PLOS ONE: Importance clinicopathologique de microARN-214 dans le cancer gastrique et son effet sur cellulaire Behaviour

Résumé

L'accumulation des données indique que de nombreux microARN sont impliqués dans la tumorigenèse et la progression du cancer de l'estomac, tandis que la signification clinique de microARN-214 dans le cancer gastrique est mal compris et le rôle exact de microARN-214 dans le cancer gastrique reste obscure. Dans la présente étude, les niveaux d'expression de microARN-214 dans 80 tissus gastriques de carcinome, 18 tissus gastriques nontumourous, et 4 types de lignées cellulaires de cancer gastrique ont été quantifiés par transcription inverse suivie en temps réel par réaction en chaîne par polymérase quantitative (RT-PCR quantitative), et la relation entre l'expression de microARN-214 et les caractéristiques cliniopathological dont le pronostic a été explorée. Pour étudier le rôle potentiel des microARN-214 dans le comportement biologique des cellules de cancer de l'estomac, nous avons effectué la prolifération cellulaire, l'apoptose, la migration et l'invasion des essais dans quatre lignées cellulaires de cancer gastrique et une lignée cellulaire gastrique immortalisés in vitro
. Nos résultats ont montré que les micro-ARN-214 était considérablement régulée à la baisse dans les tissus du cancer de l'estomac et des lignées cellulaires de cancer gastrique, par rapport aux tissus gastriques nontumourous. downregulation Stepwise d'expression de microARN-214 a été observée chez la muqueuse gastrique nontumourous, nonmetastasis tissus de cancer gastrique, et les tissus de cancer gastrique de métastases. L'expression de microARN-214 était significativement en corrélation inverse avec les métastases des ganglions lymphatiques et de la taille de la tumeur, mais avait aucune corrélation avec le pronostic du patient. L'expression ectopique de microARN-214 pourrait inhiber la migration des cellules et la capacité d'invasion des cellules cancéreuses gastriques SGC7901 et MKN45. Et knockdown de microARN-214 a grandement facilité la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion d'une manière spécifique à la cellule dans MKN28, BGC823 et GES-1 cellules. Facteur de stimulation des colonies 1 (CSF1) a été identifié comme un gène cible de microARN-214. En résumé, nos données ont démontré que les microARN-214 est un nouveau biomarqueur prometteur pour métastases ganglionnaires chez les patients atteints de cancer gastrique. Et nous avons constaté que la régulation négative de microARN-214 peut réguler la prolifération, l'invasion et la migration des cellules de cancer gastrique en ciblant directement CSF1

Citation:. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) importance clinicopathologique de microARN-214 dans le cancer gastrique et son effet sur le comportement cellulaire biologique. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10.1371 /journal.pone.0091307

Editeur: Terence Lee, Université de Hong Kong, Hong Kong

Reçu le 25 Avril 2013; Accepté le 11 Février 2014; Publié 10 Mars, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Wang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 81172351 et 81372856). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique (GC) est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de mortalité par cancer dans le monde [1]. Malgré des études considérables sur la tumorigenèse et la progression de GC, la pathogenèse de cette maladie complexe est mal comprise. Ainsi, il est d'une valeur clinique essentielle pour identifier et caractériser le mécanisme moléculaire précis impliqué dans le développement et la progression du cancer de l'estomac.

En dehors de la modification génétique et épigénétique classique des oncogènes codant pour des protéines et des gènes suppresseurs de tumeur dans la carcinogenèse du GC, ARNs non protéiniques codant, en particulier les microARN (miARN), ont émergé comme un nouveau joueur pour faire la lumière sur le mécanisme de développement du GC [2]. MiRNAs sont endogènes 19-25 ARNs non codants nt qui régulent négativement l'expression des protéines en favorisant la dégradation de l'ARNm ou de réprimer la traduction des protéines, grâce à l'interaction avec l'extrémité 3 'UTR des ARNm cibles. Un nombre croissant de miARN ont été signalés à participer à la carcinogenèse et le développement des cancers humains, y compris GC [2] - [4]. Ces miARN sont généralement dérégulée et la fonction soit comme suppresseurs ou oncogènes tumorales dans l'initiation et la progression des cancers humains. Par exemple, Tsukamoto et al. ont montré que miR-375 est régulé à la baisse dans le carcinome gastrique et exerce son effet pro-apoptotique par la régulation négative de la PDK1, une kinase qui phosphoryle Akt, et à son tour, inhibe la voie PI3K /Akt [5]. Alors que miR-21 a été trouvé pour favoriser la prolifération de la tumeur et l'invasion en GC en régulant négativement suppresseurs de tumeurs importantes telles que PTEN, PDCD4 et RECK, puis conférer des cellules GC avec une augmentation invasivité et la capacité d'éviter anoikis [6] - [8 ]. Auparavant, nous avons constaté que miR-145 a été downregulated dans les cellules cancéreuses humaines multiples et supprimé la cascade invasion-métastases dans GC en inhibant la traduction de protéine N-cadhérine [9], [10].

À l'heure actuelle, la signification clinique de microARN-214 (miR-214) dans le pronostic des patients atteints de GC est mal comprise, et le rôle exact de miR-214 en GC reste incertaine. Ici, nous avons étudié l'association entre miR-214 expression et cliniopathological paramètres ainsi que d'évaluer l'effet de miR-214 sur les comportements biologiques, y compris la prolifération cellulaire, l'apoptose, la migration et l'invasion des cellules du GC.

Matériel et méthodes

des échantillons de tissus

des échantillons de tissus ont été préparés d'une manière similaire à celle décrite précédemment [9]. En bref, 80 échantillons (à partir de 65 mâles, 15 femelles; 58,3 ± 17,49 et vieux 61,5 ± 9,162 années, respectivement) des tissus du GC ont été obtenus chez des patients ayant subi une résection chirurgicale au Qi Hôpital Lu de l'Université du Shandong de 2004 à 2006. muqueuse gastrique Nontumourous plus de 3 cm de distance à partir de tumeurs ont été choisis au hasard à partir de 18 de ces patients et utilisés comme témoins. Aucun des patients n'a reçu un traitement pré-opératoire, tel que la radiothérapie ou la chimiothérapie. Les échantillons ont été tapés histologiquement selon Lauren et l'Organisation mondiale de la santé (OMS) classifications (IARC Press, Lyon, 2000), et classés en fonction de l'UICC 2002 classification TNM.

Déclaration d'éthique

l'étude a été approuvée par le Comité d'éthique de la Faculté de médecine de l'Université du Shandong, du Shandong, en Chine (code d'approbation: 201101015). Nous avons obtenu le consentement éclairé de tous les participants impliqués dans notre étude.

culture
Cell

Quatre types de lignées cellulaires GC humaines ont été obtenues à partir de l'American Type Culture Collection (MKN28 et MKN45, Manassas, VA , États-Unis) et l'Institut de Shanghai Cancer (BGC823 et SGC7901, Shanghai, Chine). La muqueuse lignée de cellules épithéliales gastriques immortalisés GES-1 a été obtenu à partir de Beijing COMWIN Biotech Co., Ltd (Beijing, Chine). Les cellules ont été maintenues dans du milieu RPMI 1640 de culture supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS) dans un incubateur de cellules humidifié avec une atmosphère de 5% de CO _{2 à 37 ° C.}

MiRNA extraction

Utilisation d'un kit miRNeasy FFPE (Bioteke, Beijing, Chine), nous avons isolé miRNA à partir de tissus de paraffine selon les instructions du fabricant. L'ARN total des lignées cellulaires a été extrait en utilisant Trizol réactif (Takara, Dalian, Chine) suivant le protocole du fabricant. La qualité et la quantité des échantillons d'ARN ont été évalués par des méthodes spectrophotométriques standards (BioPhotometer plus, Eppendorf, Hambourg, Allemagne) et diluées à 2 ng /ul pour analyse par RT-qPCR

transcription inverse suivie en temps réel. quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR)

niveaux d'expression des miARN ont été quantifiées en utilisant un kit SYBR Primescript miRNA RT PCR (Takara, Dalian, Chine) selon les instructions du fabricant avec un Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 réel -Temps système. En bref, les échantillons d'ARN ont été convertis en ADNc par une seule étape Kit Primescript miRNAcDNA Synthèse (Takara, Dalian, Chine), suivie en temps réel qPCR et normalisée en utilisant U6 petit ARN nucléaire (RNU6B) par la 2 ^{-ΔCT méthode. Amorces pour miR-214 et U6 étaient de GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Toutes les réactions ont été effectuées en double.}

Cellule transfection

cellules en croissance exponentielle (1,5 x 10 ^{5) ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits 12 h avant la transfection et ont été transfectées avec 30 nM miR-214 précurseur (miR-214), anti-miR-214 inhibiteur (miR-214 inhibiteur), ou le contrôle négatif (Ambion, Austin, TX, USA) en utilisant le réactif de transfection X-tremeGENE (Roche Applied science, Indianapolis, IN, USA) selon les instructions du fabricant. L'efficacité de transfection a été suivie par RT-PCR quantitative à 24, 48 et 72 h après la transfection.}

Pour une expression stable de miR-214, les cellules MKN45 SGC7901 et ont été transfectées avec des lentivirus miR-214 exprimant le vecteur LV3-SAH -mir-214 ou un contrôle négatif LV3NC, qui a GFP comme une protéine marqueur, selon le protocole du fabricant (GenePharma, Shanghai, Chine). Trois jours après la transfection, de l'expression de la protéine GFP a été contrôlée sous un microscope à fluorescence. Les cellules transfectées ont été criblés avec la puromycine (1,5 pg /ml) pour celles exprimant de manière stable miR-214.

Essai de prolifération cellulaire

Après la transfection, les cellules ont été trypsinisées, comptées et ensemencées sur 96 plaques -Bien à une densité de 5 x 10 ^{3 cellules /puits. Ensuite, la prolifération cellulaire a été mesurée en utilisant l'essai de prolifération EdU comme rapporté précédemment [11]. En bref, 24 h après la transfection, les cellules ont été cultivées en triple exemplaire à 5 x 10 3 cellules par puits dans des plaques à 96 puits la veille EdU incubation (Ribobio, Guangzhou, Chine). Après marquage EdU, les cellules ont été traitées avec 100 ul de 1 x cocktail Apollo réaction, colorées avec 100 pi de Hoechst 33342 (5 pg /ml) et ont été visualisées sous un microscope à fluorescence (Olympus, Japon). Le pourcentage de cellules positives EdU a été défini comme le taux de prolifération. Les données ont été obtenues à partir de trois expériences indépendantes et présentés en moyenne ± écart-type (SD).}

Cellule apoptose test

Trois jours après la transfection de miR-214 précurseur ou inhibiteur, les cellules ont été recueillies et colorées en utilisant le kit Annexin V-FITC /PI apoptose Détection (BestBio, Shanghai, Chine) comme décrit précédemment [12]. En bref, les cellules ont été trypsinisées, collectées puis colorées en utilisant l'Annexin V-FITC /Kit de détection de l'apoptose PI suivant les instructions du fabricant. Après incubation avec l'Annexine V-FITC et PI, les cellules apoptotiques ont été immédiatement analysées par cytométrie en flux. Au début des cellules apoptotiques ont été définis comme la population qui était PI négative et Annexin V-FITC positif, tandis que les cellules apoptotiques étaient en retard PI positive et Annexin V-FITC positive. Le taux apoptotique total a été calculé que le taux apoptotique précoce, plus le taux apoptotique tard. Annexine V-PE /7-AAD Kit de détection de l'apoptose (KEYGEN, Nanjing, China) a été utilisé pour le dosage de l'apoptose des cellules transfectées lentivirus vector, similaire aux protocoles ci-dessus. Chaque expérience a été réalisée en trois exemplaires, et les données ont été présentées comme des moyens ± SD.

La migration des cellules et des essais d'invasion

migration cellulaire et l'invasion des essais ont été effectués comme décrit précédemment [13]. essai de migration a été réalisée avec Transwell insère avec 8,0 mm membrane de la taille des pores (format 24 puits, Corning, New York, USA). Pour mesurer la capacité d'invasion des cellules GC, les inserts mentionnés précédemment ont été pré-revêtues de matrice Matrigel (BD Science, Sparks, MD, USA). Les cellules (1 x 10 ^{5) ont été remises en suspension dans un milieu sans sérum et ensemencées à la chambre supérieure. Les chambres inférieures ont été remplis de milieu de culture complet contenant 10% de FBS. Après incubation à 37 ° C pendant 24 h, les cellules ayant migré présents sur le côté inférieur de la membrane ont été fixées, colorées et comptées. Chaque expérience a été réalisée en trois exemplaires.}

dosage de Luciférase

essais à double luciférase ont été réalisées comme décrit précédemment [9]. Les fragments 3 'UTR du gène CSF1 contenant le site de liaison de miR-214 a été amplifié par PCR à partir d'ARN de cellules MKN45 en utilisant les amorces dans le tableau S1, et insérés dans le site Xba1 du pmirGLO miARN vecteur d'expression cible (Promega, San Lius Obispo, CA, USA). Le vecteur résultant a été nommé pmirGLO-CSF1. Pour le dosage de rapporteur de luciférase, MKN45 et BGC823 cellules ont été ensemencées dans une plaque à 12 puits le jour avant la transfection. Les cellules ont été co-transfectées avec 30 nM de miR-214 précurseur ou miR-214 inhibiteur, contrôle négatif et 30 ng pmirGLO-CSF1 en utilisant X-tremeGENE réactif de transfection (Roche Applied Science). 48 h après la transfection, l'activité luciférase a été mesurée en utilisant le système à double luciférase de dosage (Promega) et normalisées par rapport à l'activité luciférase de Renilla. Chaque expérience a été réalisée en trois exemplaires.

transfert de Western

48 h après la transfection avec miR-214 précurseur ou d'un inhibiteur, les cellules ont été soumises à une analyse par transfert de Western comme décrit précédemment [19]. En bref, la protéine a été extrait des cellules ou des tissus. Les lysats ont été résolus par électrophorèse, transféré sur des membranes de nitrocellulose et transférés avec des anticorps dirigés contre CSF1 (1:1000, Epitomics) ou β-actine (1:1000 Santa). Les données ont été obtenues à partir de trois expériences indépendantes.

L'analyse statistique

Les analyses ont été effectuées en utilisant le progiciel statistique logiciel Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Des différences ont été analysées à l'aide de l'étudiant t
-test entre deux groupes ou avec un ANOVA entre les trois groupes. La corrélation entre l'expression de miR-214 et la taille de la tumeur dans le GC primaire a été calculée par la corrélation de Spearman. Dans la courbe de survie, les données ont été analysées par test log-rank. Pour déterminer dans quelle mesure l'expression de miR-214 pourrait efficacement séparer les différents subsettings cliniques, récepteur fonctionnant analyse (ROC) de courbe caractéristique a été construite et l'aire sous la courbe (AUC) a été calculé pour évaluer la capacité de miR-214 expression pour différencier entre les cas de cancer et les cas nontumourous, et de distinguer les tissus métastatiques et les tissus non métastatiques. P
-values ​​moins de 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Les de

Résultats miR-214 est downregulated dans les tissus de carcinome gastrique et quatre lignées de cellules GC, par rapport à la muqueuse gastrique nontumourous

en comparaison avec 18 échantillons de muqueuse gastrique nontumourous, miR-214 était significativement downregulated (environ six fois) dans 80 échantillons primaires gastriques de tissus (Figure 1A, P
= 0,0001). Le récepteur operating characteristic (ROC) courbes de miR-214 reflète une forte séparation entre les tissus du GC et les tissus nontumourous, avec une aire sous la courbe (AUC) de 0,7764 (Figure S1A, intervalle de confiance à 95% (IC), 0,6466 à 0,9062). Constante, la régulation négative de miR-214 a été validée dans quatre lignées de cellules gastriques. Comme cela est représenté sur la figure 1C, le niveau d'expression de miR-214 dans les lignées cellulaires GC MKN28, BGC823, MKN45 et SGC7901 a été marquée ATTÉNUÉE par rapport à 18 des échantillons de tissus gastriques nontumourous ( P
< 0,05).

Cependant, nous avons détecté l'expression encore plus faible de miR-214 en GES-1, une ligne immortalisées de cellules épithéliales gastriques, que dans quatre lignées de cellules GC (figure 1C, P
< 0,05). Nous spéculons la discordance peut être due au moins en partie à la différence entre les échantillons cliniques et des lignées cellulaires, car une lignée cellulaire, isolé d'un patient avec une certaine maladie, représente la signature d'expression de miARN d'un seul échantillon clinique et les changements peut, pendant la cellule culture in vitro
; en d'autres termes, les échantillons de tissus sont beaucoup plus, comme le contexte humain que des lignées cellulaires. Ainsi, nous commentons que miR-214 expression dans les tissus GC humains était plus représentative et crédible que celle trouvée dans les lignées cellulaires.

Diminution de l'expression de miR-214 en GC est associée à des métastases des ganglions lymphatiques et la taille de la tumeur, mais n'a pas corrélation avec le pronostic du patient

Pour déterminer les implications potentielles de clinicopathologiques modifié l'expression de miR-214, nous avons combiné les résultats de qPCR et les paramètres cliniques. Les corrélations entre le niveau d'expression de miR-214 et les caractéristiques clinico de GC sont résumées dans le tableau 1. miR-214 expression était inversement corrélée à la taille de la tumeur (tableau 1, t
-test, P
= 0,0265; Figure 1D, Spearman r = -0,2673, P
= 0,0083) et métastase ganglionnaire (tableau 1, Figure1A, t
-test, P
= 0,0164). Cependant, il n'y avait pas de différence significative dans d'autres caractéristiques clinico tels que le sexe, la métastase distale, l'OMS classification histologique, et le type histologique de Lauren entre ces deux groupes.

Curieusement, nous avons trouvé une régulation négative par étapes de miR-214 parmi gastrique nontumourous muqueuses, les tissus de nonmetastasis et métastase tissus (Figure 1A, ANOVA à une voie, P
= 0,0006). Pour évaluer l'expression de miR-214 en GC comme un nouveau biomarqueur pour métastase ganglionnaire, courbes ROC ont été établies. Nous avons observé des séparations claires entre les patients atteints de métastases ganglionnaires et ceux sans métastases ganglionnaires, avec une AUC de 0,5880 (Figure S1B, IC à 95%, 0,4526 au 0,7166). Les tissus gastriques primaires ont été divisés en un groupe à faible métastases et un groupe à haut métastases en fonction du nombre de métastases ganglionnaires (LNM): faible métastases a été défini comme cas avec moins de six LNM, et les cas avec plus de six LNM ont été considérés comme haute métastase. Comme prévu, l'expression de miR-214 a été considérablement diminué dans le groupe à haut métastases par rapport au groupe à faible métastases (figure 1B, P
= 0,045).

Conformément à l'échantillon de tissu des données indiquant la corrélation entre l'expression de miR-214 et LNM, nous avons constaté que, par rapport à la lignée cellulaire modérément bien différenciée MKN28, miR-214 expression était nettement moins dans les lignées de cellules peu différenciées MKN45 et BGC823, et surtout la lignée cellulaire métastatique SGC7901 [14] ( P
< 0,05)

Cependant, nos données montrent pas de différence significative de miR-214 expression dans 18 échantillons de tissus gastriques primaires et de leur loci de métastases secondaires (figure 1B. , P
= 0,2676). Ces résultats suggèrent que la régulation négative de l'expression de miR-214 a eu lieu dans le stade précoce de développement LNM et est resté stable sans atténuation supplémentaire à la fin du stade de métastases.

Pour explorer davantage l'effet de miR-214 sur le pronostic de patients, nous avons analysé les niveaux de miR-214 expression dans les cas avec différents état de rechute et de survie conditions. Cependant, nos données ont montré qu'il n'y avait pas de différence marquée entre le groupe de rechute et le groupe nonrelapse, ou entre le groupe de survie et le groupe de mortalité (figure 2A-B t
-test P
> 0,05). Fait à noter, nous avons divisé les patients en groupes de haute expression et de faible expression basés sur le niveau médian d'expression de miR-214, et les courbes de survie de Kaplan-Meier a montré aucune corrélation significative entre miR-214 expression et la survie sans récidive (figure 2C , hazard ratio (HR) de 1,23, intervalle de confiance à 95% (IC) 0,6596 à 2,285; P
= 0,5781) ou la survie globale (figure 2D, HR 1,20, IC à 95% de 0,6667 à 2,151; P
= 0,5832) chez les patients avec GC.

effet de miR-214 sur la prolifération cellulaire des cellules GC

Pour contrôler l'efficacité de transfection, nous avons déterminé miR-214 expression par RT-qPCR à 24, 48 et 72 h après la transfection dans le précurseur de miR-214 ou un inhibiteur des cellules transfectées et en continu détectée miR-214 expression de vecteurs lentiviraux cellules traitées pendant 4 semaines. Comme prévu, la transfection du précurseur miR-214 de manière efficace a donné lieu à une surexpression significative de miR-214 (Figure S2A-B, P
< 0,05) et miR-214 inhibiteur étonnamment réduite miR-214 expression dans Mir- 214 cellules inhibitrices transfectées que les groupes négatifs (Figure S3E-F, Figure S4 A, P
< 0,05). En outre, nous avons constaté que les cellules transfectées avec le vecteur lentivirus LV3-hsa-miR-214 pourrait conduire à une 7 au changement 96 fois de miR-214 expression dans SGC7901 et MKN45 cellules (Figure S3A-D, P
< 0,05), avec 80% -90% de cellules exprimant la protéine marqueur GFP (Figure S3A, B)

pour déterminer si miR-214 pourrait affecter la prolifération des cellules du GC, essai de prolifération EdU a été utilisé pour. détecter la capacité de croissance des cellules. Nos données indiquent que la surexpression de miR-214 avec lentiviurs vecteurs ou miR-214 précurseur n'a pas influé sur la croissance des cellules de SGC7901 (figure 3A-B, figure S2C-D, P > 0,05) et des lignées de cellules MKN45 (figure S2E-F, Figure S5A-B, P > 0,05). Cependant, nous avons constaté que downregualtion de miR-214 pourrait favoriser la prolifération des BGC823 (figure 3C-D, P
= 0,0010) et GES-1 (Figure S4B-C, P
= 0.0474), mais pas MKN28 lignée cellulaire (Figure S5C-D, P
= 0,0938), d'une manière spécifique à la cellule.

Rôle de miR-214 dans la migration cellulaire et l'invasion de GC cellules

Comme miR-214 expression était inversement associée à des métastases ganglionnaires, nous étions particulièrement intéressés par la capacité miR-214 à affecter la migration et l'invasion cellulaire. Nos résultats indiquent que les cellules SGC7901 et MKN45 transfectées avec LV3-hsa-miR-214 a montré une diminution significative la migration et de la capacité d'invasion, par rapport à la LV3NC cellules traitées (figure 4A-B, Figure S6A-B, P
< 0,05). Et nous avons observé que downregualtion de miR-214 pourrait faciliter la migration et l'invasion de MKN28 (Figure 4C-D, P
= 0,0491 et P
= 0,0127, respectivement). Bien que knockdown de miR-214 n'a pas d'incidence sur la migration des GES-1 cellules (Figure S4D-E, P
= 0,0879), silencieux de miR-214 conduit à une augmentation de plus de 40% dans les propriétés invasives de ces cellules ( P
= 0,0046). Cependant, nos données ont montré que la transfection de miR-214 précurseur n'a pas eu un effet robuste sur la migration et l'invasion cellulaire en SGC7901 (Figure S2G-H, P
> 0,05) et MKN45 (Figure S2I-J, P
>. 0,05) des cellules, par rapport aux témoins négatifs respectifs

Influence de miR-214 sur l'apoptose cellulaire des cellules du GC

pour examiner l'effet de Mir- 214 sur l'apoptose des cellules, nous avons effectué des dosages d'apoptose en utilisant la méthode de coloration /PI Annexin V-FITC. Nos résultats ont démontré que la surexpression (miR-214 précurseur et un vecteur de lentivirus) et knock-down de miR-214 ne pouvaient pas affecter l'apoptose des cellules évidemment par rapport aux témoins négatifs dans des lignées cellulaires quatre GC (figure 5, la figure S2K-N, P
> 0,05) et immortalisés lignée cellulaire gastrique GES-1 (données non présentées). En fait, nous avons trouvé une tendance de la capacité pro-apoptose de miR-214 précurseur dans la lignée cellulaire MKN45 (Figure S2M-N, P
= 0,0606), cependant, la différence n'a pas été statistiquement significative.

miR-214 vise directement et régule à la baisse CSF1 dans les cellules de cancer gastrique

pour identifier les cibles de miR-214, nous avons utilisé l'algorithme TargetScan pour prédire miR-214 cibles dans le cancer gastrique humain. Parmi les nombreux candidats possibles, nous avons choisi à ceux surexprimé dans les cancers et les gènes et à la prolifération de métastases associées, y compris NOTCH2, FGFR1, CSF1 (figure 6A), AGAP2, CREB1, pour une analyse ultérieure. Nos résultats montrent que miR-214 précurseur de transfection a significativement réduit l'activité d'un gène rapporteur luciférase fusionné à la CSF1 3 'UTR, avec 29,60% et 30,61% de réduction par rapport aux groupes témoins négatifs (figure 6B, P
= 0,0227 et 0,0093, respectivement, pour les lignées de cellules MKN45 et BGC823). Tandis que, lorsque l'inhibiteur de miR-214 a été transfecté, l'activité luciférase a été augmenté de 34,49% et 42,25% dans les cellules MKN45 et BGC823 par rapport aux témoins (figure 6C P
= 0,0115 et 0,0085, respectivement).

Nous avons également déterminé l'expression de la protéine CSF1 par western blot dans les cellules transfectées avec GC miR-214 précurseur ou inhibiteur. Cohérentes avec les résultats de la luciférase, l'expression de la protéine CSF1 a été significativement réduite dans les cellules et SGC7901 MKN45 (figure 6D-E, P
= 0,0037 et 0,0066, respectivement) transfectées avec miR-214 et l'augmentation de précurseur dans MKN28 et BGC823 cellules (figure S7A-B P
= 0,0049 et 0,0416, respectivement) transfectées avec miR-214 inhibiteur, par rapport aux témoins respectifs. Ces données suggèrent que miR-214 inhibe la traduction CSF1 dans les cellules de cancer gastrique.

Discussion

De nouvelles preuves ont mis en évidence l'impact crucial des miRNA dysrégulation sur la tumorigenèse des carcinomes humains [3], [4] . MiRNA dysrégulation favorise la prolifération cellulaire, confère une résistance à l'apoptose, et améliore l'invasivité et les métastases, par la répression des suppresseurs de tumeurs en aval ou en induisant l'accumulation des oncogènes cibles, et est donc impliqué dans l'initiation, la progression et la métastase des tumeurs humaines.

Parmi la pléthore de miARN, dysrégulation de miR-214 a été trouvé dans beaucoup de cancers humains [15] - [22]. La régulation négative de miR-214 dans le cancer du col de l'utérus a été rapportée par plusieurs groupes, et miR-214 a été montré pour inhiber la croissance, la migration et l'invasion des cellules du cancer du col par des oncogènes ciblant MEK3, JNK1, Plexin-B1 et GALNT7 [15 ] - [17]. MiR-214 a également été trouvé pour être diminué dans le cancer du sein et de contribuer à la tumorigenèse du sein en permettant oncogène aberrantly élevée Ezh2 accumulation et à la prolifération cellulaire incontrôlée et l'invasion [18]. Cependant, Penna et al. ont montré que miR-214 est fortement exprimé dans les mélanomes humains et contribue à la progression tumorale du mélanome par la suppression des TFAP2C, un homologue d'un suppresseur de tumeur de mélanome bien établie [19]. Ces résultats indiquent que le rôle de miR-214 dans le cancer est spécifique tissu ou portable.

Une étude récente de Ueda et al. a montré que la dysrégulation de miR-214 a été corrélée avec le stade clinique, la diffusion péritonéale et la survie des patients [20]. Cependant, le rôle exact de miR-214 dans la progression du cancer de l'estomac et de son mécanisme moléculaire sous-jacent reste insaisissable. Ici, nous montrons que miR-214 a été sensiblement réduite en GC, en particulier dans les tissus métastatiques, ce qui suggère un rôle potentiel de miR-214 dans la prédiction des métastases ganglionnaires, qui a encore été pris en charge par notre analyse ROC de la courbe. En outre, nous avons constaté que la faible expression de miR-214 avait une inclinaison vers une taille de la tumeur plus grande. Pour faire face si la dysrégulation de miR-214 porte une signification biologique, nous avons utilisé une étude de suivi et d'analyse fonctionnelle de miR-214 in vitro
. Néanmoins, nos données suggèrent que miR-214 n'a aucun effet sur les résultats des patients, y compris le statut de la rechute et la survie. Nos données indiquent que la surexpression de miR-214 avec un vecteur de lentivirus miR-214 exprimant réduit considérablement la migration et l'invasion des lignées cellulaires GC et knock-down de miR-214 peut faciliter la prolifération cellulaire, l'apoptose, la migration et l'invasion d'une manière spécifique à la cellule, avec aucune influence sur l'apoptose cellulaire.

CSF1 (facteur stimulant les colonies 1 (macrophage)) est un facteur de croissance hématopoïétique critique impliquant la différenciation des cellules macrophages, la prolifération et l'activation et il est également présent dans les cellules non hématopoïétiques [21] . Le CSF-1 affecte la survie et la prolifération cellulaire par liaison à son récepteur codé par le gène c-fms [22]. Des études antérieures ont montré que CSF1 exerce un rôle important dans la promotion de l'angiogenèse tumorale chez un léiomyosarcome [23] et des cellules de carcinome du poumon de Lewis, par l'intermédiaire de l'induction du VEGF [24]. Aligeti S et al. suggéré que CSF1 a un effet positif sur de l'attachement à pleural mésothéliales cellules, l'invasion et la prolifération des cellules épithéliales de l'endomètre [25]. Et les concentrations sériques élevées de a été corrélée avec le stade de la maladie, des métastases ganglionnaires et de mauvais pronostic chez les patients atteints de cancer colorectal [26]. Ici, nous avons identifié CSF1 était une cible directe de miR-214 dans le cancer gastrique par des essais de luciférase et confirmée par une analyse Western blot. Nos données suggèrent que la régulation négative de miR-214 peut faciliter la capacité des cellules gastriques cancer par la voie de signalisation de CSF1 médiée prolifération, la migration et l'invasion.

Dans l'étude précédente, Ueda et al. a montré que l'expression relativement élevée de miR-214 GC a été associée à une survie globalement défavorable chez 101 patients (obtenu auprès de l'Université de Tokyo, Hiroshima University) [20] Cependant, nos données indiquent que miR-214 n'a pas été significativement corrélée avec le patient résultat. Nous supposons que cet écart peut être dû aux différentes méthodes de détection d'expression de miARN, la taille des échantillons, et le suivi temps entre leurs recherches et la nôtre. Ueda et al. divisé les échantillons en deux classes (expression haute et basse) en utilisant les niveaux moyens d'expression miRNA mesurée sur un microréseau de microARN comme un seuil, alors que notre division de groupes de haute et basse expression était basée sur le niveau médian d'expression acquise à partir des résultats de qPCR . Curieusement, dans des études précédentes, l'expression de miR-214 a été démontré que la régulation positive dans le cancer de l'ovaire par rapport aux cellules normales de l'ovaire par Yang et al. [27], alors que les résultats opposés ont été signalés par Nam et al. [28]. Les deux de ces deux groupes utilisés biopuces miARN pour examiner l'expression des miARN. Ainsi, nous ne pouvons pas exclure la possibilité que l'analyse des microréseaux peut ne pas être aussi sensible et précis dans l'analyse des profils d'expression d'un miARN spécifique. En ce qui concerne les effets de miR-214 sur le pronostic des patients atteints de GC, partiellement en accord avec les résultats de Ueda et al., Nous avons aussi constaté une tendance forte expression de miR-214 a été défavorable pour la survie lorsque le temps de suivi était plus de 40 mois (hazard ratio (HR) = 1,19 pour la survie globale, HR = 1,23 pour la survie sans récidive), comme le montre la figure 2, bien que la tendance ne soit pas statistiquement significative. Dans tous les cas, une enquête auprès d'une cohorte plus grande et différents paramètres expérimentaux sont nécessaires pour résoudre ce problème.

Quant à la discordance de miR-214 vecteurs lentivirus et précurseurs des essais de transfection, on conjecture qu'il est une conséquence spécifique de les activités biologiques de miR-214. Une expression modérée et stable plutôt que des dizaines de milliers de surexpression non-physiopathologique peut aider à miR-214 fonctionnent bien.

Dans l'ensemble, nous avons démontré que miR-214 a été sensiblement réduite en GC, en particulier dans les tissus métastatiques, suggérant un rôle potentiel de miR-214 dans la prédiction des métastases ganglionnaires. Notre analyse par courbe ROC a montré la spécificité relativement élevée et la sensibilité de miR-214 pour discriminer les cas de GC de contrôles nontumourous, et à séparer les patients avec et sans métastase ganglionnaire, incitant ainsi son utilité potentielle en tant que nouveau biomarqueur pour GC et métastase ganglionnaire, qui seront utiles pour faciliter la prise en charge clinique du GC. Cependant, nos données indiquent que miR-214 n'a aucun effet sur le pronostic du patient, ce qui indique que miR-214 seule ne suffit pas à affecter la survie des patients.

• PLOS ONE: des niveaux élevés de plasma D-dimères en corrélation avec la survie à long terme des patients atteints de cancer gastrique
• PLOS ONE: HIF-1 Alpha surexpression corrélats avec mauvaise survie globale et la survie sans maladie dans Gastric Cancer Patients post-gastrectomie