Plos ONE: Clinicopathological Pomen MicroRNA-214 želodčnega raka in njen učinek na mobilni Biološko Behaviour

Povzetek

kopičijo dokazi kažejo, da so številni microRNAs vključeni v tumorigeneze in napredovanje raka želodca, medtem ko je klinični pomen od microRNA-214 pri raku želodca slabo razumljen in natančna vloga microRNA-214 pri raku želodca ostaja nejasna. V tej študiji so stopnje izraženosti v microRNA-214 v 80 želodčnih karcinomom tkiv, 18 nontumourous želodca tkiv in 4 vrste želodčnega raka celičnih linijah količinsko z reverzno transkripcijo sledi v realnem času kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (RT-qPCR), ter razmerje med microRNA-214 izražanja in cliniopathological lastnostmi, vključno s prognozo bila raziskana. Da bi raziskali morebitno vlogo microRNA-214 v želodčni rak celic biološko obnašanje, smo izvedli širjenja celic, apoptoza, migracije in invazijo testov v štirih želodčnih raka celičnih linijah in imortalizirana celična linija želodca in vitro
. Naši rezultati so pokazali, da je bila microRNA-214 močno navzdol reguliranih v želodčnih tkivih rakom in želodca raka celičnih linij, v primerjavi s nontumourous želodčnih tkiva. opazili postopno downregulation od microRNA-214 izražanja med nontumourous želodčne sluznice, nonmetastasis želodčne rakavih tkiv in metastaze želodčne raka tkiva. Izraz microRNA-214 je precej obratno povezana z bezgavkah metastaz in velikost tumorja ni pa povezan z bolnikovo prognozo. Zunajmaternična izraz microRNA-214 lahko zavirajo migracijo celic in invazijo sposobnosti v SGC7901 in MKN45 raka želodca celic. In rasklapanje za microRNA-214 veliko lažji celično proliferacijo, migracijo in invazijo na način celice specifične v MKN28, BGC823 in celic GES-1. Kolonije stimulirajoči faktor 1 (CSF1) je bila opredeljena kot ciljna gena microRNA-214. Skratka, naši podatki pokazali, da je microRNA-214 obetaven nov biomarker za bezgavk metastaz pri bolnikih z rakom želodca. In smo ugotovili, da je downregulation za microRNA-214 lahko urejajo proliferacije, invazijo in migracije želodčnih rakavih celic, ki jih neposredno ciljanje CSF1

Navedba. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) Clinicopathological Pomen MicroRNA-214 želodčnega raka in njen vpliv na mobilni biološki vedenja. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10,1371 /journal.pone.0091307

Urednik: Terence Lee, University of Hong Kong, Hong Kong

Prejeto: 25. april 2013; Sprejeto: 11. februar, 2014; Objavljeno: 10 marec 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (št 81172351 in 81372856). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca (GC) je četrti najpogostejši rak in drugi najpogostejši vzrok smrtnosti zaradi raka na svetu [1]. Kljub precejšnjim študij o tumourigenesis in napredovanje GC je patogeneza te kompleksne bolezni slabo razumljen. Zato je ključnega klinično vrednost bi opredelile in natančen molekularni mehanizem, ki sodeluje pri razvoju in napredovanju raka želodca.

Poleg konvencionalne genetske in epigenetske spremembo, ki kodirajo proteine ​​onkogenov in tumorskih zaviralnih genov karcinogenosti GC, neproteinske kodiranja RNA, zlasti microRNAs (miRNAs), so se pojavile kot novega igralca osvetliti mehanizem razvoja GC [2]. MiRNAs so endogeni 19-25 nt nekodirano RNA, ki negativno uravnavajo izražanje proteinov s spodbujanjem razgradnjo mRNA ali zatiranje prevod beljakovin, skozi interakcijo s 3 'UTR tarčnih mRNA. Vedno več miRNAs so poročali, da sodelujejo v kancerogenosti in razvoj človeških raka, vključno z GC [2] - [4]. Ti miRNAs običajno dysregulated in delujejo bodisi kot tumorskih razbijal ali onkogeni v začetku in napredovanje človekovih karcinomov. Na primer, Tsukamoto sod. so pokazali, da je miR-375 navzdol reguliranih v karcinoma želodca in doseže svoj proapoptotičnih učinek prek downregulating PDK1, s kinazo, ki fosforilira Akt, in posledično zavira PI3K /Akt pot [5]. Medtem ko je bila miR-21 je ugotovljeno, da spodbuja tumorja proliferacijo in invazijo v GC, ki negativno regulacijo pomembnih tumorske valov kot PTEN, PDCD4 in Reck, nato pa daje GC celice s povečanim invazivnosti in sposobnost, da bi se izognili anoikis [6] - [8 ]. Prej smo ugotovili, da je bil miR-145 navzdol reguliranih v mnogoterih raka človeških celic in zatrl napad, metastaz kaskado v GC z zaviranjem N-kadherina beljakovin prevod [9], [10].

Trenutno klinični pomen microRNA-214 (miR-214) na prognozo bolnikov z GC slabo razumljen, in natančna vloga miR-214 v GC ostaja nejasna. Tukaj smo raziskovali povezavo med miR-214 izražanja in cliniopathological parametrov, kot tudi ocenili učinek miR-214 na bioloških vedenj, vključno proliferacije celic, apoptoza, migracije in invazije GC celic.

Materiali in metode

vzorce tkiva

tkivnega vzorca smo pripravili na podoben način, kot smo že prej opisali [9]. Na kratko, 80 vzorcev (od 65 moških, 15 žensk; 58,3 ± 17.49 in starih 61,5 ± 9,162 let, v tem zaporedju) z GC tkiv so bili pridobljeni pri bolnikih, ki so doživeli kirurško resekcijo na Qi Lu bolnišnici Shandong University od leta 2004 do 2006. Nontumourous želodčne sluznice več kot 3 cm stran od tumorjev smo naključno izbrali iz 18 od teh bolnikov in uporabimo kot kontrole. Nobeden od bolnikov je prejelo preoperativno zdravljenje, kot obsevanjem ali kemoterapijo. Osebki so vnesli histološko po Lauren in Svetovne zdravstvene organizacije (WHO) 's razvrstitve (IARC Press, Lyon, 2000), in razvrščene po UICC 2002 razvrščanju TNM.

Izjava Etika

študija je odobril Odbor za etiko School of Medicine, Shandong University, Shandong, China (oznaka homologacije: 201101015). Dobili smo pisno privolitev vseh udeležencev v naši raziskavi.

celične kulture

Štirje tipi humanih celičnih linijah GC so bili pridobljeni iz American Type Culture Collection (MKN28 in MKN45, Manassas, VA , ZDA) in Cancer Institute Shanghai (BGC823 in SGC7901, Šanghaj, Kitajska). Imortalizirana želodca sluznice epitelijskih celic linija GES-1 je bila pridobljena iz Pekinga ComWin Biotech Co, Ltd (Peking, Kitajska). Celice smo vzdrževali v RPMI 1640 gojišče kulture dopolnili z 10% fetalni goveji serum (FBS) v navlaženem inkubatorju celične z atmosfero s 5% CO _{2 pri 37 ° C.}

Mirne ekstrakcija

z miRNeasy FFPE Kit (Bioteke, Peking, Kitajska), smo izolirali Mirna od-parafin vgrajeni tkiva v skladu z navodili proizvajalca. Total RNA celičnih linij je bila vzeta s pomočjo TRIzola reagenta (Takara, Dalian, Kitajska) po protokolu proizvajalca. Kakovost in količina vzorcev RNA smo ocenili s standardnimi spektrofotometričnih metod (BioPhotometer plus; Eppendorf, Hamburg, Nemčija) in razredčimo na 2 ng /ul za analizo RT-qPCR

reverzno transkripcijo sledi v realnem času. kvantitativne verižne reakcije s polimerazo (RT-qPCR)

Mirna stopnje izraženosti so kvantitativno uporabo SYBR Primescript miRNA RT PCR Kit (Takara, Dalian, Kitajska), v skladu z navodili proizvajalca, ki imajo Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Real -time sistem. Na kratko, smo vzorce RNA pretvori v cDNA z enim korakom Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, Kitajska), sledijo realnem času qPCR in normalizirani z uporabo U6 majhna jedrska RNA (RNU6B), ki ga je 2 ^{-ΔCT Postopek. Temeljni premazi za pokoj-214 in U6 je bilo iz GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Vse reakcije smo izvedli v dveh izvodih.}

Cell transfekciji

eksponentni fazi rasti celic (1,5 x 10 ^{5) smo posejali v 12 vdolbinami 12 ur pred transfekciji in so transficirane s 30 nm miR-214 prekurzor (miR-214), anti-miR-214 inhibitor (miR-214 inhibitor) ali negativna kontrola (Ambion, Austin, TX, ZDA) z transfekciji reagenta X tremeGENE (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) po navodilih proizvajalca. Učinkovitost transfekciji smo kontrolirali s RT-qPCR pri 24, 48 in 72 ur po transfekciji.}

Za stabilno ekspresijo miR-214, smo SGC7901 in MKN45 celice transficirane z lentivirusni miR-214-izraža vektor LV3-HSA -miR-214 ali negativno kontrolo LV3NC, ki ima dobre kmetijske prakse, kot označevalnega beljakovine, po protokolu proizvajalca (GenePharma, Šanghaj, Kitajska). Tri dni po transfekciji smo izražanje GFP proteina spremlja pod fluorescenčnim mikroskopom. Transficirane celice so bili pregledani z puromicina (1,5 pg /ml), za tiste, stabilno izražajo MIR-214.

Cell širjenje test

Po transfekciji smo trypsinised celice, preštet in zasejali 96 No plošče na gostoto 5 × 10 ^{3 celic /dobro. In potem je proliferacijo celic izmerjena z uporabo testa Edu proliferacije, kot smo že poročali [11]. Na kratko, 24 ur po transfekciji so celice gojili v treh izvodih na 5 x 10 3 celic na dobro v 96 vdolbinami dan pred ESD inkubacije (Ribobio, Guangzhou, Kitajska). Po EDU označevanje, smo celice obdelali s 100 ml 1 x Apollo reakcijski koktajl, obarvane z 100 p.L Hoechst 33342 (5 mg /ml) in vizuali pod fluorescenčnim mikroskopom (Olympus, Japonska). Odstotek Edu pozitivnih celic, je opredeljena kot stopnja jedrskega orožja. Podatki so bili pridobljeni iz treh neodvisnih poskusov in prikažejo kot sredstva ± standardni odklon (SD).}

Cell apoptoza test

Tri dni po transfekciji miR-214 predhodnik ali inhibitor, smo zbrali celice in obarvajo uporabo v-FITC /PI apoptoze Detection Kit aneksina (BestBio, Šanghaj, Kitajska), kot je opisano zgoraj [12]. Na kratko, tripsiniziramo celice, zbrane in nato obarvajo z aneksinom V-FITC /PI Apoptoza Detection Kit po navodilih proizvajalca. Po inkubaciji z aneksinom V-FITC in PI, so apoptotske celice takoj analiziramo s pretočno citometrijo. Zgodnje so apoptotske celice opredeljeno kot prebivalstvo, ki je bil PI negativen in aneksin V-FITC pozitiven, medtem ko je bilo prepozno apoptotske celice PI pozitiven in aneksin V-FITC pozitiven. Skupna apoptotske stopnja je bila izračunana kot zgodnji apoptoze mere, povečane za pozno apoptoze stopnji. Aneksin V-PE /7-AAD Apoptoza Detection Kit (keygen, Nanjing, Kitajska) je bil uporabljen za apoptozo testom lentivirusom vektorskih transfekciji celic, podobnih zgoraj navedenih protokolov. Vsak poskus je bil izveden v treh izvodih, in podatki so bili predstavljeni kot sredstvo ± SD.

migracija celic in invazijo testi

Cell migracije in invazijo teste smo izvedli kot je opisano prej [13]. Migracije test je bil izveden z Transwell vložki z 8,0 mm velikost por membrane (format 24 vdolbinami, Corning, New York, ZDA). Za merjenje invazijo sposobnost GC celic, prej omenjene vložki so bili predhodno prevlečeni s Študiie matriko (BD znanost, Sparks, MD, ZDA). Celice (1 x 10 ^{5) smo ponovno suspendirali v mediju brez seruma in zasejali v zgornjo komoro. Spodnji zbornice so bile napolnjene s celotno gojišče kulture, ki vsebuje 10% FBS. Po inkubaciji pri 37 ° C za 24 ur, so bile določene, obarvane in prešteli prehajali celice prisotne na spodnji strani membrane. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.}

bile izvedene luciferazni test

Dual-luciferaza testi kot je opisano predhodno [9]. 3'-UTR fragmenti CSF1 gena, ki vsebuje miR-214 vezavno mesto smo pomnožili s PCR iz celične RNA MKN45 uporabo primerje v tabeli S1, in vstavi v Xba1 mestu pmirGLO miRNA ciljne izražanja vektor (Promega, San Lius Obispo, CA, ZDA). Nastalo Vektor je bil imenovan pmirGLO-CSF1. Za luciferazno reporterskega testa so MKN45 in BGC823 celice zasejali v 12 vdolbinicami dan pred transfekcijo. Celice so co-transfekciji s 30 nM miR-214 predhodnik ali inhibitor miR-214, negativna kontrola in 30 ng pmirGLO-CSF1 uporabo X-tremeGENE transfekcijske reagenta (Roche Applied Science). Po 48 h transfekciji luciferazno aktivnost merijo v sistem dvojnega luciferazni test (Promega) in normalizirano do Renilla luciferazne aktivnosti. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih.

Western blot

Na 48 ur po transfekciji s miR-214 predhodnik ali inhibitor, so celice izpostavljene zahodni blot analizo kot prej [19] opisano. Na kratko smo protein pridobljen iz celic ali tkiv. Lizati so razrešili elektroforeza, prenesli na nitrocelulozne membrane in opral s protitelesi proti CSF1 (1:1000, Epitomics) ali beta-aktin (1:1000, Santa). Podatki so bili pridobljeni iz treh neodvisnih poskusov.

Statistična analiza

Analize so bile izvedene s pomočjo statističnega paketa Prism 5 programsko opremo (GraphPad programske opreme, San Diego, CA, ZDA). Razlike so bili analizirani s Student je t
-test med dvema skupinama ali z enosmerno ANOVA med tremi skupinami. Korelacija med miR-214 izražanja in velikost tumorja v osnovni GC je bila izračunana s korelacijo Spearman je. V krivulji preživetja, so bili podatki analizirani z Log-rank test. Da bi ugotovili, v kolikšni meri bi izraz miR-214 učinkovito ločevanje različnih kliničnih subsettings, sprejemnik deluje analiza lastnost (ROC) krivulja je bila izdelana in površino pod krivuljo (AUC) je bila izračunana za oceno sposobnosti miR-214 izražanja razlikovanja med primerov raka in nontumourous primerih, in za razlikovanje metastaznih tkiv in nonmetastatic tkiva. P
-values ​​manj kot 0,05, so bile obravnavane statistično značilne.

Rezultati

MIR-214 je navzdol reguliranih v želodčnih karcinomom tkiv in štiri celičnih linij GC, v primerjavi z nontumourous želodčne sluznice

v primerjavi s 18 nontumourous želodca vzorcev sluznici, miR-214 je precej navzdol reguliranih (približno šestkrat) v 80 osnovnih vzorcev želodca tkiva (slika 1A, P
= 0.0001). Sprejemnik deluje značilne (ROC) krivulje miR-214 odraža močno ločevanje med GC tkiv in nontumourous tkiv, s površino pod krivuljo (AUC) za 0.7764 (slika S1A, 95% interval zaupanja (CI), 0,6466-,9062). Dosledno je downregulation miR-214 potrjena v štirih želodčnih celičnih linijah. Kot je prikazano na sliki 1C, je miR-214 nivo izražanja v GC celičnih linijah MKN28, BGC823, MKN45 in SGC7901 z izrazito oslabljenim v primerjavi z 18 nontumourous vzorcev želodca tkiva ( P
< 0,05).

Vendar smo odkrili celo nižjo ekspresijo miR-214 v GES-1, kot nesmrtno želodčne epitelno celične linije, kot v štirih GC celičnih linij (slika 1C, P
< 0,05). Smo špekulirati neskladnost lahko zaradi vsaj deloma z razliko med kliničnimi vzorci in celičnih linij, ker celična linija izolirana od enega bolnika z določeno boleznijo, predstavlja miRNK ekspresije podpis enega samega kliničnega vzorca in lahko spremembe med celico kultura in vitro
; Z drugimi besedami, vzorce tkiva so veliko bolj kot človeško okviru kot celičnih linij. Tako smo pripombe, da je miR-214 izraz v človeških GC tkivih bolj reprezentativen in verodostojen, kot je ugotovljeno v celičnih linijah.

Zmanjšana miR-214 izraz v GC je povezana z bezgavkah metastaz in velikost tumorja, vendar nima korelacija z prognoze bolnik

Da bi ugotovili morebitne clinicopathological posledice spremenjeni miR-214 izražanja, smo združili rezultate qPCR in kliničnih parametrov. Korelacije med stopnjo miR-214 izražanja in clinicopathological značilnosti GC so zbrani v tabeli 1. MIR-214 izraz je obratno povezana z velikostjo tumorja (Tabela 1, t
-test, P
= 0,0265, slika 1D, Spearman r = -0,2673, P
= 0,0083) in bezgavko metastaze (tabela 1, Figure1A, t
-test, P
= 0,0164). Vendar pa ni bilo bistvene razlike v drugih clinicopathological značilnosti, kot so spol, distalnem metastaze, WHO histološko razvrščanje in histološki tip Lauren med tema dvema skupinama.

Zanimivo, smo ugotovili, postopni downregulation Mir-214 med nontumourous želodca sluznice, nonmetastasis tkiva in metastaze tkiva (slika 1A, enosmerna ANOVA, P
= 0,0006). Da bi ocenili miR-214 izraz v GC kot nov biomarker za bezgavkah metastaze, so bile določene ROC krivulje. Opazili smo jasno ločevanje med bolniki z bezgavkah metastaze in tiste brez bezgavkah metastaze, z AUC 0.5880 (slika S1B, 95% CI, 0,4526-,7166). Primarni želodčne tkiva smo jih razdelili v skupine z nizkimi metastaz in visoke metastaziranje skupino po številu bezgavk metastaz (LNM): nizka metastaze bil opredeljen kot primere z manj kot šestimi LNM in primeri z več kot šest LNM je štela za visoko metastaz. Kot je bilo pričakovati, je miR-214 izraz drastično zmanjšal v skupini z visokim metastaz v primerjavi s skupino z nizko metastaz (slika 1B, P
= 0,045).

V skladu z vzorcem tkiva podatki, ki kažejo na povezavo med miR-214 izražanja in LNM, smo ugotovili, da je bila v primerjavi z zmerno dobro diferenciranega celične linije MKN28 miR-214 izraz precej manj v slabo diferenciranih celičnih linij MKN45 in BGC823 in predvsem celični liniji metastatskega SGC7901 [14] ( P
< 0,05)

Vendar pa naši podatki so pokazali, da ni značilnih razlik v miR-214 izražanja v 18 osnovnih vzorcev želodčnega tkiva in srednjo metastaz lokusov (Slika 1B. P
= 0,2676). Ti rezultati kažejo, da downregulation miR-214 izraza prišlo v zgodnji fazi razvoja LNM in ostal stabilen brez nadaljnje slabljenje v pozni fazi metastaz.

Da bi še dodatno raziskati učinek miR-214 na prognozo bolnikov smo analizirali raven izražanja mir-214 v primerih z različnimi stanja ponovitev bolezni in preživetje pogojih. Vendar pa so naši podatki kažejo, da ni bilo izrazite razlike med skupino, zagonov in skupine nonrelapse ali med skupino za preživetje in smrtno skupine (Slika 2A-B, t
-test, P
> 0,05). Pomembno je omeniti, smo razdelili bolnike v visoki izražanja in nizko izražanja skupin, ki temeljijo na srednjo stopnjo miR-214 izražanja in Kaplan-Meier krivulji preživetja ni pokazala pomembno povezanost med miR-214 izražanja in ponovitev bolezni, preživetje brez (slika 2C razmerje ogroženosti (HR) 1,23, 95% interval zaupanja (CI) ,6596-2,285; P
= 0,5781) in celokupno preživetje (slika 2D, HR 1,20, 95% CI ,6667-2,151; P
= 0,5832) pri bolnikih z GC.

Vpliv miR-214 na celično proliferacijo GC celic

za spremljanje učinkovitosti transfekciji smo ugotovili miR-214 izražanje RT-qPCR na 24, 48 in 72 ur po transfekciji pri predhodnika miR-214 in inhibitor transficirane celice in stalno Zaznali miR-214 ekspresijo lentivirusom vektorjev obdelanih celic 4 tedne. Kot je bilo pričakovati, transfekcija prekurzorja miR-214 učinkovito povzročila znatno prekomerno miR-214 (slika S2A-B P
< 0,05) in inhibitor miR-214 presenetljivo zmanjša miR-214 ekspresijo v miR- 214-inhibitor transfektiramo celice kot negativnih skupin (Slika S3E-F, slika S4 A P
< 0,05). Prav tako smo ugotovili, da lahko celice transficirane z lentivirusni vektor LV3-HSA-pokoj-214 vodilo v 7 do 96-kratno spremembo miR-214 izražanja v SGC7901 in MKN45 celice (Slika S3A-D, P
< 0,05), z 80% -90% celic, ki izražajo GFP marker proteina (slika S3A, B)

Če želite ugotoviti, ali bi miR-214 vpliva na širjenje GC celic, edu proliferacije je bil nekoč. odkriti sposobnost rasti celic. Naši podatki so pokazali, da prekomerno miR-214 s lentiviurs vektorjev ali miR-214 predhodnika ni vplivalo na rast celic SGC7901 (Slika 3A-B, Slika S2C-D, P > 0,05) in celičnih linij MKN45 (Slika S2E-F, slika S5A-B, P > 0,05). Vendar pa smo ugotovili, da je downregualtion Mir-214 lahko spodbujajo širjenje BGC823 (slika 3C-D, P
= 0,0010) in GES-1 (Slika S4B-C, P
= 0,0474), vendar ne MKN28 celična linija (Slika S5C-D, P
= 0,0938), na način, celice specifične.

Vloga miR-214 v celični migraciji in invazijo GC celice

Kot je miR-214 izraz obratno povezana z bezgavkah metastaze, smo bili še posebej zanima sposobnost miR-214, da vpliva na migracijo celic in invazijo. Naši rezultati so pokazali, da SGC7901 in MKN45 celice transfekciji s LV3-HSA-miR-214 je pokazala bistveno zmanjšal migracije in invazijo zmogljivosti v primerjavi s LV3NC zdravijo celice (slika 4A-B, slika S6A-B, P
< 0,05). In smo opazili, da je downregualtion Mir-214 bi lahko olajšala migracijo in vdor MKN28 (slika 4C-D, P
= 0,0491 in P
= 0,0127, v tem zaporedju). Čeprav rasklapanje miR-214 ni vplivala na migracije ges-1 celic (Slika S4D-E, P
= 0,0879), dušenje zvoka miR-214 je privedla do povečanja več kot 40% v invazivnih lastnostih teh celic ( P
= 0,0046). Vendar pa so naši podatki kažejo, da transfekciji miR-214 predhodnik ni imel močan vpliv na celični migraciji in invazije v SGC7901 (slika S2G-H, P
> 0,05) in MKN45 (Slika S2I-J, P
>. 0,05) celice, v primerjavi z ustreznim negativnih kontrol

vpliv miR-214 na celično apoptozo GC celic

da bi preučili vpliv miR- 214 na celične apoptoze, smo izvedli apoptoze teste z uporabo /PI metodo barvanja aneksin v-FITC. Naši rezultati pokazali, da prekomerno (miR-214 predhodnik in lentivirusni vektor) in rasklapanje miR-214 ni mogla vplivati ​​na apoptozo celic seveda v primerjavi z negativnimi kontrolami v celičnih linijah štiri GC (Slika 5, Slika S2K-N, P
> 0,05) in imortalizirana želodca celične linije GES-1 (podatki niso prikazani). V bistvu smo ugotovili tendenco pro-apoptozo sposobnost miR-214 predhodnik v celični liniji MKN45 (Slika S2M-N, P
= 0,0606), vendar pa razlika ni bila statistično značilna.

MIR-214 neposredno cilja in navzdol ureja CSF1 v želodčnih rakavih celic

za opredelitev ciljev miR-214, smo vajeni TargetScan algoritem za napovedovanje miR-214 ciljev na raka človeške želodčne. Med številnimi možnimi kandidati, smo izbrali tiste, izraženi pri rakih in proliferacijsko in-metastazami, povezanih genov, vključno NOTCH2, FGFR1, CSF1 (slika 6A), AGAP2, CREB1, za nadaljnjo analizo. Naši rezultati so pokazali, da miR-214 prekurzor transfekciji znatno zmanjšal aktivnost luciferaze reporterskega gena zlit k CSF1 3'-UTR, s 29.60% in 30.61% zmanjšanje v primerjavi z negativnimi skupine kontrole (slika 6B, P
= 0,0227 in 0,0093, oziroma za MKN45 in BGC823 celičnih linij). Ker ko smo transfektirali miR-214 inhibitor je luciferazno aktivnost povečala za 34,49% in 42.25% v MKN45 in BGC823 celic v primerjavi s kontrolami (slika 6C, P
= 0,0115 in 0,0085, oziroma).

Nadaljevali smo določili izražanje CSF1 beljakovin z Western blot v GC celicah transfekciji z miR-214 predhodnik ali zavira. Skladni z luciferazo rezultati, je bil izraz CSF1 beljakovin bistveno zmanjšala v SGC7901 in MKN45 celic (Slika 6d-E, P
= 0,0037 in 0,0066, oziroma) transfekciji s miR-214 predhodnik in povečal MKN28 in BGC823 celice (Slika S7A-B, P
= 0,0049 in 0,0416, oziroma) transfekciji s miR-214 inhibitor, v primerjavi z ustreznimi kontrolami. Ti podatki kažejo, da miR-214 zavira CSF1 prevod v želodcu rakavih celic.

Pogovor

nastajajočih dokazov je poudaril ključni vpliv miRNA disregulacijo na tumourigenesis človekovih karcinomov [3], [4] . MIRNA disregulacijo spodbuja proliferacijo celic, daje odpornost na apoptozo in krepi invazivnosti in metastaze, skozi zatiranje tumorske valov na nižji stopnji ali napeljati kopičenje ciljnih onkogeni, in tako je vključena v začetek, napredovanje in metastaze človeških tumorjev.

Med množico miRNAs, disregulacijo miR-214 je na voljo v veliko človeških raka [15] - [22]. Downregulation miR-214 pri raku materničnega vratu, so poročali o več skupin, in miR-214 je bilo dokazano, da zavira rast, migracije in napad na materničnem vratu rakavih celic, ki ciljajo onkogeni MEK3, JNK1, pleksin-B1, in GALNT7 [15 ] - [17]. MIR-214 je bilo tudi ugotovljeno, da se je zmanjšala pri raku dojke in prispevajo k tumourigenesis dojk, ki omogoča odklonsko povišana onkogensko Ezh2 kopičenju in kasnejše širjenje nepreverjenih celic in invazijo [18]. Vendar Penna sod. so pokazale, da je miR-214 zelo izražene v človeških melanomov in prispeva k melanoma napredovanja tumorja skozi zatiranje TFAP2C, ki je homolog uveljavljenem melanoma zaviralnih [19]. Ti rezultati kažejo, da je vloga miR-214 pri raku tkivo ali celično specifičen.

Nedavna študija Ueda et al. je pokazala, da je bila disregulacijo miR-214 v korelaciji s kliničnimi fazi, peritonealna širjenju in preživetju bolnikov [20]. Vendar pa je natančna vloga miR-214 v napredovanje želodčnega raka in njegovega osnovnega molekularni mehanizem še vedno nedosegljiva. Tukaj bomo pokazali, da je bila miR-214 bistveno zmanjša v GC, zlasti v metastatskih tkivih, kar kaže na potencialno vlogo miR-214 pri napovedovanju limfnega vozla metastaze, ki je še dodatno podprta z naše analize ROC krivulje. Poleg tega smo ugotovili, da ima nizko izražanje miR-214 nagib v smeri večje velikosti tumorja. Za reševanje ali disregulacijo miR-214 nosi biološki pomen, smo uporabili za nadaljnje raziskave in funkcionalno analizo miR-214 in vitro
. Kljub temu so naši podatki kažejo, da ima miR-214 ne vpliva na izid pacientov, vključno s statusom zagonov in preživetje. Naši podatki so pokazali, da prekomerno miR-214 z lentivirusni miR-214-izraža vektor dramatično zmanjšala migracije in vdor GC celičnih linij in rasklapanje Mir-214, bi lahko olajšale proliferacije celic, apoptozo, migracije in invazijo na način celice specifične, s brez vpliva na celično apoptozo.

CSF1 (kolonije spodbujajoči faktor 1 (makrofagov)) je kritičen hematopoetski rastni faktor, ki vključuje v makrofagov celično diferenciacijo, proliferacijo in aktivacijo in je prisotna tudi v ne-hematopoetičnih celic [21] . CSF-1 vpliva na celično preživetje in širjenje prek vezavo na njegov receptor, ki ga kodira c-FMS gena [22]. Prejšnje študije so pokazale, da CSF1 izvajal pomembno vlogo pri spodbujanju tumorja angiogenezo v leiomiosarkomom [23] in Lewis pljuč celic karcinoma preko VEGF indukcijo [24]. Aligeti S et al. Predlaga se, da ima CSF1 pozitiven učinek na navezanosti na plevralni mesothelial celic, invazijo in proliferacije endometrija epitelnih celic [25]. In povišane koncentracije v serumu je bila povezana s stopnjo bolezni, bezgavkah metastaze in slabo prognozo pri bolnikih z rakom debelega črevesa [26]. Tu smo ugotovili CSF1 bil neposreden cilj miR-214 v raka želodca skozi luciferazne teste in dodatno potrjuje zahodni analizo blot. Naši podatki kažejo, da se lahko downregulation miR-214 olajšanje zmogljivosti orožja, migracije in invazijo želodčne celice raka prek-CSF1 posredovanega signala poti.

V prejšnji raziskavi, Ueda et al. pokazala, da je relativno višji izraz miR-214 v GC povezana z neugodnim celokupno preživetje pri 101 bolnikih (pridobljene iz Univerze v Tokiu in Hiroshima University) [20], pa so naši podatki kažejo, da miR-214 ni bila značilno povezana z bolnikom izid. Domnevamo, da je lahko ta razlika posledica različnih metod miRNA izražanja odkrivanja, velikosti vzorcev in spremljanje krat med njihovih raziskavah in naše. Ueda sod. razdeljen vzorcev v dva razreda (visoke in nizke izražanja) s pomočjo povprečnih vrednosti miRNA izražanja, merjeno na microRNA mikromrež kot prag, medtem ko je bila naša delitev visokih in nizkih izražanja skupine glede na srednjo raven izražanja, pridobljenih iz rezultatov qPCR . Zanimivo, v predhodnih študijah, miR-214 ekspresijo Dokazano je, da bo povečana pri raku na jajčnikih v primerjavi z normalnimi celicami na jajčnikih po Yang et al. [27], medtem ko je bilo ravno nasprotno poročali Nam et al. [28]. Oba od teh dveh skupin se uporablja Mirna mikromrež preučiti izraz Mirne. Tako ne moremo izključiti možnosti, da analize mikromrež ne sme biti tako občutljiva in natančna pri analizi profile izražanja določenega miRNA. Kot za učinek miR-214 na prognozo bolnikov z GC, delno skladen z rezultati Ueda et al., Smo ugotovili tudi težnjo, da je visoka ekspresija miR-214 neugodno za preživetje, ko je bil nadaljevanje čas dlje kot 40 mesecev (razmerje ogroženosti (HR) = 1,19 za celokupno preživetje, HR = 1,23 za preživetje brez recidiva), kot je prikazano na sliki 2, čeprav trend ni bila statistično značilna. V vsakem primeru so potrebne nadaljnje raziskave z večjim kohorte in različnih eksperimentalnih nastavitev za rešitev tega vprašanja.

Glede neusklajenosti miR-214 lentivirusom vektorjev in predhodnimi transfekcijskih testih smo Domnevamo, da je posebna posledica biološke aktivnosti miR-214. Zmerno in stabilno izraz namesto deset tisoč, ki niso fiziopatoloških overexpresion lahko pomaga miR-214 funkcijo dobro.

Če povzamemo, smo pokazali, da je bila miR-214 bistveno zmanjša v GC, zlasti v metastatskih tkivih, kar kaže, potencialna vloga miR-214 pri napovedovanju limfnega vozla metastaz. Naša ROC analiza krivulja pokazala relativno visoko specifičnost in občutljivost miR-214 za razlikovanje primerov GC iz nontumourous nadzora, in ločevanje bolnikov z in brez bezgavk metastaz, kar spodbuja njeno potencialno uporabnost kot nova biomarkerja za GC in bezgavkah metastaze, ki bo v pomoč za lažje klinično upravljanje GC. Vendar pa so naši podatki kažejo, da ima miR-214 ne vpliva na prognozo bolnikov, kar pomeni, da sam miR-214 ni dovolj, da vplivajo na preživetje bolnikov.

• Plos ONE: Zvišane Plasma D-Dimerne Ravni Povezal z dolgoročno preživetje želodčnega raka bolnikov
• Plos ONE: HIF-1 Alpha Čezmerno sovpada s splošno slabo Preživetje in bolezni, preživetje brez želodčnega raka bolnikih po odstranitvi želodca