PLoS ONE: klinikos reikšmė MicroRNA-214 skrandžio vėžio ir jos poveikis Mobilusis Biologinis Behaviour

Anotacija

kaupti duomenys rodo, kad daugybė mikro RNR dalyvauja Tumorigenesis ir progresavimo skrandžio vėžiu, o klinikinė reikšmė iš MicroRNA-214 skrandžio vėžio menkai supranta ir tiksli vaidmuo MicroRNA-214 skrandžio vėžiu išlieka miglotas. Šioje studijoje, saviraiškos lygiai MicroRNA-214 80 skrandžio karcinoma audinių, 18 nontumourous skrandžio audinių, ir 4 tipų skrandžio vėžio ląstelių linijų kiekybiškai atvirkštinės transkripcijos po realaus laiko kiekybine polimerazės grandininė reakcija (AT-qPCR) ir buvo ištirta tarp MicroRNA-214 saviraiškos ir cliniopathological charakteristikas, įskaitant prognozės santykiai. Ištirti galimą vaidmenį MicroRNA-214 skrandžio vėžio ląstelių biologinio elgesio, mes atliekame ląstelių proliferacija, apoptozė, migracijos ir invazija bandymus iš keturių skrandžio vėžio ląstelių linijų ir įamžino skrandžio ląstelių linija in vitro
. Mūsų rezultatai parodė, kad MicroRNA-214 buvo dramatiškai downregulated skrandžio vėžio audiniuose ir skrandžio vėžio ląstelių linijų, palyginti su nontumourous skrandžio audinius. buvo pastebėta, palaipsniui downregulation iš MicroRNA-214 išraiškos tarp nontumourous skrandžio gleivinę, nonmetastasis skrandžio vėžio audiniuose, metastazių skrandžio vėžio audiniuose. Iš MicroRNA-214 išraiška buvo žymiai atvirkščiai koreliuoja su limfmazgių metastazių ir naviko dydžio, bet neturėjo koreliaciją su paciento prognozę. Negimdinis išraiška MicroRNA-214 gali slopinti ląstelių migraciją ir invazija sugebėjimą SGC7901 ir MKN45 skrandžio vėžio ląsteles. Ir nokdaunas iš MicroRNA-214 žymiai palengvino ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija į mobilųjį-specialiu būdu MKN28, BGC823 ir GES-1 ląstelių. Kolonijas stimuliuojantis faktorius 1 (CSF1) buvo įvardyta kaip tikslinės geno MicroRNA-214. Apibendrinant galima teigti, kad mūsų duomenys parodė, kad MicroRNA-214 yra perspektyvi romanas biologinis už limfmazgių metastazių pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. Ir mes nustatė, kad MicroRNA-214 downregulation gali reguliuoti ginklų platinimu strategiją, invazija ir migracijos skrandžio vėžio ląstelių tiesiogiai skirta CSF1

nurodomoji dalis:. Wangas YW Shi BP Chen X Gao C Gao P, (2014 m ) klinikos reikšmė MicroRNA-214 skrandžio vėžio ir jos poveikis ląstelių biologinės elgsenos. PLoS ONE 9 (3): e91307. Doi: 10,1371 /journal.pone.0091307

redaktorius: Terence Lee universitetas Honkonge, Honkongas

Įstojo: Balandžio 25, 2013 m Priėmė: Vasario 11, 2014 m Paskelbta: Kovo 10, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Wang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė Nacionalinės Gamtos mokslo fondo Kinijos (ir Nr 81.172.351 81372856). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys (GC) yra ketvirtoji dažniausia vėžio ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirtingumo pasaulyje [1]. Nepaisant didelių tyrimus dėl tumorogenezės ir progresavimo GC, šio komplekso ligos patogenezė menkai supranta. Taigi, tai yra gyvybiškai klinikinės vertės identifikuoti ir apibūdinti tiksliai molekulinį mechanizmą, dalyvaujančių plėtojant ir progresavimo skrandžio karcinoma.

Be įprastinių genetinės ir epigenetinio keičiant baltymų kodavimo onkogenų bei navikų slopintuvas genų GC Kancerogeninis, nonprotein kodavimo RNR, ypač mikro RNR (miRNAs), iškilo kaip naujas žaidėjas nušviesti GC plėtros mechanizmą [2]. MiRNAs yra endogeninių 19-25 NT nekoduojamame RNR, kad neigiamai reguliuoja baltymų raišką, skatinant iRNR skilimo arba represuoti baltymų vertimą, per sąveikos su 3'-UTR tikslinių mRNR. Buvo pranešta dalyvauti kancerogenezėje ir plėtoti žmogaus vėžio, įskaitant GC Daugėja miRNAs [2] - [4]. Šie miRNAs paprastai dysregulated ir funkcijos arba kaip naviko slopintuvai ar onkogenų į inicijavimo ir progresavimo žmogaus karcinoma. Pavyzdžiui, Tsukamoto ir kt. parodė, kad Pasaulis-375 yra downregulated skrandžio karcinoma ir daro savo proapoptotic poveikį per downregulating PDK1, yra kinazės kad fosforilina Akt, ir, savo ruožtu, slopina PI3K /Akt kelią [5]. O miR-21 buvo nustatyta, kad skatinti navikų proliferaciją ir invaziją GC pagal neigiamai reguliavimo svarbius auglio slopintuvai, pavyzdžiui, PTEN, PDCD4, ir RECK, ir tada suteikti GC ląsteles su padidėjusia invaziškumą ir gebėjimo išvengti anoikis [6] - [8 ]. Anksčiau mes nustatėme, kad Pasaulis-145 buvo downregulated į kolektoriaus žmogaus vėžinių ląstelių ir slopino invazija-metastazes kaskados GC slopindamas N-cad baltymų vertimą [9], [10].

Šiuo metu klinikinė reikšmė MicroRNA-214 (mIR-214) į pacientų su GC prognozė yra sunkiai suprantamas, o tiksli vaidmuo miR-214 GC lieka neaiškus. Čia mes ištirti ryšį tarp Pasaulis-214 išraiška ir cliniopathological parametrų asociacija taip pat įvertino PPN-214 biologinių elgesį, įskaitant ląstelių proliferaciją, apoptozės, migracijos ir invazijos į GC ląstelių poveikį.

Medžiagos ir metodai

Audinių mėginiai

Audinių mėginiai buvo gautas panašiu būdu, kaip aprašyta anksčiau [9]. Trumpai, 80 mėginiai (iš 65 vyrų, 15 moterų; 58,3 ± 17,49 ir ​​61,5 ± 9,162 metai, atitinkamai) GC audiniuose buvo gauti iš pacientų, kuriems buvo atlikta chirurginė rezekcija esant Qi Lu ligoninės Shandong University nuo 2004 iki 2006 m Nontumourous skrandžio gleivinės daugiau nei 3 cm atstumu nuo navikų buvo atsitiktinai parinktas iš 18 iš šių pacientų ir naudojamas kaip kontrolės. Nė vienas iš pacientų gavo priešoperacinė gydymą, pavyzdžiui, spindulinis gydymas ar chemoterapija. Mėginiai buvo įvedėte histologiškai pagal Lauren "ir Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) 's klasifikacijos (IARC Spaudos, Lyon, 2000), ir suskirstyti į kategorijas pagal UICC 2002 TNM klasifikacija.

Etika pareiškimas

tyrimas patvirtino etikos komiteto medicinos mokyklos, Shandong University, Shandong, Kinija (patvirtinimo kodas: 201.101.015). Gavome parašyta informuoto sutikimo iš visų dalyvaujančių mūsų tyrimo dalyvių.

Mobilusis kultūra

Keturių tipų žmogaus ląstelių linijų GC buvo gauta iš amerikiečių tipas Kultūros kolekcijos (MKN28 ir MKN45, Manassas, VA , JAV) ir Šanchajaus vėžio instituto (BGC823 ir SGC7901, Šanchajus, Kinija). Imortalizuotų skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linija GES-1 buvo gauta iš Pekino ComWin Biotech Co., Ltd (Pekinas, Kinija). Ląstelės buvo prižiūrimi RPMI 1640 kultūros terpė papildyta 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) A drėkinamame ląstelių inkubatoriuje su 5% CO _{atmosferoje 2 37 ° C temperatūroje.}

Mirna gavybos

Naudojant miRNeasy FFPE komplektas (Bioteke, Pekinas, Kinija), mes izoliuoti Mirna iš parafino įterptųjų audinių pagal gamintojo instrukcijas. Iš viso RNR ląstelių linijų buvo išgauti naudojant Trizol reagentą (TAKARA, Dalian, Kinija) pagal gamintojo protokolą. Kokybė ir kiekybė RNR mėginių buvo vertinami standartiniais spektrofotometriniu metodais (BioPhotometer plius; Eppendorf, Hamburgas, Vokietija) ir atskiesti iki 2 ng /iL ir RT qPCR analizės

atvirkštinės transkripcijos po realiu laiku. kiekybinis polimerazės grandininė reakcija (AT-qPCR)

Mirna ekspresijos lygis buvo kiekybiškai naudojant SYBR Primescript Mirna RT PCR Kit (TAKARA Dalian, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas su Bio-Rad CFX ™ 96 C1000 Nekilnojamasis Game sistema. Trumpai tariant, RNR mėginiai buvo konvertuojami į kDNR pagal vieno žingsnio Primescript miRNAcDNA sintezė Kit (TAKARA, Dalian, Kinija), po to realiu laiku qPCR ir normalizuotas naudojant U6 mažas branduolinis RNR (RNU6B) iš 2 ^{-ΔCT metodas. Gruntai Mir-214 ir U6 buvo iš GeneCopoeia (HmiRQP0320, HmiRQP9001). Visos nepageidaujamos reakcijos buvo paleisti du kartus.}

Mobilusis transfekcija

auga eksponentiškai ląstelės (1,5 × 10 ^{5) buvo sėjamos 12-duobučių lėkštelėse 12 val prieš transfekciją ir buvo transfektuotose 30 Nm Pasaulis-214 pirmtakas (mIR-214), anti-Pasaulis-214 inhibitoriaus (mIR-214 inhibitoriaus), arba neigiamos kontrolės (Ambion, Ostinas, TX, Jungtinės Amerikos Valstijos), naudojant rentgeno tremeGENE transfekcijq reagento (Roche Applied Science, Indianapolis, į JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Transfekcijq efektyvumas buvo stebimas RT-qPCR 24, 48 ir 72 val po transfekciją.}

stabilios išraiška miR-214, SGC7901 ir MKN45 ląstelės buvo pernešta su lentivirus Pasaulis-214 ekspresija vektorius LV3-HSA -miR-214 arba neigiama kontrolė LV3NC, kuri turi GFP kaip žymėto baltymo, pagal gamintojo protokolu (GenePharma, Šanchajus, Kinija). Tris dienas po to, kai transfekciją, kad GFP baltymo ekspresija buvo stebima pagal fluorescencijos mikroskopu. Transfekuoti ląstelės buvo tikrinami su puromicino (1,5 mikrogramų /ml) tie stabiliai išreiškė MIR-214.

ląstelių proliferacija tyrimas

Po transfekcija, ląstelės buvo trypsinised, suskaičiuoti ir pasėjamos į 96 -well plokštės esant 5 × 10 ^{3 ląstelių tankis /pat. Ir tada ląstelių proliferacija buvo matuojamas naudojant Edu platinimo tyrimą, kaip pranešta anksčiau [11]. Trumpai tariant, po 24 valandų transfekciją, ląstelės buvo auginamos trimis egzemplioriais 5 × 10 3 ląstelės per gerai 96 duobučių lėkštelėse dieną prieš Edu inkubacijos (Ribobio, Guangzhou, Kinija). Po Edu ženklinimo, ląstelės buvo gydomi 100 įxL 1 × Apollo reakcijos kokteilis, tamsintas su 100 įxL Hoechst 33342 (5 mikrogramai /ml) ir vizualizuojami pagal fluorescencijos mikroskopu (Olympus, Japonija). Iš Edu teigiamų ląstelių procentas buvo apibrėžta kaip platinimo kainą. Duomenys buvo gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų ir pateikiamas kaip vidutinė vertė ± standartinis nuokrypis (SD).}

Mobilusis apoptozę tyrimas

Trys dienų po to, kai transfekciją miR-214 pirmtakas arba inhibitorių, ląstelės buvo surinkti ir nudažomi naudojant aneksinu-FITC /PI apoptozę aptikimo rinkinį (BestBio, Šanchajus, Kinija), kaip aprašyta anksčiau [12]. Trumpai tariant, ląstelės buvo tripsinizuojamos, surinko ir vėliau yra nudažomi naudojant aneksinu-FITC /PI Apoptozę aptikimas komplektas pagal gamintojo instrukcijas. Po inkubacijos su aneksinu-FITC ir PI, apoptozės ląstelės buvo iš karto analizuojami tėkmės citometrijos metodą. Ankstyvas Apoptozinės ląstelės apibrėžiamos kaip gyventojų, kurie buvo VšĮ neigiamas ir aneksinu-FITC teigiamas, o vėlai Apoptozinės ląstelės VšĮ teigiamas ir aneksinu-FITC teigiamas. Bendras aprotoninis norma buvo apskaičiuota kaip anksti apoptozės norma plius pabaigoje apoptozės norma. Aneksinu-PE /7-AAD Apoptozę aptikimas komplektas (keygen, Nanjing, Kinija) buvo naudojamas apoptozė analizuojant lentivirus vektoriaus perkeltų ląstelių, panašių į aukščiau protokolus. Kiekvienas eksperimentas buvo atliktas tris kartus, ir duomenys buvo pateikiami kaip priemonėmis ± SD.

Mobilusis migracija ir invazija tyrimai

buvo atlikta ląstelių migraciją ir invazija tyrimai, kaip aprašyta anksčiau [13]. Migracijos tyrimas buvo atliktas su Transwell įterpia su 8,0 mm akučių dydis membrana (24 šulinėlių formatu, Corning, Niujorkas, JAV). Norint išmatuoti invazija gebėjimas GC ląsteles, anksčiau minėti įdėklai buvo iš anksto padengta Matrigel matricos (BD mokslo, Sparks, MD, JAV). Ląstelės (1 × 10 ^{5) buvo resuspenduotos terpėje serumo neturinčioje ir pasėjamos į viršutinį kameroje. Apatinės kameros buvo pripildyti visiškai kultūra terpė su 10% FBS. Po to, kai inkubacijos 37 ° C temperatūroje 24 h, išsiskyrusio ląstelės, esantį ant apatinės membranos buvo nustatyti, nudažomi ir suskaičiuoti. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.}

buvo atliktas liuciferazės tyrimas

Dual-liuciferazės tyrimų, kaip buvo aprašyta anksčiau [9]. 3'-UTR fragmentai CSF1 geno, kuriame Mir-214 prijungimo vietą sustiprino PGR iš MKN45 ląstelių RNR naudojant S1 Stalo pradmenis, ir įterpė į Xba1 svetainėje pmirGLO Mirna tikslas ekspresijos vektoriumi (Promega San Lius Obispo, CA, USA). Gautas vektorius buvo pavadintas pmirGLO-CSF1. Dėl liuciferazės reporterio testą, MKN45 ir BGC823 ląstelės buvo pasėjamos į 12 šulinėlių plokštelės dieną prieš transfekciją. Ląstelės buvo bendrai perkeltų su 30 nM PPN-214 pirmtako arba Pasaulis-214 inhibitoriaus, neigiama kontrole ir 30 ng pmirGLO-CSF1 naudojant rentgeno tremeGENE transfekcijq reagento (Roche Applied Science). Po 48 h transfekciją, liuciferazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant dvigubos liuciferazės tyrimo sistema (PROMEGA) ir standartizuoti Renilla liuciferazės veikla. Kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.

Western blot

48 gydymo valandas po transfekciją su miR-214 pirmtakas arba inhibitorių, ląstelės buvo atliktas Western Blot analizės, kaip aprašyta anksčiau [19]. Trumpai, baltymų buvo ekstrahuojamas iš ląstelių arba audinių. Lizatai elektroforezės būdu, perkelti į nitroceliuliozės membranų ir Lik su antikūnų prieš CSF1 (1:1000, Epitomics) arba beta-aktino (1:1000, Santa). Duomenys buvo gauti iš trijų nepriklausomų eksperimentų.

Statistinė analizė

Analizė buvo atlikta naudojant statistinį paketą "Prizmė 5 programinę įrangą (GraphPad Programinė įranga, San Diego, CA, JAV). Skirtumai buvo analizuojami su studento , T
-test tarp dviejų grupių arba viena ANOVA tarp trijų grupių. Koreliacijos tarp Pasaulis-214 saviraiškos ir naviko dydžio pirminėje GC buvo apskaičiuojamas Spirmeno koreliacijos. Išgyvenimo kreivės duomenys buvo analizuojami log-rank testą. Norėdami nustatyti, kokia apimtimi miR-214 išraiška gali efektyviai atskirti skirtingų klinikinių subsettings, ROC kreivė (ROC) kreivės analizė buvo pastatytas ir plotas po kreive (AUC) buvo apskaičiuojamas įvertinti Pasaulis-214 raiškos gebėjimą diferencijuoti tarp vėžio atvejų ir nontumourous atvejais ir atskirti neišplitusios audinius ir nemetastazavusiu audinius. P
k dydžiai mažiau nei 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

MIR-214 yra downregulated skrandžio karcinoma audinių ir keturių GC ląstelių linijų, palyginti su nontumourous skrandžio gleivinės

palyginti su 18 nontumourous skrandžio gleivinės mėginiai, PPN-214 buvo žymiai downregulated (maždaug šešis kartus) 80 pirminių skrandžio audinių mėginių (1A pav p
= 0,0001). Imtuvas veikia savybę (ROC) kreives PPN-214 atspindėjo tvirtą atskyrimą GC audinių ir nontumourous audinių, su po kreive (AUC) 0.7764 (pav S1A, 95% pasikliautinasis intervalas (PI), 0,6466-0,9062) srityje. Nuosekliai, downregulation miR-214 buvo patvirtintas keturias skrandžio ląstelių linijų. Kaip parodyta 1C paveiksle, Mir-214 išraiška lygis GC ląstelių linijų MKN28, BGC823, MKN45 ir SGC7901 buvo ženkliai susilpnintas, palyginti su 18 nontumourous skrandžio audinių mėginių ( P
< 0,05).

Tačiau, mes nustatėme, net mažesnę raišką, miR-214 į GES-1, imortalizuota skrandžio epitelinių ląstelių linija, nei keturių GC ląstelių linijų (pav 1C, p
< 0,05). Mes spėlioti Dysonans gali būti bent iš dalies skirtumui tarp klinikinius mėginius ir ląstelių linijų, dėl to, kad ląstelių linija, izoliuota nuo vienam pacientui su tam tikrą ligą, atstovauja mirna ekspresijos parašas tik vienas klinikinio mėginio ir gali pakeitimus elemento per kultūra in vitro
; kitaip tariant, audinio mėginius daug daugiau kaip žmogaus kontekste, o ne ląstelių linijų. Taigi, mes pastebėjo, kad Pasaulis-214 išraiška žmogaus GC audiniuose buvo daugiau atstovas ir patikima, nei buvo nustatyta ląstelių linijų.

Sumažėjo Pasaulis-214 išraiška GC yra susijęs su limfmazgių metastazių ir naviko dydžio, bet neturi koreliacija su paciento prognozę

Norėdami nustatyti galimus klinikos pasekmes pakeisti Pasaulis-214 raiškos, mes sujungėme qPCR rezultatus ir klinikinius parametrus. Koreliacija tarp Mir-214 raiškos lygį ir klinikos ypatybių GC apibendrinti 1 lentelėje MIR-214 išraiška buvo atvirkščiai koreliuoja su naviko dydžio (1 lentelė t
-test P
= 0,0265; 1D pav Ietininkas R = -0,2673 P
= 0,0083) ir limfmazgių metastazės (1 lentelė, Figure1A T
-test P
= 0,0164). Tačiau nebuvo reikšmingo skirtumo kitose klinikos funkcijų, tokių kaip lytis, distalinio metastazių, kuris histologinio klasifikavimo ir Lauren anketa histologinio tipo tarp šių dviejų grupių.

Įdomu, mes nustatėme, nuoseklaus downregulation PPN-214 tarp nontumourous skrandžio gleivinę, nonmetastasis audiniai, ir metastazes audiniai (1A pav, į vieną pusę ANOVA P
= 0,0006). Įvertinti Pasaulis-214 išraišką GC kaip naujas biologinis žymuo dėl limfmazgių metastazių, buvo įkurta ROC kreivės. Mes pastebėjo aiškius atstumai tarp pacientų, sergančių limfmazgių metastazių ir tiems, kurie neturi limfmazgių metastazių, su iš 0.5880 AUC (S1B paveiksle, 95% CI, 0,4526-0,7166). Pirminiai skrandžio audiniai buvo toliau skirstomi į žemos metastazių grupės ir aukštos metastazių grupės pagal limfmazgių metastazių (LNM) skaičius: žemas metastazės buvo apibrėžtas kaip atvejais mažiau nei šešių LNM ir atvejai, su daugiau nei šešis LNM buvo laikomi aukštos metastazių. Kaip ir tikėtasi, PPN-214 išraiška buvo dramatiškai sumažėjo aukštos metastazių grupėje, lyginant su žemo metastazių grupės (1b pav P
= 0,045).

pagal audinių mėginio duomenų, rodančių, tarp Pasaulis-214 saviraiškos ir LNM koreliacija, mes nustatėme, kad, palyginti su vidutiniškai gerai diferencijuota ląstelių linijos MKN28, PPN-214 išraiška buvo žymiai mažiau prastai diferencijuotų ląstelių linijų MKN45 ir BGC823, o ypač metastazavusiu ląstelių linija SGC7901 [14] ( p
< 0,05)

Tačiau mūsų duomenys neparodė reikšmingo skirtumo miR-214 raiška 18 pirminių skrandžio audinių pavyzdžius ir vidurinio metastazes loci (1b pav. P
= 0,2676). Šie rezultatai rodo, kad downregulation miR-214 raiškos įvyko anksti LNM plėtros ir išliko stabilus be papildomo slopinimo į vėlai metastazių.

Jei toliau tirti PPN-214 poveikį remiantis prognozėmis pacientai, mes išanalizavo raiškos lygį PPN-214 atvejais su skirtingais atkryčio statusą ir išgyvenimo sąlygas. Tačiau mūsų duomenys rodo, kad nebuvo ryškus skirtumas tarp atkryčio grupės ir nonrelapse grupės arba tarp išgyvenimo grupės ir mirties grupėje (2a pav-B T
-test p
> 0,05). Pažymėtina, mes suskirstyti pacientus į aukštos raiškos ir žemos raiškos grupes pagal vidurine lygio PPN-214 išraiškos ir Kaplan-Meier išgyvenimo kreivės neparodė reikšmingos koreliacijos tarp Pasaulis-214 saviraiškos ir atkryčio Išgyvenamumas be (2c pav , šanso santykis (ŠS) 1,23, 95% pasikliautinasis intervalas (PI) ,6596-2,285 P
= 0,5781), arba bendras išgyvenamumas (2D pav HR 1,20, 95% PI ,6667-2,151 P
= 0,5832) pacientams, sergantiems GC.

poveikis miR-214 nuo ląstelių proliferaciją GC ląstelių

Jei stebėti transfekcijq efektyvumą, nustatėme Pasaulis-214 išraišką RT-qPCR ne 24, 48, ir 72 h po transfekciją ir miR-214 pirmtakas arba inhibitorius, transfekuota ląsteles ir nuolat aptikti ir miR-214 išraiška lentivirus vektorių paveiktų ląstelių 4 savaites. Kaip ir tikėtasi, transfekuojant miR-214 pirmtakas efektyviai padaryta didelė raiškos miR-214 (pav S2A-B, P
< 0,05) ir miR-214 inhibitoriaus stebėtinai sumažintas ir miR-214 ekspresiją miR- 214 inhibitorių perkeltų ląstelių nei neigiamų grupių (pav S3E-F, pav S4 "A P
< 0,05). Be to, mes nustatėme, kad ląstelės transfektuotose lentivirus vektoriaus LV3-HSA-miR-214 gali sukelti 7 iki 96 kartų PPN-214 raiškos kaitos SGC7901 ir MKN45 ląstelių (pav S3A-D P pervežimas < 0,05), su 80% -90% ląstelių išreiškiančius GFP žymėto baltymo (pav S3A B)

Norėdami nustatyti, ar Pasaulis-214 gali turėti įtakos GC ląstelių proliferaciją, edu platinimu tyrimas buvo naudojamas. aptikti ląstelių augimo galimybes. Mūsų duomenys parodė, kad padidėjusi miR-214 su lentiviurs vektoriai arba Pasaulis-214 pirmtakas neturėjo įtakos ląstelių augimą SGC7901 (pav 3A-B pav S2C-D, P > 0,05) MKN45 ląstelių linijas (pav S2E-F, pav S5A-B, p > 0,05). Tačiau, mes nustatėme, kad PPN-214 downregualtion galėtų skatinti BGC823 platinimu (pav 3C-D P
= 0,0010) ir GES-1 (pav S4b C P
= 0,0474), bet ne MKN28 ląstelių linija (pav S5C d P
= 0,0938), į mobilųjį konkrečiai būdu.

vaidmuo miR-214 ląstelių migracijos ir invazija GC ląstelės

Kaip Pasaulis-214 išraiška buvo atvirkščiai susijęs su limfmazgių metastazių, buvome ypač domina gebėjimu Pasaulis-214 paveikti ląstelių migraciją ir invazija. Mūsų rezultatai parodė, kad SGC7901 ir MKN45 ląstelės perkeltų su LV3-HSA-Pasaulis-214, nustatyta gerokai migracija ir invazija pajėgumus sumažėjo, palyginti su LV3NC paveiktų ląstelių (pav 4A-B pav S6A-B P
< 0,05). Ir mes nustatėme, kad PPN-214 downregualtion galėtų palengvinti migracija ir invazija MKN28 (4c paveikslas-D P
= 0,0491 ir P
= 0,0127, atitinkamai). Nors nokdaunas miR-214 nebuvo paveikti Ges-1 ląstelių (pav S4D-E P
= 0,0879), triukšmo slopinimo miR-214 baigėsi tuo, kad daugiau nei 40% padidinti invazinių savybių migracija šių ląstelių ( P
= 0,0046). Tačiau mūsų duomenys rodo, kad transfekcija miR-214 pirmtakas neturėjo tvirtos poveikį ląstelių migracijos ir invazijos į SGC7901 (pav S2G-H P
> 0,05) ir MKN45 (pav S2I-J p
>. 0.05) ląstelių, lyginant atitinkamus neigiamus kontrolinius mėginius,

įtaka miR-214 į mobilųjį apoptozės GC ląstelių

Jei išnagrinėti miR- poveikį 214 on cell apoptozės, mes atliekame apoptozę tyrimus, atliekamus naudojant aneksinu-FITC /PI dažymo metodą. Mūsų rezultatai parodė, kad padidėjusi (MIR-214 pirmtakas ir lentivirus vektorius) ir nokdaunas miR-214 negalėjo įtakoti ląstelių apoptozę akivaizdžiai palyginti su neigiamu kontrolės keturių GC ląstelių linijas (5 pav pav S2K-N p
> 0,05) ir imortalizuotų skrandžio ląstelių linija GES-1 (duomenys neparodyta). Tiesą sakant, mes nustatėme, kad Pro-apoptozė gebėjimą PPN-214 pirmtakas MKN45 ląstelių linijos tendenciją (pav S2M-N P
= 0,0606), tačiau skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas.

MIR-214 tiesiogiai tikslus ir žemyn reguliuoja CSF1 skrandžio vėžio ląstelių

Jei nustatyti tikslus miR-214, kuriuos mes naudojome TargetScan algoritmą prognozuoti Pasaulis-214 tikslų žmogaus skrandžio vėžio. Tarp daugelio galimų kandidatų, mes pasirinko tuos, ekspresija ir vėžio ir proliferation- ir metastazes susijusių genų, įskaitant NOTCH2, FGFR1, CSF1 (6a pav), AGAP2, CREB1, tolesnei analizei. Mūsų rezultatai parodė, kad Pasaulis-214 pirmtakas transfekcija žymiai sumažino liuciferazės reporterio geno lydyto į CSF1 3'-UTR veiklą, su 29.60% ir 30.61% sumažinti, palyginti su neigiamų kontrolinių grupių (6b pav p
= 0,0227 ir 0,0093, atitinkamai, už MKN45 ir BGC823 ląstelių linijų). Kadangi kai Pasaulis-214 inhibitoriaus buvo pernešta, liuciferazės veikla buvo padidintas 34.49% ir 42.25% į MKN45 ir BGC823 ląstelių, lyginant su kontrole (pav 6C P
= 0.0115 ir 0.0085, atitinkamai).

Mes taip pat nustatė CSF1 baltymo ekspresiją Vakarų dėmė GC ląstelių transfektuotose Pasaulis-214 pirmtakas ar inhibitorius. Atitikti liuciferazės rezultatus, CSF1 baltymo ekspresija buvo žymiai sumažėjo SGC7901 ir MKN45 ląstelių (pav 6D-E P
= 0,0037 ir 0,0066, atitinkamai) perkeltų su Pasaulis-214 pirmtakas ir padidėjo MKN28 ir BGC823 ląstelės (pav S7A-B P
= 0,0049 ir ​​0,0416, atitinkamai) perkeltų su Pasaulis-214 inhibitoriaus, palyginti su atitinkamomis kontrolės. Šie duomenys rodo, kad Pasaulis-214 slopina CSF1 vertimą skrandžio vėžio ląsteles.

Diskusijos

naujus įrodymus išryškino esminį poveikį Mirna disreguliacija ant tumorogenezės žmogaus karcinoma [3], [4] , Mirna reguliacijos sutrikimas skatina ląstelių proliferaciją, suteikiančio atsparumą apoptozės ir pagerina invazinis ir metastazes, per represuoti tolesnius auglio slopintuvai ar paskatinti tikslinių onkogenų kaupimą, taigi dalyvauja inicijavimo, progresavimo, o metastazės žmogaus navikų.

Tarp miRNAs, disreguliacija miR-214 gausybė buvo rasta daug žmogaus vėžio [15] - [22]. Downregulation miR-214 gimdos kaklelio vėžio buvo pranešta keletas grupių, ir Pasaulis-214 buvo slopina augimą, migracijos, ir invazija į gimdos kaklelio vėžio ląstelių, skirtų onkogenų MEK3, JNK1, Plexin-B1 ir GALNT7 [15 ] - [17]. MIR-214 taip pat buvo nustatyta, kad sumažėjo krūties vėžio ir prisidėti prie krūties tumorogenezės leidžiant nenormaliai padidėjusi onkogeno Ezh2 kaupimu ir vėliau neregistruotą ląstelių proliferaciją ir invazija [18]. Tačiau, Penna ir kt. parodė, kad Pasaulis-214 yra labai išreikštas žmogaus melanomos ir prisideda prie melanomos auglio progresavimo per slopinimo TFAP2C, iš nusistovėjusios melanomos auglio slopintuvas [19] homologas. Šie rezultatai rodo, kad miR-214 vaidmenį vėžio audiniui ar somatinių ląstelių konkretus.

Neseniai atliktas tyrimas Ueda et al. parodė, kad reguliacijos sutrikimas miR-214 koreliavo su klinikinės stadijos, pilvaplėvės sklaidos ir išlikimo pacientų [20]. Tačiau, tiksli vaidmuo miR-214 į skrandžio karcinoma ir su juo susijęs molekulinės mechanizmo progresavimo išlieka silpnas. Čia mes parodysime, kad Pasaulis-214 buvo iš esmės sumažinta GC, ypač metastazavusiu audiniuose, o tai rodo galimą vaidmenį PPN-214 prognozuojant limfmazgių metastazių, kuris buvo labiau patvirtina mūsų ROC kreivės analizę. Be to, mes nustatėme, kad mažos išraiška miR-214 turėjo polinkį didesnio naviko dydžio. Spręsti, ar miR-214 reguliacijos sutrikimas tenka biologinę reikšmę, mes naudojamas tolesnių studijų ir funkcinę analizę PPN-214 in vitro, pervežimas. Nepaisant to, mūsų duomenys rodo, kad Pasaulis-214 neturi įtakos pacientų rezultatus, įskaitant atkryčio statusą ir išlikimo poveikį. Mūsų duomenys parodė, kad padidėjusi miR-214 su lentivirus Pasaulis-214 ekspresija vektoriaus dramatiškai sumažino migracijos ir invazija GC ląstelių linijų ir triuškinantis PPN-214 galėtų palengvinti ląstelių proliferaciją, apoptozę, migracija ir invazija į mobilųjį konkrečiai būdu, su jokios įtakos ląstelių apoptozę.

CSF1 (kolonijas stimuliuojantis faktorius 1 (makrofagų)) yra kritinis kraujodaros augimo faktoriaus įtraukiant į makrofagų ląstelių diferenciacijos, dauginimosi ir aktyvacijos ir jis taip pat dalyvauja ne kraujodaros ląstelių [21] , CSF-1 veikia ląstelių išgyvenimą ir proliferaciją per prisijungti prie savo receptoriaus, kurį koduoja c-fms geno [22]. Ankstesni tyrimai parodė, kad CSF1 darė svarbius vaidmenis skatinti naviko angiogenezę lejomiosarkomomis [23] ir Lewis plaučių karcinoma ląstelių per VEGF indukcijos [24]. Aligeti S ir kt. pasiūlė, kad CSF1 turi teigiamą poveikį dėl prisirišimo prie pleuros mesothelial ląstelių, invazija ir platinimu endometriumo epitelio ląstelių [25]. Ir padidėjęs serumo koncentracijos buvo koreliuoja su ligos stadijoje, limfmazgių metastazių ir blogos prognozės gaubtinės ir tiesiosios žarnų vėžiu sergantiems pacientams [26]. Čia mes identifikuoti CSF1 buvo tiesioginė tikslinė miR-214 skrandžio vėžiu per liuciferazės tyrimus ir toliau patvirtina Vakarų dėmė analizė. Mūsų duomenys rodo, kad downregulation miR-214, gali palengvinti dauginimosi, migracijos ir invazija pajėgumą skrandžio vėžio ląstelių per CSF1 tarpininkaujant signalo kelyje.

ankstesniame tyrime, Ueda et al., parodė, kad santykinai didesnė raiška miR-214 GC buvo susijęs su nepalankia bendro išgyvenamumo 101 pacientų (gautą iš Tokijo ir Hirosimos universiteto universiteto) [20], tačiau, mūsų duomenimis, Pasaulis-214 nebuvo reikšmingai koreliuoja su pacientu rezultatas. Manome, kad šis neatitikimas gali būti dėl skirtingų Mirna raiškos aptikimo metodų, imties dydis, ir tolesnės kartus tarp jų mokslinių tyrimų ir mūsų. Ueda ir kt. suskirstyti mėginius į dvi klases (aukštos ir žemos raiškos), naudojant vidutines lygiai Mirna išraiška matuojama MicroRNA microarray kaip ribos, o mūsų skyrius aukštos ir žemos raiškos grupių buvo grindžiamas vidurine lygio išraiška įgytą iš qPCR rezultatų , Įdomu, ankstesniuose tyrimuose, PPN-214 išraiška buvo įrodyta, kad būti aktyvinama kiaušidžių vėžiu, palyginti su normaliomis kiaušidžių ląstelių Yang et al. [27], kadangi priešingos rezultatai buvo pateikti pagal Nam et al. [28]. Abi iš šių dviejų grupių naudojamas Mirna mikrogardelių išnagrinėti Mirna išraiška. Taigi, mes negalime atmesti galimybės, kad Mikrogardelė analizė gali būti ne toks pat jautrus ir tikslus analizuojant raiškos profilius konkretaus Mirna. Kalbant apie miR-214 poveikis pacientams, sergantiems GC prognozė, dalinai atitinkančius Ueda et al., Rezultatus, taip pat nustatė tendenciją, kad aukštos raiškos miR-214 buvo nepalanki dėl išlikimo, kai tolesnių laikas buvo ilgiau nei 40 mėnesių (rizikos santykis (RS) = 1.19 už bendrą išgyvenamumą, HR = 1,23 už išlikimą atkryčio nemokamai), kaip parodyta 2 paveiksle, nors ši tendencija nebuvo statistiškai reikšmingas. Bet kuriuo atveju, tolesnis tyrimas su didesniu kohortos ir įvairių eksperimentinių nustatymai reikalingi išspręsti šią problemą.

Kaip ir PPN-214 lentivirus vektorių ir prekursorių transfekcijos tyrimų disonansas, mes manome, kad yra konkreti pasekmė biologiniai veikla PPN-214. Saikingas ir stabili išraiška, o ne dešimtys tūkstančių ne physiopathological overexpresion gali padėti Pasaulis-214 gerai veikia.

Kartu, mes parodė, kad Pasaulis-214 buvo iš esmės sumažinta GC, ypač metastazavusiu audiniuose, o tai rodo potencialus vaidmuo miR-214 prognozuojant limfmazgių metastazių. Mūsų ROC kreivė analizė parodė gana aukštą specifiškumą ir jautrumą PPN-214 diskriminuoti GC bylas iš nontumourous kontrolės ir atskirti pacientus su ir be limfmazgių metastazių, ir tuo pačiu skatinti potencialų įrankį kaip naują biologinis žymuo GC ir limfmazgių metastazių, kuris bus naudinga siekiant palengvinti klinikinių valdymą GC. Tačiau mūsų duomenys rodo, kad Pasaulis-214 neturi įtakos pacientų prognozei, nurodydama, kad vien Pasaulis-214 nėra pakankamai įtakos pacientų išgyvenimą.

• PLoS ONE: Padidėjęs Plazminiai D-dimerų koncentracijos sumažėjimas koreliuoja su ilgalaikiu Survival skrandžio vėžiu sergantiems pacientams
• PLoS ONE: HIF-1 alfa Padidėjusi koreliuoja su Poor bendras išgyvenamumas ir ligos reiškinių išgyventas skrandžio vėžiu sergantiems pacientams Post-pašalintas skrandis