PLOS ONE: Significado clínico-patológico de microRNA-214 no câncer gástrico e seu efeito sobre célula biológica Behaviour

Abstract

Evidências acumuladas indicam que numerosos microRNAs estão envolvidos na tumorigênese e progressão do câncer gástrico, enquanto o significado clínico de microRNA-214 em câncer gástrico é mal compreendida e o papel exacto do microRNA-214 em câncer gástrico permanece obscura. No presente estudo, os níveis de expressão de microRNA-214 em 80 tecidos carcinoma gástrico, 18 tecidos gástricos nontumourous, e 4 tipos de linhas celulares de cancro gástrico foram quantificados através de transcrição reversa seguido em tempo real por reacção em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR), ea relação entre a expressão de microRNA-214 e as características cliniopathological incluindo prognóstico foi explorada. Para investigar o papel potencial do microRNA-214 em comportamento biológico de células de câncer gástrico, realizamos ensaios de proliferação celular, apoptose, migração e invasão em quatro linhas celulares de cancro gástrico e uma linha celular gástrica imortalizado in vitro
. Os nossos resultados mostraram que microARN-214 foi dramaticamente regulada negativamente em tecidos de cancro gástrico e linhas celulares de cancro gástrico, em comparação com os tecidos gástricos nontumourous. Observou-se a regulação baixa gradual de expressão microRNA-214 entre mucosa gástrica nontumourous, nonmetastasis tecidos de câncer gástrico, e metástase tecidos de câncer gástrico. A expressão de microRNA-214 foi significativamente inversamente correlacionada com metástases em linfonodos e tamanho do tumor, mas não teve correlação com o prognóstico do paciente. A expressão ectópica de microRNA-214 pode inibir a migração celular e capacidade de invasão em células de câncer gástrico SGC7901 e MKN45. E knockdown de microARN-214 facilitou significativamente a proliferação celular, migração e invasão de um modo específico de células em MKN28, e as células BGC823 GES-1. Factor estimulante de colónias 1 (CSF1) foi identificado como um gene alvo de microARN-214. Em resumo, os nossos dados demonstram que microRNA-214 é um romance biomarcador promissor para metástase linfática em pacientes com câncer gástrico. E identificou-se que a regulação baixa de microRNA-214 pode regular a proliferação, invasão e migração de células cancerosas gástricas diretamente pela segmentação CSF1

Citation:. Wang YW, Shi DB, Chen X, Gao C, Gao P (2014 ) Significado clínico-patológico de microRNA-214 no câncer gástrico e seu efeito sobre célula biológica Comportamento. PLoS ONE 9 (3): e91307. doi: 10.1371 /journal.pone.0091307

editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 25 Abril 2013; Aceito: 11 de fevereiro de 2014; Publicação: 10 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81172351 e 81372856). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o quarto câncer mais comum ea segunda causa de mortalidade por cancro em todo o mundo [1]. Apesar dos estudos consideráveis ​​na tumorigénese e progressão da GC, a patogênese da doença complexa é mal compreendida. Assim, é de valor clínico vital identificar e caracterizar o mecanismo molecular preciso envolvido no desenvolvimento e progressão do carcinoma gástrico.

Para além da alteração genética e epigenética convencional de oncogenes que codificam proteínas, e genes supressores de tumores em processo de carcinogênese do GC, RNAs não protéicas de codificação, especialmente microRNAs (miRNAs), surgiram como um novo jogador para lançar luz sobre o mecanismo de desenvolvimento GC [2]. MiRNAs são endógenos 19-25 RNAs não codificadores nt que regulam negativamente a expressão da proteína através da promoção da degradação do mRNA ou reprimir a tradução da proteína, por meio da interação com o 3'-UTR de mRNAs alvo. Um número crescente de miARNs têm sido relatados para participar na carcinogénese e no desenvolvimento de cancros humanos, incluindo GC [2] - [4]. Estes miRNAs são geralmente desregulado e função ou como supressores tumorais ou oncogenes na iniciação e progressão de carcinomas humanos. Por exemplo, a Tsukamoto et ai. demonstraram que o miR-375 é regulada negativamente no carcinoma gástrico e exerce o seu efeito através da regulação negativa proapoptótica PDK1, uma quinase que fosforila Akt, e, por sua vez, inibe a via PI3K /Akt [5]. Enquanto o miR-21 foi encontrado para promover a proliferação e invasão do tumor em GC, regulando negativamente supressores de tumores importantes, tais como PTEN, PDCD4, e RECK, e, em seguida, confere células de GC com aumento da capacidade de invasão e a capacidade de evitar a anoikis [6] - [8 ]. Anteriormente, verificou-se que o miR-145 foi regulada negativamente em células de cancro humano múltiplas e suprimiu a cascata invasão de metástases em GC por inibição da tradução da proteína N-caderina [9], [10].

Actualmente, o significado clínico de microRNA-214 (miR-214) no prognóstico de pacientes com GC é mal compreendido, e o papel exacto do miR-214 em CG permanece incerto. Aqui, nós investigamos a associação entre o miR-214 parâmetros de expressão e cliniopathological, bem como avaliou o efeito do miR-214 em comportamentos biológicos, incluindo proliferação celular, apoptose, migração e invasão das células GC.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

As amostras de tecido foram preparados de um modo semelhante ao descrito anteriormente [9]. Resumidamente, 80 amostras (de 65 homens, 15 mulheres; 58,3 ± 17,49 e 61,5 ± 9,162 anos, respectivamente) de tecidos GC foram obtidos de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica no Qi Lu Hospital da Universidade de Shandong, de 2004 a 2006. mucosa gástrica Nontumourous mais de 3 cm de distância de tumores foi selecionado aleatoriamente a partir de 18 desses pacientes e utilizados como controle. Nenhum dos doentes recebeu tratamento pré-operatório, tal como terapia de radiação ou quimioterapia. Os espécimes foram digitados histologicamente de acordo com Lauren e da Organização Mundial da Saúde (OMS) de classificações (IARC Press, Lyon, 2000), e classificados de acordo com a UICC 2002 classificação TNM.

declaração Ética

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Shandong, Shandong, China (código de aprovação: 201101015). Obtivemos consentimento informado por escrito de todos os participantes envolvidos no nosso estudo.

cultura celular

Quatro tipos de linhas celulares GC humanos foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (MKN28 e MKN45, Manassas, VA , EUA) e do Instituto Shanghai Câncer (BGC823 e SGC7901, Xangai, China). A linha de mucosa gástrica imortalizado células epiteliais GES-1 foi obtido a partir de Pequim ComWin Biotech Co., Ltd. (Pequim, China). As células foram mantidas em RPMI 1640 meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) numa incubadora humidificada de células com uma atmosfera de 5% de CO _{2 a 37 ° C.}

miARN extracção

Usando um Kit miRNeasy FFPE (Bioteke, Beijing, China), foram isoladas miRNA a partir de tecidos embebidos em parafina de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total das linhas de células foi extraído usando o reagente Trizol (Takara, Dalian, China) seguindo o protocolo do fabricante. A qualidade e quantidade das amostras de ARN foram avaliadas por métodos espectrofotométricos padrão (BioPhotometer plus; Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) e diluiu-se para 2 ng /ul para análise RT-qPCR

transcrição reversa seguido de tempo real. quantitativa da reacção em cadeia da polimerase (RT-qPCR)

os níveis de expressão de miARN foram quantificados utilizando um kit SYBR Primescript miARN RT PCR (Takara, Dalian, China) de acordo com as instruções do fabricante, com um Bio-Rad ™ CFX 96 C1000 real sistema -time. Resumidamente, as amostras de RNA foram convertidos em ADNc por uma etapa de um Primescript miRNAcDNA Synthesis Kit (Takara, Dalian, China), seguido de qPCR em tempo real e normalizado utilizando U6 ARN nuclear pequeno (RNU6B) pela 2 ^{-ΔCT Método. Primers para miR-214 e foram U6 de GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Todas as reacções foram corridas em duplicado.}

transfecção celular

células em crescimento exponencial (1,5 × 10 ^{5) foram semeadas em placas de 12 poços 12 h antes da transfecção e foram transfectadas com 30 nM precursor de miR-214 (miR-214), anti miR-214-inibidor (miR-214 inibidor), ou o controle negativo (Ambion, Austin, TX, EUA) utilizando o reagente de transfecção X-tremeGENE (Roche Applied Science, Indianapolis, nA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência de transfecção foi monitorizada por meio de RT-qPCR às 24, 48, e 72 h após a transfecção.}

Para a expressão estável de miR-214, células SGC7901 e MKN45 foram transfectadas com lentivírus de miR-214 que expressam o vector HSA-LV3 -miR-214 ou um controlo negativo LV3NC, que tem GFP como um marcador de proteína, de acordo com o protocolo do fabricante (GenePharma, Xangai, China). Três dias após a transfecção, a expressão da proteína GFP foi monitorizada com um microscópio de fluorescência. As células transfectadas foram rastreados com puromicina (1,5 ug /mL) para os que expressam de forma estável o miR-214.

proliferação celular ensaio

Após a transfecção, as células foram tripsinizadas, contadas e semeadas em 96 bem placas a uma densidade de 5 x 10 ^{3 células /poço. E, em seguida, a proliferação celular foi medida utilizando o ensaio de proliferação EdU como relatado anteriormente [11]. Resumidamente, 24 h após a transfecção, as células foram cultivadas em triplicado, a 5 x 10 3 células por poço em placas de 96 poços no dia anterior EdU incubação (Ribobio, Cantão, China). Após a marcação edu, as células foram tratadas com 100 ul de 1 × Apollo cocktail de reacção, coradas com 100 ul de Hoechst 33342 (5 ug /mL) e visualizados sob um microscópio de fluorescência (Olympus, Japão). A percentagem de células positivas edu foi definida como a taxa de proliferação. Os dados foram obtidos a partir de três experiências independentes e apresentados como médias ± desvio padrão (SD).}

apoptose celular ensaio

Três dias após a transfecção de miR-214 percursor ou inibidor, as células foram recolhidas e coradas usando o V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit Anexina (BestBio, Xangai, China) como anteriormente descrito [12]. Em resumo, as células foram tripsinizadas, recolhidas e, em seguida, coradas utilizando a Anexina V-FITC /PI Apoptosis Detection Kit de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação com Anexina V-FITC e PI, as células apoptóticas foram imediatamente analisadas por citometria de fluxo. Cedo células apoptóticas foram definidos como a população que foi negativo PI e Anexina V-FITC positivo, enquanto que as células apoptóticas foram tarde PI positiva e Anexina V-FITC positivo. A taxa total de apoptose foi calculado como a taxa de apoptose precoce mais a taxa de apoptose tardia. Anexina V-PE /7-AAD Apoptosis Detection Kit (KEYGEN, Nanjing, China) foi utilizado para o ensaio de apoptose de células transfectadas vetor lentivírus, semelhante aos protocolos anteriores. Cada experimento foi realizado em triplicado, e os dados foram apresentados como médias ± DP.

A migração celular e ensaios de invasão

ensaios de migração e invasão celular foram realizados conforme descrito anteriormente [13]. ensaio de migração foi realizada com Transwell insere membrana com tamanho de poro de 8,0 milímetros (formato de 24 poços, Corning, Nova Iorque, EUA). Para medir a capacidade de invasão de células de GC, as inserções foram anteriormente mencionados pré-revestido com a matriz Matrigel (BD Ciência, Sparks, MD, EUA). As células (1 x 10 ^{5) foram ressuspensas em meio isento de soro e semeadas à câmara superior. As câmaras inferiores foram cheias com meio de cultura completo contendo 10% de FBS. Após incubação a 37 ° C durante 24 h, as células que migraram presentes no lado inferior da membrana foram fixadas, coradas e contadas. Cada experiência foi realizada em triplicado.}

ensaio da luciferase

Os ensaios de luciferase dupla foram realizados como previamente descrito [9]. Os fragmentos 3'UTR do gene CSF1 contendo o sítio de ligação de miR-214 foi amplificado por PCR a partir de ARN celular MKN45 utilizando os iniciadores da Tabela S1, e inserido no sítio Xba1 do pmirGLO miARN alvo vector de expressão (Promega, San Lius Obispo, CA, EUA). O vector resultante foi denominado pmirGLO-CSF1. Para o ensaio repórter da luciferase, e MKN45 BGC823 células foram semeadas numa placa de 12 poços um dia antes da transfecção. As células foram co-transfectadas com 30 nM de miR-214 percursor ou inibidor de miR-214, o controlo negativo e 30 ng pmirGLO-CSF1 utilizando X-tremeGENE reagente de transfecção (Roche Applied Science). Após 48 horas da transfecção, a actividade de luciferase foi medida utilizando o sistema de ensaio de luciferase duplo (Promega) e normalizada para a actividade da luciferase de Renilla. Cada experiência foi realizada em triplicado.

Western blot

A 48 h após a transfecção com o miR-214 percursor ou inibidor, as células foram submetidas a análise de Western blot, conforme descrito anteriormente [19]. Resumidamente, a proteína foi extractada a partir de células ou tecidos. Os lisados ​​foram separados por electroforese, transferidos para membranas de nitrocelulose e colocados a hibridar com anticorpos contra CSF1 (1:1000, Epitomics) ou β-actina (1:1000, Santa). Os dados foram obtidos a partir de três experimentos independentes.

A análise estatística

As análises foram realizadas com o pacote estatístico Prism 5 software (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA). As diferenças foram analisadas com o Student t
-test entre dois grupos ou com o one-way ANOVA entre os três grupos. A correlação entre a expressão de miR-214 e tamanho do tumor em GC primário foi calculada pela correlação de Spearman. Na curva de sobrevivência, os dados foram analisados ​​pelo teste log-rank. Para determinar em que medida a expressão de miR-214 pode eficientemente separar diferentes subsettings clínicos, receiver operating análise característica (ROC) foi construído e a área sob a curva (AUC) foi calculada para avaliar a capacidade de miR-214 de expressão para diferenciar entre os casos de câncer e casos nontumourous, e para distinguir tecidos metastáticos e tecidos não-metastáticos. P
-Valores inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

miR-214 é regulada negativamente em tecidos de carcinoma gástrico e quatro linhas de células de GC, em comparação com a mucosa gástrica nontumourous

em comparação com 18 amostras de mucosa gástrica nontumourous, miR-214 foi regulada negativamente de forma significativa (cerca de seis vezes) em 80 amostras primárias gástricas de tecido (Figura 1A, P
= 0,0001). A curva ROC (ROC) de miR-214 refletida forte separação entre tecidos GC e tecidos nontumourous, com uma área sob a curva (AUC) de 0,7764 (Figura S1A, 95% de intervalo de confiança (IC), 0,6466-0,9062). Consistentemente, a regulação negativa de miR-214 foi validado em quatro linhas de células gástricas. Como mostrado na Figura 1C, o nível de expressão de miR-214 nas linhas celulares GC MKN28, BGC823, MKN45, e SGC7901 foi marcadamente atenuado em comparação com 18 amostras de tecido gástrico nontumourous ( P
< 0,05).

no entanto, foi detectada expressão ainda menor do miR-214 em GES-1, uma linha de células epiteliais gástricas imortalizadas, que em quatro linhas celulares de GC (Figura 1C, P
< 0,05). Especulamos a discordância pode ser devido, pelo menos em parte, à diferença entre amostras clínicas e linhas de células, porque uma linha de células, isolado a partir de um paciente com uma determinada doença, representa o assinatura expressão miARN de apenas uma amostra clínica e as alterações possam, durante a célula cultura in vitro
; em outras palavras, as amostras de tecidos são muito mais semelhantes ao contexto humano de linhas de células. Assim, comentamos que o miR-214 expressão em tecidos humanos GC foi mais representativa e credível do que a encontrada em linhas celulares.

Diminuição da expressão de miR-214 em GC está associado a metástases em linfonodos e tamanho do tumor, mas não tem correlação com o prognóstico do paciente

Para determinar as possíveis implicações clínico-patológicas de expressão de miR-214 alterados, combinamos os resultados qPCR e parâmetros clínicos. As correlações entre o nível de expressão de miR-214 e as características clinicopatológicas de GC são resumidos na Tabela 1. miR-214 de expressão foi correlacionada inversamente com o tamanho do tumor (Tabela 1, t
-test, P
= 0,0265; Figura 1D, Spearman r = -0,2673, P
= 0,0083) e metástases em linfonodos (Tabela 1, Figura 1A, t
-teste, P
= 0,0164). No entanto, não houve diferença significativa em outras características clinicopatológicas, tais como sexo, metástase distal, a OMS classificação histológica e tipo histológico de Lauren entre estes dois grupos.

Curiosamente, encontramos downregulation gradual de miR-214 entre gástrica nontumourous mucosa, tecidos nonmetastasis e metástases tecidos (Figura 1A, one-way ANOVA, P
= 0,0006). Para avaliar a expressão de miR-214 em GC como um novo biomarcador para metástase ganglionar, curvas ROC foram estabelecidos. Observou-se uma separação nítida entre as pacientes com metástase ganglionar e aqueles sem metástase ganglionar, com uma AUC de 0,5880 (Figura S1B, 95% CI, 0,4526-0,7166). Os tecidos gástricos primários foram divididos em um grupo de baixo metástase e um grupo de alto metástase de acordo com o número de metástase ganglionar (LNM): baixo metástase foi definida como os casos com menos de seis LNM, e os casos com mais de seis LNM foram considerados de alto metástase. Como esperado, a expressão de miR-214 foi drasticamente reduzida no grupo de alto metástase em comparação com o grupo de baixo metástases (Figura 1B, P
= 0,045).

De acordo com a amostra de tecido dados indicando a correlação entre a expressão de miR-214 e LNM, verificou-se que, em comparação com a linha de células moderadamente bem diferenciado MKN28, o miR-214 de expressão foi marcadamente menos nas linhas celulares pouco diferenciados MKN45 e BGC823, e especialmente a linha de células metastática SGC7901 [14] ( P Art < 0,05)

no entanto, os nossos dados não demonstrou nenhuma diferença significativa de miR-214 expressão em 18 amostras de tecido gástrico primários e seus loci metástase secundária (Figura 1B. , P
= 0,2676). Estes resultados sugerem que a regulação negativa da expressão de miR-214 ocorreu na fase inicial de desenvolvimento LNM e manteve-se estável, sem atenuação adicional na fase tardia de metástase.

Para explorar ainda mais o efeito de miR-214 no prognóstico de pacientes, foram analisados ​​os níveis de miR-214 expressão em casos com diferentes condições de status recidiva e sobrevivência. No entanto, os nossos dados mostraram que não havia diferença acentuada entre o grupo recaída e o grupo nonrelapse, ou entre o grupo de sobrevivência e o grupo de morte (Figura 2A-B, t
-test, P
> 0,05). De nota, dividimos os pacientes em grupos de alto expressão e de baixa expressão com base no nível médio de expressão de miR-214, e as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier mostrou nenhuma correlação significativa entre miR-214 expressão e sobrevivência livre de recidiva (Figura 2C , taxa de risco (HR) 1,23, 95% de intervalo de confiança (IC) ,6596-2,285; P
= 0,5781) ou a sobrevida global (Figura 2D, HR 1,20, 95% CI ,6667-2,151; P
= 0,5832) em pacientes com GC.

Efeito do miR-214 sobre a proliferação celular de células de GC

Para controlar a eficiência da transfecção, determinou-se o miR-214 de expressão por RT-qPCR às 24, 48, e 72 h após a transfecção no precursor de miR-214, ou inibidor de células transfectadas e continuamente detectado miR-214 de vectores de expressão de lentivírus células tratadas durante 4 semanas. Como esperado, a transfecção do precursor de miR-214 resultou eficientemente no sobre-expressão significativa de miR-214 (Figura S2A-B, P
< 0,05) e inibidor de miR-214 reduziu notavelmente o miR-214 em expressão miR- 214 células transfectadas com inibidores do que os grupos negativos (Figura S3E-F, figura S4 a, P
< 0,05). Além disso, verificou-se que as células transfectadas com vector de lentivírus LV3-HSA-miR-214 poderia conduzir a uma mudança de 7 a 96 vezes de miR-214 e expressão em SGC7901 células MKN45 (Figura S3A-D, P
< 0,05), com 80% -90% de células que expressam a proteína marcador GFP (Figura S3A, B)

para determinar se o miR-214 pode afectar a proliferação de células de GC, ensaio de proliferação EdU foi usada para. detectar a capacidade de crescimento celular. Os nossos dados mostraram que a sobre-expressão de miR-214 com vectores lentiviurs ou miR-214 precursor não influenciam o crescimento de células de SGC7901 (Figura 3A-B, figura S2C-D, P > 0,05) e linhas de células MKN45 (Figura S2E-F, figura S5A-B, P > 0,05). No entanto, descobrimos que downregualtion de miR-214 pode promover a proliferação de BGC823 (Figura 3C-D, P
= 0,0010) e GES-1 (Figura S4B-C, P
= 0,0474), mas não MKN28 linha celular (Figura S5C-D, P
= 0,0938), de uma maneira especifica para a célula.

Papel de miR-214 na migração celular e invasão da GC células

Como miR-214 expressão foi inversamente associado com metástase ganglionar, que estavam particularmente interessados ​​na capacidade miR-214 para afetar a migração e invasão celular. Os nossos resultados indicaram que as células transfectadas SGC7901 e MKN45-LV3 com HSA-miR-214 mostrou uma diminuição significativa migração e capacidade de invasão, em comparação com o LV3NC células tratadas (Figura 4A-B, Figura S6A-B, P
< 0,05). E observamos que downregualtion de miR-214 pode facilitar a migração e invasão de MKN28 (Figura 4C-D, P
= 0,0491 e P
= 0,0127, respectivamente). Embora knockdown de miR-214 não afectou a migração das células GES-1 (Figura S4D-E, P
= 0,0879), silenciamento de miR-214 conduziu a um aumento de mais de 40% nas propriedades invasivas destas células ( P
= 0,0046). No entanto, nossos dados mostraram que a transfecção de miR-214 precursor não ter um efeito robusto sobre a migração e invasão celular em SGC7901 (Figura S2G-H, P Art > 0,05) e MKN45 (Figura S2I-J, P
> 0,05). as células, em comparação com os respectivos controlos negativos

Influência de miR-214 sobre a apoptose de células de células de GC

para examinar o efeito de miR- 214 na apoptose celular, foram realizados ensaios de apoptose utilizando o método de coloração /PI anexina V-FITC. Os nossos resultados demonstram que a sobre-expressão (miR-214 precursor e o vector de lentivírus) e knockdown de miR-214 não poderia afectar a apoptose celular, obviamente, em comparação com os controlos negativos em linhas celulares de quatro GC (Figura 5, Figura S2K-N, P
> 0,05) e linha celular imortalizada gástrica GES-1 (dados não mostrados). De fato, encontramos uma tendência de capacidade pró-apoptose de miR-214 precursor na linha de células MKN45 (Figura S2M-N, P
= 0,0606), no entanto, a diferença não foi estatisticamente significativa.

miR-214 directamente metas e para baixo-regula QCA 1 em células cancerosas gástricas

para identificar alvos de miR-214, que usamos algoritmo TargetScan para prever miR-214 alvos no cancro gástrico humano. Entre os numerosos candidatos possíveis, nós escolhemos os sobre-expresso em cancros e proliferation- e genes associados à metástase, incluindo NOTCH2, FGFR1, CSF1 (Figura 6A), AGAP2, CREB1, para posterior análise. Os nossos resultados mostraram que o miR-214 precursor transfecção reduziu significativamente a actividade de um gene repórter de luciferase fundido com o CSF1 3'-UTR, com 29,60% e 30,61% de redução, em comparação com os grupos de controlo negativo (Figura 6B, P
= 0,0227 e 0,0093, respectivamente, para as linhas de células MKN45 e BGC823). Considerando que, quando o miR-214 inibidor foi transfectado, atividade luciferase foi aumentada em 34,49% e 42,25% em MKN45 e BGC823 células em comparação com os controles (Figura 6C, P
= 0,0115 e 0,0085, respectivamente).

determinou-se ainda a expressão da proteína CSF1 por western blot em células transfectadas com CG o miR-214 percursor ou inibidor. Consistente com os resultados de luciferase, a expressão da proteína CSF1 foi significativamente diminuída em células SGC7901 e MKN45 (Figura 6D-E, P
= 0,0037 e 0,0066, respectivamente) transfectadas com o miR-214 e precursor aumentada em MKN28 e BGC823 células (Figura S7A-B, P
= 0,0049 e 0,0416, respectivamente) transfectadas com o miR-214 inibidor, em comparação com os respectivos controlos. Estes dados sugerem que miR-214 inibe a tradução QCA 1 em células cancerosas gástricas.

Discussão

Emergentes evidências destacou o impacto crucial de miRNA desregulação na tumorigénese de carcinomas humanos [3], [4] . MiARN desregulação promove a proliferação de células, confere resistência à apoptose, e aumenta a capacidade de invasão e metástase, através da repressão dos supressores de tumor a jusante ou induzir a acumulação de oncogenes-alvo, e, assim, está envolvido na iniciação, progressão, metástase e de tumores humanos.

Entre a infinidade de miRNAs, desregulação do miR-214 foi encontrado em muitos cancros humanos [15] - [22]. Regulação negativa de miR-214 em cancro cervical tem sido relatada por vários grupos, e miR-214 tem mostrado inibir o crescimento, a migração e a invasão de células de cancro cervical por oncogenes segmentação MEK3, JNK1, plexina-B1, e GALNT7 [15 ] - [17]. MiR-214 também foi encontrada para ser diminuída no cancro da mama e contribuir para a tumorigénese da mama, permitindo que aberrantemente elevada oncogene EZH2 acumulação e proliferação de células não controlado subsequente invasão e [18]. No entanto, Penna et al. demonstraram que o miR-214 é altamente expresso em melanomas humanos e contribui para a progressão do tumor de melanoma através da supressão de TFAP2C, um homólogo de um supressor de tumor de melanoma bem estabelecida [19]. Estes resultados indicam que o papel de miR-214 no cancro é específica para tecidos ou cell-.

Um estudo recente realizado por Ueda et al. mostrou que a desregulação de miR-214 foi correlacionada com o estágio clínico, disseminação peritoneal e sobrevida dos pacientes [20]. No entanto, o papel exacto do miR-214 na progressão do carcinoma gástrico e o seu mecanismo molecular subjacente permanece elusiva. Aqui, mostramos que o miR-214 foi substancialmente reduzido em GC, especialmente em tecidos metastáticos, sugerindo um papel potencial de miR-214 em predizer metástases linfáticas, que foi adicionalmente suportado pela nossa análise da curva ROC. Além disso, verificou-se que a baixa expressão de miR-214 teve uma inclinação para um tamanho maior tumor. Para abordar se a desregulação do miR-214 tem uma importância biológica, utilizamos um estudo de acompanhamento e análise funcional de miR-214 in vitro
. No entanto, nossos dados sugerem que miR-214 não tem efeito sobre o resultado do paciente, incluindo o estado de recidiva e sobrevivência. Os nossos dados mostraram que a sobre-expressão de miR-214 com lentivírus de miR-214 que expressam o vector reduziu dramaticamente a migração e a invasão de linhas celulares de GC e knockdown de miR-214 poderia facilitar a proliferação celular, a apoptose, a migração e a invasão de um modo específico da célula, com a nenhuma influência sobre a apoptose de células.

CSF1 (factor estimulador de colónias 1 (macrófagos)) é um factor de crescimento hematopoiético que envolve crítico na diferenciação de células de macrófagos, proliferação e activação e que também está presente em células não-hematopoiéticas [21] . CSF-1 afecta a sobrevivência e a proliferação celular através da ligação ao seu receptor codificado pelo gene c-fms [22]. Estudos anteriores mostraram que CSF1 exercido um papel importante na promoção da angiogénese tumoral em leiomiossarcoma [23] e células de carcinoma de Lewis do pulmão através da indução de VEGF [24]. Aligeti S et al. sugerido que CSF1 tem um efeito positivo sobre a fixação de pleural para células mesoteliais, invasão e proliferação de células epiteliais do endométrio [25]. E elevadas concentrações séricas de tem sido correlacionada com o estágio da doença, metástases em linfonodos e pior prognóstico em pacientes com câncer colorretal [26]. Aqui nós identificamos CSF1 era um alvo direto de miR-214 em câncer gástrico através de ensaios de luciferase e ainda confirmada por análise de western blot. Os nossos dados sugerem que a regulação negativa de miR-214 pode facilitar a capacidade de proliferação, migração e invasão da célula cancerosa gástrica através da via de sinal mediada por CSF1.

No estudo anterior, Ueda et ai. mostrou que relativamente mais elevada expressão de miR-214 em GC estava associada com a sobrevivência desfavorável global em 101 pacientes (obtido a partir da Universidade de Tóquio e Universidade de Hiroshima) [20], no entanto, os nossos dados indicam que miR-214 não foi significativamente correlacionada com paciente resultado. Supomos que esta discrepância pode ser devida aos diferentes métodos de detecção de expressão miRNA, tamanhos de amostra, e tempos entre suas pesquisas e nosso acompanhamento. Ueda et al. dividido as amostras em duas classes (alta e baixa expressão), utilizando os níveis médios de expressão miARN medido numa micromatriz microARN como um limiar, enquanto que a divisão dos grupos de expressão elevados e de baixa baseou-se no nível mediano de expressão obtida a partir dos resultados qPCR . Curiosamente, em estudos anteriores, o miR-214 de expressão tem sido mostrado para ser regulada positivamente em cancro do ovário em comparação com células normais de ovário por Yang et ai. [27], ao passo que resultados opostos foram relatados por Nam et al. [28]. Ambos estes dois grupos utilizados microarrays de miARN para examinar a expressão de miARN. Assim, não podemos excluir a possibilidade de que a análise microarray pode não ser tão sensíveis e precisos na análise dos perfis de um miRNA específico de expressão. Como para o efeito de miR-214 no prognóstico de pacientes com GC, parcialmente consistentes com os resultados de Ueda et ai., Também encontramos uma tendência que a elevada expressão de miR-214 foi desfavorável para a sobrevivência quando o tempo de seguimento foi mais de 40 meses (hazard ratio (HR) = 1,19 para a sobrevida global, HR = 1,23 para a sobrevivência livre de recidiva), como mostrado na Figura 2, embora a tendência não foi estatisticamente significativa. Em qualquer caso, uma investigação mais aprofundada com uma coorte maior e diferentes configurações experimentais são necessários para resolver este problema.

Quanto à discordância de miR-214 vectores lentivírus e ensaios de transfecção precursoras, supomos que é uma consequência específica de as actividades biológicas de miR-214. Uma expressão moderado e estável, em vez de dezenas de milhares de overexpresion não fisiopatológico pode ajudar o miR-214 função bem.

Tomados em conjunto, nós demonstramos que o miR-214 foi substancialmente reduzido em GC, especialmente em tecidos metastáticos, sugerindo um papel potencial de miR-214 em prever linfonodo metástases. A nossa análise da curva ROC mostrou relativamente elevada especificidade e sensibilidade de miR-214 para discriminar casos de GC de controles nontumourous, e separar os pacientes com e sem metástases linfonodais, levando assim a sua utilidade potencial como um biomarcador da novela para GC e metástase ganglionar, que será útil para facilitar o manejo clínico de GC. No entanto, os nossos dados indicam que miR-214 não tem efeito sobre o prognóstico do paciente, indicando que miR-214 por si só não é suficiente para afetar a sobrevida do paciente.

• PLOS ONE: Níveis elevados do dímero D da Correlacionar com Long Term Survival of gástricas pacientes com câncer
• PLOS ONE: HIF-1 alfa superexpressão se correlaciona com pobre sobrevida global e Sobrevivência Livre de Doença em pacientes com câncer gástrico Pós-Gastrectomia