastas av humana tumörer.

Bland de många miRNA, dysreglering av mIR-214 konstaterades i många humana cancerformer [15] - [22]. Nedreglering av MIR-214 i livmoderhalscancer har rapporterats av flera grupper, och MIR-214 har visat sig hämma tillväxten, migration och invasion av cervical cancerceller genom inriktnings onkogener MEK3, JNK1, Plexin-B1, och GALNT7 [15 ] - [17]. MIR-214 har också visat sig vara minskade i bröstcancer och bidrar till brösttumörbildning genom att avvikande förhöjd onkogen Ezh2 ackumulering och efterföljande okontrollerade celltillväxt och invasion [18]. Emellertid Penna et al. har visat att miR-214 uttrycks starkt i humana melanom och bidrar till melanomtumörprogression genom undertryckande av TFAP2C, en homolog av en väletablerad melanom tumörsuppressor [19]. Dessa resultat tyder på att rollen av MIR-214 i cancer är vävnads- eller cell- specifikt.

En färsk studie från Ueda et al. visade att dysreglering av MIR-214 korrelerade med kliniskt stadium, peritoneal spridning och överlevnad av patienter [20]. Dock kvarstår den exakta roll MIR-214 i utvecklingen av magcancer och dess bakomliggande molekylära mekanismen svårfångade. Här visar vi att miR-214 väsentligt reducerades i GC, speciellt i metastatiska vävnader, vilket tyder på en potentiell roll miR-214 i att förutsäga lymfkörtelmetastaser, vilket ytterligare understöddes av vårt ROC-kurva analys. Dessutom fann vi att lågt uttryck av MIR-214 hade en lutning mot en större tumörstorlek. För att ta itu om dysreglering av MIR-214 bär en biologisk betydelse, utnyttjade vi en uppföljningsstudie och funktionell analys av MIR-214 In vitro
. Trots våra data tyder på att MIR-214 har ingen effekt på patientens resultat, inklusive återfall status och överlevnad. Våra data visade att överuttryck av MIR-214 med lentivirus miR-214-uttryckande vektor reducerad migration och invasion av GC cellinjer och knockdown av MIR-214 dramatiskt skulle kunna underlätta celltillväxt, apoptos, migration och invasion i ett cellspecifikt sätt, med inget inflytande på cellapoptos.

CSF1 (kolonistimulerande faktor 1 (makrofag)) är en kritisk hematopoetisk tillväxtfaktor som involverar i makrofag celldifferentiering, proliferation och aktivering, och det är också närvarande i icke-hematopoietiska celler [21] . CSF-1 påverkar cellulär överlevnad och proliferation via bindning till sin receptor som kodas av c-fms-genen [22]. Tidigare studier visade att CSF1 utövade viktiga roller i att främja tumörangiogenes i leiomyosarcoma [23] och Lewis lungkarcinomceller via VEGF-induktion [24]. Aligeti S et al. föreslog att CSF1 har en positiv effekt på bindning till pleura mesothelial celler, invasion och spridning av endometrial epitelceller [25]. Och förhöjda serumkoncentrationer av har satts i samband med sjukdomsstadium, lymfkörtelmetastaser och dålig prognos hos patienter med kolorektalcancer [26]. Här har vi identifierat CSF1 var ett direkt mål för MIR-214 i magcancer genom luciferasanalyser och bekräftades ytterligare genom Western blot-analys. Våra data antydde att nedreglering av MIR-214 kan underlätta tillväxt, migration och invasion kapacitet av gastrisk cancercell genom CSF1-medierad signalväg.

I den tidigare studien, Ueda et al. visade att relativt högre uttryck av MIR-214 i GC var förknippad med ogynnsamma överlevnad i 101 patienter (erhållen från University of Tokyo och Hiroshima University) [20], dock indikerade våra data att MIR-214 inte var signifikant korrelerad till patientens resultat. Vi antar att denna diskrepans kan bero på de olika miRNA uttryck detektionsmetoder, urvalsstorlekar och uppföljning gånger mellan sin forskning och vår. Ueda et al. delat proverna i två klasser (hög och låg uttryck) med de genomsnittliga nivåerna av miRNA uttryck mätt på en mikroRNA microarray som en tröskel, medan vår division av höga och låga uttrycksgrupper baserades på median nivån av uttryck som vunnits från qPCR resultat . Intressant i tidigare studier, MIR-214-expression har visat sig vara uppreglerad i äggstockscancer jämfört med normala äggstocksceller från Yang et al. [27], medan motsatt resultat rapporterades av Nam et al. [28]. Båda dessa två grupper som används miRNA microarrays att undersöka miRNA uttryck. Således kan vi inte utesluta möjligheten att microarray analys inte kan vara så känsligt och exakt i att analysera uttrycksprofiler för en viss miRNA. När det gäller effekten av MIR-214 på prognosen för patienter med GC, delvis överensstämmer med resultaten av Ueda et al., Fann vi också en tendens att hög expression av MIR-214 var ogynnsam för överlevnad när uppföljningstiden var längre än 40 månader (hazard ratio (HR) = 1.19 för total överlevnad, HR = 1,23 för återfall överlevnad), som visas i figur 2, även om trenden var inte statistiskt signifikant. I vilket fall som helst, är ytterligare utredning med en större kohort och olika experimentella inställningar som behövs för att lösa problemet.

När det gäller discordance Mir-214 lentivirus vektorer och föregångare transfektionsanalyser, vi förmodar att det är en specifik följd av de biologiska aktiviteterna av mIR-214. En måttlig och stabil expression i stället för tiotusentals icke-fysiopatologisk overexpresion kan hjälpa miR-214 fungerar väl.

Sammantaget visade vi att miR-214 väsentligt reducerades i GC, speciellt i metastatiska vävnader, vilket tyder på en potentiell roll miR-214 för att förutsäga lymfkörtelmetastaser. Vår ROC-kurva analys visade den relativt höga specificiteten och känsligheten hos MIR-214 för att särskilja GC fallen från nontumourous kontroller, och separera patienter med och utan lymfkörtelmetastaser, och därigenom motivera dess potentiella användbarhet som en roman biomarker för GC och lymfkörtel metastas, vilket kommer att vara till hjälp för att underlätta den kliniska hanteringen av GC. Men våra data indikerade att miR-214 har ingen effekt på patientens prognos, vilket indikerar att miR-214 är ensamt inte tillräckligt för att påverka patientens överlevnad.

• PLOS ONE: Förhöjda plasma D-Dimer nivåer korrelerar med långsiktig överlevnad för magcancer patienter
• PLOS ONE: HIF-1 Alpha Uttryck korrelerar med dålig överlevnad och sjukdomsfri överlevnad i magsäckscancer patienter efter Gastrectomy