Identifikacija DNA metilacijo sprememb, povezanih z rakom človeške želodčne

Identifikacija metilacijskih spremembe DNK, povezanih z rakom človeške želodčne
Abstract
Ozadje
epigenetske spremembe izražanja genov je pogost pojav raka pri človeku. DNA metilacija je znana epigenetsko proces, vendar preverjanje natančne narave epigenetske spremembe, povezane z rakom ostaja depresijo.
Metode
smo profilirana na methylome človeške želodčne tkiva raka pri 50-bp resolucijo z uporabo metiliran obogatitev DNA tehnike (methylated CpG okrevanje otok test) v kombinaciji z genoma analizatorjem in novo normalizacije algoritem.
Rezultati
uspeli smo pridobiti celovit pogled predlagateljev z različnimi gostotami CPG, vključno CpG otoki (CGI), prepis organi, in različne ponavljajo razrede. Ugotovili smo, da je rak želodca povezana z hypermethylation 5 'CGI in 5'-koncu, ki kodirajo eksonov kot tudi hipometilacijo ponavljajočih elementov, kot so kratka vmes ležečimi jedrskih elementov in kompozitnega elementa SVA. Hypermethylation 5 "CGI je pomembno povezana z downregulation pridruženih genov, kot so tisti v HOX
in histonov genskih družin. Ugotovili smo tudi na dolge razdalje epigenetsko utišanje (LRES) regije v želodcu tkiva raka in ugotovila več hypermethylated geni (Mdm2
, DYRK2
in LYZ
) v teh regijah. Status metilacija elementov CGI in gen obvestili v metastatskih bezgavk je bil vmes med običajnim in rakasto tkivo, kar pomeni, da je metilacija določenih genov v rakasto tkivo postopno povečala.
Sklepi
Naše ugotovitve bodo zagotovili dragocene podatke za nadaljnjo analizo od CpG metilacijskih vzorcev, uporabne markerji za diagnozo raka na želodcu, kot tudi nove metode analize za preiskave klinični epigenomics.
Ozadje
raka želodca je drugi najpogostejši vzrok smrti zaradi raka v svetu po pljučnega raka, zaradi česar več kot 800.000 smrtnih žrtev po vsem svetu vsako leto [1]. Trenutna 5-letna stopnja preživetja posameznikov z diagnozo raka želodca samo 20-30%, pri čemer je ta nizka stopnja čemer je posledica dejstva, da so v večini primerov že v fazi, ko diagnosticirana. Kot pri vseh rakov, zgodnje odkrivanje ostaja najbolj obetaven pristop za izboljšanje stopnje preživetja. Zato je razumevanje vzroka tumorigeneze v človeške želodčne tkiva je bistveno.
Okužbe s H. pylori
je dobro uveljavljen in najpogostejši vzrok raka želodca. Vendar pa spremembe v različnih genetskih dejavnikov so pomembni za povečanje tveganje za nastanek raka želodca tudi. Znano je, da kromosomsko nestabilnost izvira iz genetskih faktorjev, kot so mikrosatelitno nestabilnost kot tudi KRAS
in p53
mutacij povzroči razvoj tumorjev. Več genomske študije so ugotovili zarodne mutacije specifičnih genov [2-4] in bolezni občutljivega loci [5, 6] za rakom želodca. Nedavne študije so primerjali z rakom želodca in normalno tkivo so odkrili številne genetskih markerjev, vključno diagnostičnih označevalcev [NF2
[7], INHBA
[8], SFRP4
[9]], prognozi [CD9
[10], CDH17
[11], PDCD6
[12]], in želodca, povezani z rakom geni [MUC13
[9], CLDN1
[13], Ki67
in CD34
[14]]. Poleg tega je bilo ugotovljeno, epigenetski mehanizmi, kot so DNA metilacije in histonskih sprememb, ki so pomembni pri urejanju izražanje genov, ki sodelujejo pri biologiji in bolezni prebavil [15].
DNA metilacija igra pomembno vlogo pri evkariontih in je povezana z več ključnih mehanizmov, vključno z genomsko odtis, X kromosomov inaktivacijo, staranje in rakotvornost. Sprememba metilacije DNA v genom najdemo v skoraj vseh vrstah raka, in lahko privede do sprememb v izražanju genov, kot prekomerno ekspresijo onkogenov in utišanje zaviralnih genov med razvojem raka [16]. Številne študije so pokazale, da je kopičenje genetskih in epigenetskih sprememb v želodcu predrakavih sprememb lahko vpliva veliko število ciljev, kot so sestavni deli za popravilo DNA sistem, tumor razbijal, onkogeni, regulatorji celičnega ciklusa, rastnih faktorjev in adhezijskih molekul [17-20] . Vendar pa te študije so bile usmerjene predvsem v nekaterih kandidatnih genih ali prekriti le del celotnega genoma. Tako je dostop do svetovnega pogled na epigenetske spremembe, povezane z razvojem raka je bilo težko. Zlasti razumevanje sprememb DNA metilacije v intragenic regijah, CpG otokov, medgenskega regije in ponovite sekvenc še vedno omejeno. Zato obstaja velik interes za genoma vsej analize odklonskega metilacije DNA v teh regijah.
Za celovito genom obsega profiliranje metilacije DNA v embriogenezo in rakotvornosti visoke ločljivosti cele metode genom zaporedja, kot so BS-seq [21 -24], MeDIP-seq [25, 26], in MethylCap-seq [27-29] so bili razviti. Kljub hitremu razvoju, ki temelji na tehnologije za določanje zaporedja kartiranja, je še vedno pomanjkanje primerjalnih raziskav, ki je bistvenega pomena za klinične epigenomics študij, vključno s tistimi, osredotočene na raka. Za razliko od pristopov, ki temeljijo na mikromrež so podatki zaporedja proizvajajo v obliki, ki je ni mogoče diferencialno analizo, in potek dela analiza ni bila standardizirana. Zato so potrebne računsko poceni metode normalizacije, ki skrbi za računalniško breme obdelavo velikih velikosti, podatke zaporedja visoke ločljivosti.
Tu smo uvedli normalizacije algoritem, ki upošteva vzorčno specifične skupno gostoto branje, prostorska distribucija CpG lokusov in ozadja zaporedja pristranskosti. Nato smo ustvarili celovito celotnega genoma methylome normalnega želodčnega tkiva, želodčnega raka tkiva in metastatskih bezgavk uporabo MethylCap-in naslednje metode in dobljeni podrobne informacije o svojem motnje v kancerogenosti in metastaz. To je mogoče enostavno uporabiti za primerjalno analizo methylomes in drugih vrst epigenomic podatkov, in ima nekatere posledice za klinične epigenomics.
Metode
želodca vzorcev tkiv
smo ga dobili tri snap-zamrznjene želodčnih tumorjev in ujemajo normalno želodca tkivo Seoul National University College of Medicine za študij methylome. Poleg tega je bilo osemindvajset ujema parov normalnih in tumorskih želodca tkiv pridobljeni za nadaljnjo potrditev. Vsi vzorci so bili pridobljeni z endoskopsko resekcijo med obravnavanjem bolnikov, ki so dali obveščena privolitev
Metiliran okrevanje DNK test (MIRA)
genomske DNK iz 25 mg želodčnega tkiva čistimo z DNeasy kri &.; Tkivo Kit (Qiagen, Valencia, CA). Genomske DNA vzorci iz 3. posameznikov zberemo v enaki koncentraciji. MIRA smo izvedli kot je opisano predhodno [30-32]. Na kratko, GST-označil MBD2b in Njegove-tagged MBD3L1 proteini so bili pripravljeni, kot je opisano. 15 ug genomske DNA razdrobljene 100 ~ 500 bp s sonikacijo in inkubiramo pri 28 ug očiščenega GST-MBD2b proteina, 28 ug njegovega-MBD3L1 proteina in 7 ug JM110 Bakterijski DNK 6 ur. dodamo 30 ul MagneGST kroglice (Promega, Madison, WI) preblocked s 7 ug JM110 bakterijske RNA in inkubirali pri 4 ° C z vrtenjem za 45 minut v končnem 600 ul Mire vezavnih reakcijske zmesi. Kroglice speremo trikrat s po 1 ml pufra za izpiranje in metiliranih fragmente smo eluirali z inkubacijo pri sobni temperaturi 5 minut in nato 56 ° C za 30 minut z 30 ul TE vsebuje RNaze A (100 ug, Qiagen) in proteinazi K ( 15 ug, Qiagen). Eluirani DNA fragmente smo dodatno očistili z uporabo Qiaquick PCR za čiščenje kompleti (Qiagen).
Illumina Genome analizatorja zaporedje
uporabili smo 10 ng eluiranega DNK za Illumina Genome analizatorja sekvenciranje. Po ligacija para Solexa adapterjev, ligacijo proizvodov z največjo velikostjo vstaviti 200 bp smo gelsko očistili na 2% agaroze in izpostavimo PCR. Cluster generacije in 36 ciklov sekvenciranje smo izvedli po navodilih proizvajalca. zaporedje smo 120 ul-adapter ligiramo, velikost frakcionirali DNK (2 ~ 4 PM) na Illumina genoma analizatorjem. Zaporedje oznake so preslikani v človeški genom (UCSC hg18 baze podatkov, ki temelji na NCBI zgraditi 36,1 sklop) za uporabo Solexa Analiza cevovod (različica 0.3.0). Sequenced bere od 34 bp (razen prvi in ​​zadnji nukleotid), ki je potekel bili uporabljeni filtri za nadzor kakovosti. Obdelava
podatkov in izračun MES
smo podaljšan konec 3 'za 34-bp bere za 200 bazičnih točk za kritje DNK delci, ki jih s proteini MBD zavezuje. Odčitek je pretvori v brskalnik raztegljive podatkov (ležišče) datoteke za vizualizacijo v UCSC genom brskalnika http: //. Genom UCSC edu /.. Mi šteje prekrivajoče zaporedne oznake pri 50 ločljivosti bp. Najti obogatene genomske regije, je število preslika zapisano v drsnem oknu 1 kb v primerjavi s celotnim številom bere ali število ozadje zapisano v genomu. Kot tak je bil MES izračunana na dva načina; eden je kot log2 (ciljne prebral število /ciljne velikosti) /(skupno število bralno /velikosti genoma) in zaokrožena na nič, drugi pa je kot log2 (ciljne prebral število /ciljne velikosti) /(ozadje prebral število /ozadje velikost) in zaokrožena na nič. Za prilagoditev za ozadje zaporedja pristranskosti, je MESbg izračuna na enak način za vhodni sekvenciranje brez afinitetno čiščenja in odšteje od MŠŠ.
Genomske stališča CGI, promotorji, transkript organov, CDS, in ponavljajočih se elementov
vse genomske položaje CGI programi so prepisi in ponavljajočih se elementov prenesli iz genoma brskalnika UCSC. Skupaj 27,639 CGI programi (razen naključno nahaja CGI), je bilo napovedano po naslednjih kriterijih: GC vsebnost 50% ali več, dolžina je večja od 200 bp, in razmerje večje od 0,6 opazovanega števila CpG dinukleotidov na pričakovano število [33] . NCBI mRNA referenčne zaporedja zbirka (RefSeq od različice izpust 46; marca 11, 2011) smo uporabili za identifikacijo pri prepisovanju enote z opredeljenim prepisovanje začetek, konec mesta in CDS začetek, konec mesta. Za nosilce smo uporabili regija 500 bp pred ~ 500 bp navzdol od začetnim mestom transkripcije. Dobili smo ~ 5 milijonov ponovite lokacije, ki so bile določene v programu RepeatMasker temelji na knjižnici RepBase ponovitev.
Raven Metiliranje genomskih elementov
ravni metilacijskega CGI, promotor, genov-telo, in ponovite element je bila ocenjena s pomočjo MES prekrivajočih se vsak element. MES = 0 je bila uporabljena za določitev nemetilirane elementov. Za merjenje hypermethylation ali Hipometilacija v raka, smo izračunali diferencialno nered kot (raka MES - Normal MES). Razlika MES > 1,0 smo uporabili kot prag. Da bi razumeli funkcije izbranih genov smo uporabili klasifikacijo ontologija genov skozi DAVID Funkcionalna Komentar Povezovanje orodja http:.... //David abcc ncifcrf gov /
Izražanje genov analiza
mikromrež izdelek uporablja v tej študiji je bil Codelink Human Whole Genome 55 K čip (GE Healthcare, ZDA). Vsi eksperimentalni postopki, vključno s ciljno Črna pripravo, hibridizacije, so sklopke dye post-hibridizacija izvaja z uporabo prodajalec priporočene protokole. Datoteke rezultat je bilo uvoženo v GeneSpring GX 7.3 (Agilent Technologies, ZDA) za filtriranje in osnovne statistične analize. Med 55 K genov na mikromrež, samo gene s sedanjih zastavami v vsaj 50% vzorcev je bilo izbranih za nadaljnjo analizo. Podatki o mikromrež so bile deponirane na GEO http:.. //www NCBI NLM nih gov /geo /(pristopna številka GSE33651)
MIRA in v realnem času qPCR
MIRA... smo izvedli na štirih dodatnih posameznih vzorcev. DNA smo očistili iz supernatanta in spremljati v realnem času qPCR uporabo Roche 480 stroj. Sekvence, ki se uporabljajo primerji so predstavljeni v dodatni datoteki 1:. Tabela S1
bisulfit zdravljenje, metilacijo specifične PCR in pyrosequencing
smo izolirane genomske DNK iz posameznega vzorca z uporabo Qiagen DNeasy Tissue Kit (Qiagen). Bisulfit obravnava je bila izvedena s pomočjo EZ DNA metilacija zlato komplet (Zymo raziskave), v skladu z navodili proizvajalca. Bisulfit obdelano DNA smo shranili pri -80 ° C do nadaljnje uporabe. Primerji, ki se uporabljajo za PPN so namenjeni uporabi [34] Methprimer, in so prikazani v dodatni datoteki 1: Tabela S1. PCR smo izvedli z HotStarTaq polimerazo (Qiagen) in vključeni prvi inkubaciji pri 95 ° C za 15 minut, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 1 minuto, 59 ° C za 1 min in 72 ° C za 40 sekund, nato pa en ciklus 72 ° C za 10 minut. Izrabe PPN produkta ločimo na 2% agaroznem gelu in vizualizirali s EtBr barvanjem. V pyrosequencing učinki so bili samodejno opravi s sistemom PSQ 96 (Pyrosequencing AB) v skladu z navodili proizvajalca. Na kratko smo biotiniliranega PCR produkt (50 ul) očistimo z uporabo streptavidin-sefarozo kroglice (Amersham Biosciences). Očiščen produkt smo naložili v reagenta vložek z encimom, substrata in dNTP vključeno v PSQ96 SNP Reagenčni komplet (Pyrosequencing AB). V zaporedja primerji za pyrosequencing so prikazane v dodatni datoteki 1:. Tabela S1
Rezultati
obdelavo MIRA-naslednjimi podatki methylome
očistili smo metilirani DNK obogaten z MIRA (metilira CpG okrevanje otok testa) in zaporedje DNA z uporabo naslednje generacije zaporedja. Ravni DNA metilacije bile določene z uporabo zaporedja prebrati štetja ustreznih regij, na 50 bt intervalih, kot je opisano v metode. Ustvarili smo DNA metilacije zemljevide tako normalnih in rakavih želodčnega tkiva. Za vsak vzorec, smo pridobili približno 10 milijonov zaporedje glasi (Dodatne datoteke 1: Tabela S2). Vsak methylome vseboval ~ 140 milijonov CpG bere, pokriva ~ 48% vseh genomskih območij CpG brez centromerov (Dodatni datotek 1: Tabela S3). Povprečna pokritost CPG prebere bil vsak methylome 4.5X. V podporo visoke občutljivosti MIRA, imela genomskih odsekov, ki vsebujejo samo eno CPG več brati števila tistih, ki nimajo CpG (p
vrednost = 0), kar pomeni, da se lahko posamezne spremembe CpG rešiti z MIRA. Povprečna sekvenca odčitkov sorazmerno poveča število CpGs v 50-bp intervalu, in dejansko MIRA pokritost ni bila nizka, tudi za regije z nizko gostoto CpG (Dodatna datotek 2: Slika S1). Vzeta skupaj, ti rezultati kažejo, da je MIRA uspešna pri vračanju zadosten delež metilirani regij. Kot je za točnost MIRA, ~ 99% MIRA-ujeli fragmentov je imelo vsaj en CpG mesto znotraj njihovega zaporedja, kar kaže na nizko stopnjo lažno odkrivanja ponaredkov.
Za merjenje obogatitev lokalnih metilacijskih signalov, smo izračunali rezultate za obogatitev urana metilacija (MES ) s pridobitvijo branje število v določeni regiji, nato pa opravljajo normalizacijo za nadzor za skupno berejo števila (MEST) v vzorca (globalno normalizacije) ali število lokalnih branje (Mešl) v uporabniško določeno okoliške regije (lokalni normalizacija) (glej metode). To omogoča neposredno primerjavo neodvisnih vzorcev z različno gostoto branje. Nato smo izvedli logaritemsko transformacijo, pridobljenih točk. Poleg imajo druge matematične prednosti, to pa zagotavlja korist stabilizacije variance, zlasti za visoko branje celic, ki so pogosto skupaj z visokimi tehničnih sprememb, ki se lahko uvedejo večja odstopanja v podatkih.
Smo ocenili statistično značilnost MŠŠ v dva načina. Naključno MES so številčno ustvari permutacije genomske stališča našega zaporedje bere. V ozadju MES (MESbg) je eksperimentalno pridobljeni s zaporedja normalno genoma brez afinitetno čiščenja. Kot je bilo pričakovati, se pravi podatki prinesla občutno višje bogatenje točk (dodatno datoteko 2: Slika S2). Predvsem je MESbg višja od MŠŠ iz naključno genomov, navedbo, da sekvence v ozadju sam lahko ustvari obogatitev, verjetno zaradi kromatina dostopnosti in ojačanja pristranskosti. V skladu z zadnjimi poročili [35], to kaže na potrebo po ustrezni kalibraciji za inherentno zaporedja pristranskosti. Zato smo normalizirali naše STG z MESbg.
Da bi ugotovili optimalni pogoj za normalizacijo, smo primerjali statistične primernost različnih metod normalizacije. distribucija Tag ob genoma lahko modeliramo s Poissonove porazdelitve [36, 37]. Dobrota fit smo testirali s testom Kolmogorov-Smirnov. V tem testu, nizka D statistika kaže dobro prilega. Medtem ko je model Poisson prekosila Gaussovo v skupnem seštevku, MES pokazala bolj primerna kot surovine prebranih grofov (Dodatni datoteke 2: Slika S3), kar kaže na redek dogodek naravo prebrati ukrepa štetje na-log pomanjšana. Normirane Mešl, ki jih nadzorni sekvenciranja (MESbg) umerjenih prinesla še boljše rezultate kot normalizirane MEST s kontrolnim sekvenciranja (MESbg).
Globala in kromosomskih pogledom DNA metilacije
Po potrditvi najboljši način za raven metilacije točkovanja genoma vsej umerjeno na 50-bt intervalih, moramo najprej preučiti vzorce kromosomskih metilacije zdravih vzorcev. Povprečne MES izračunane za vsak kromosom predlagal, da CpG bogati in genskih bogati kromosomi ponavadi zelo metilirana (Slika 1A). Ravni metilacija kromosomov z velikimi količinami dolgo vrinjeni jedrske elementov (črte) je bil relativno nizek (npr kromosom 4). Zanimivo je, da je bila količina kratkih vmes ležečimi jedrskih elementov (sinusov) sorazmerna kromosom metilacije vzorcu. To je dejstvo, da so Sines običajno žive v genskih bogate regije verjetno povzročil. Sex kromosomi so globalno hypomethylated z nižjo CpG gostoto in višjo ponovite vsebine kot autosomes. Ker smo uporabili tkiv, vzetih iz moškega v tem poskusu je globalno Hipometilacija kromosom X opazovanem ni povezan z X deaktivacijo. Kromosomske vsej ogledov ponavljati visoko gostoto CPG visoko metilacija okoli genov, bogatih (glej črne črte na dnu) in CGI bogate regije (glej modre palice na vrhu) (slika 1B). (; 1 kb >) (glej rdeče palice na vrhu), v nasprotju s tem, so bile nizke gostote CpG in nizko metilacija okoli genov revnih regijah, ki so bogate z ponovitvah dolgega dosega opaziti. Povprečne MES kažejo, da je stopnja metilacija CGI znatno višja od tiste genih regij ali ponovitev (slika 1B). Slika 1 vzorci metilacije normalnega želodčnega tkiva. (A) kromosomov na ravni povprečne MES je prikazana kot funkcija povprečne gostote CPG, gostoto genov (število genov na Mb), LINE količine (dolžine LINE na Mb), in SINE količine (dolžine sine na mb) za vsak kromosom. (B) Za kromosom 22, so bile povprečna gostota CpG (osenčeno sivo) in MES (črna krivulja), pridobljene v 1-Mb drsnih oken. Stališča kopiranih genov (črne palice na dnu), CG otoki (modre palice na vrhu), in dolge Ponovitve (> 1 kb, rdeče palice na vrhu) so primerjali v luči metilacije DNA in CpG gostote ( levo). Povprečne MES za CGI, genska organi, in ponavlja (desno). (C) Razporeditev genskih organov in CGI MES (levo). Povprečne MES za-promotorja povezana in promotorja neodvisen CGI je prikazano na desni. (D) Povprečne MES za promotorja podskupine, ki temelji na obstoju CGI (levo). (E) Osnovni podatki o medgenskega, exonic in intronskih regijah, glede na dolžino, število CPG, in preslika bere (levo). Porazdelitev medgenskega, exonic in intronskih nered je prikazano na desni. (F) Osnovni podatki o nabavnem 1-kb regiji 5 'UTR eksonov, kodiranje eksonov, 3' UTR eksonov in nadaljnji 1-kb regija glede na dolžino, število CPG, in preslikane bere (levo). Porazdelitev MŠŠ za vsak element, ki je prikazano na desni.
Splošno CGI programi ponavadi ostanejo metilacije brezplačno v normalnem tkivu. Za analizo vzorcev visoke metilacija CGI, smo preverili povprečno porazdelitev MES in ugotovila rahlo bimodalno vzorec (slika 1C). Približno 66% (11.376 /17.284), od CGI programi v levem vrh prekrivali s promotorjem (1 kb po naši definiciji). V nasprotju s tem, 13% (1.386 /10.357), od CGI programi v pravo vrh prekrivali s promotorjem, kar kaže, da so najbolj promotor povezana CGI nemetiliran. povezane z promotor v nasprotju s CGI, promotor neodvisen CGI programi so zelo metilira (slika 1C). Čeprav je večina CGI-pozitivne predlagatelji niso metiliran, promotorji CGI-negativna pokazala relativno visoko raven metilacije (slika 1D). Prav tako smo preverili raven metilacijski predlagateljev s CpG gostoto kot je definirano prej [38] (Dodatni datoteka 3: Tabela S4). Metiliranje vzorec predlagateljev je v obratnem sorazmerju z CpG gostote (Dodatni datoteke 2: Slika S4). Po drugi strani, ki vsebujejo CGI gena organi so imeli višjo raven metilacije od tistih brez CGI programi (slika 1D).
Naprej, smo analizirali vzorce za bogatenje metilacija na različnih obrazloženi genomskih elementov za raziskovanje regije, ki so bile prednostno metiliranih. Gensko regije zasedajo približno 40% človeškega genoma, ampak približno 53% od skupno zapisano je v tej regiji, z večino se glasi, da se nahajajo v intronskih regiji (tabela 1). Čeprav je velik del metiliranih fragmentov sodijo intronskih regijah, razmerje preslika bere dolžini eksonov je precej višja od tiste za intronov, kar kaže, da so eksoni višje methylated kot intronov (slika 1E). Znotraj genov, povezanih regij, obogatitev kodiranja eksonov je celo višja kot v drugih regijah, kot je že poročali (slika 1F in tabeli 2) [39]. To jasno kaže, da ima metilacija vlogo pri EXON regulation.Table 1 humani genom in normalno informacij vzorca za gensko in medgenskega regiji
Human Genome Informacije
Normal Vzorec Informacije

Relativni bogatitve, razmerje
Funkcionalno Kategorija
dolžina (bp)
razmerje

# od CpG
razmerje
Bere
razmerje
vs. Dolžina
vs. CpG Count

Genic
1,184,139,094
39.46
13,262,253
47.09
20,854,434
53.25
1.35
1.13
Exon
68,035,894
2.27
1,808,089
6.42
4,350,405
11.11
4.90
1.73
Intron
1,122,817,725
37.41
11,613,113
41.23
17,358,273
44.32
1.18
1.07
Intergenic
1,816,976,186
60.54
14,901,610
52.91
18,310,273
46.75
0.77
0.88
Human Genom
3001115280
100
28163863
100
39164707
100
1.00
1.00
Tabela 2 Človeški genom in normalno informacije vzorec genskih označenih regij
Human Genome Informacije
Normal Vzorec Informacije

Relativni bogatitvijo urana razmerje

Funkcionalna Kategorija
Dolžina (bp)
razmerje

# od CpG
razmerje
bere

Razmerje
vs. Dolžina
vs. CPG Grofa
gorvodno 1 KB
24468069
0,82
937.748
3,33
535.593
1.37
1.68
0,41
5'UTR eksonov
8436529
0,28
411.563
1.46
292.654
0,75
2.66
0,51
Kodiranje eksonov
33384619
1.11
1.077.913
3,83
3448755
8.81
7.92
2.30
3'UTR eksonov
28387978
0,95
378.012
1.34
806.832
2.06
2.18
1,53
nadaljnjega 1 kb
23136263
0,77
340.866
1.21
551.071
1.41
1.83
1.16
človekovih genom
3001115280
100
28163863
100
39164707
100
1.00
1.00
Spremembe DNK vzorci metilacije, povezane s želodčnega raka
Ko povprečne kromosomske MES v methylome raka je v primerjavi s kontrolnega tkiva, smo ugotovili, da so vsi kromosomi v tkivu raka večinoma se hypomethylated (Dodatne datoteke 2: Slika S5). S pogledom kromosomskih svetu, je bilo ugotovljeno, CGI bogate regije, ki jih je treba posebej hypermethylated, medtem ko so bile ponovljene bogate regije zelo hypomethylated (slika 2A; Dodatna datoteka 2: Slika S6). Za analizo metilacije spremembe v genomske elementov, smo usklajeni vsak element na začetne in končne straneh in potem dobimo povprečne STG na vsakem ustreznem položaju. Presenetljivo, smo zaznali hypermethylation na nabavnem regiji, zlasti s 500 bp gorvodno do začetnim mestom transkripcije (slika 2B). To je v skladu z hypermethylation promotor regij pogosto opazimo pri raku. Slika 2: Primerjava vzorcev metilacijskih pri normalni in rakasto tkivo. (A) Povprečna MES krivulja za normalno (črno) in rakave (rdeča) tkivo v kromosomu 19 (levo). Povprečne MES za CGI, genska organi, in ponavlja (desno). (B) DNA metilacija genov označeni elementi. Vsak element (pred 1 kb, ekson, intron in dolvodno 1 kb) so razdeljene na 20 košar in povprečne MŠŠ je bilo pridobljeno za vsak bin vseh ustreznih elementov. (C) metilacija DNK v transkriptu koncih in kodira regijo konce. Povprečne MES bil pridobljen na drsni 50-bp okno po oddaljenosti od začetka Prepis (prve) in konec (drugi) za nosilce CGI-pozitivne kot tudi začetek Prepis (tretji) in konec (četrto) za CGI- pozitivni promotorji. (D) DNA metilacija vseh 5 'UTR eksonov (levo) in 5' UTR kodirajo eksonov (desno).
Regija s središčem na začetnem mestu transkripcije pokazala povsem drugačne vzorce glede na prisotnost CGI, ki odraža nizko stanje metilacija promotorjev, ki vsebujejo CGI (slika 2C). Ugotovili smo tudi, da je v rakavo tkivo, izjemna hypermethylation promotorjev, ki vsebujejo CGI pojavi, in da je gostota CpGs ključnega pomena za povečanje DNA metilacijo (slika 2C). Za nadaljnjo analizo, ali so bile regije 5 'genov hypermethylated podobno promotorjev genov, smo preverili metilacijski vzorec prvih eksonov. Zanimivo je, da smo ugotovili, da je bila prva ekson hypermethylated šele, ko je bila 5 'koncu kodirne eksona, vendar ne, ko je bila 5' UTR ekson (slika 2D). Te regije vsebuje tudi visoko gostoto CpG. Zato, CGI programi na nabavnih regij genov, promotorja in začetku kodiranja zdi, da so glavni cilji hypermethylation DNA pri raku.
Metilacije vzorec CpG otokov
Raziskati povezavo med lokacijo CGI programi in DNA metilacija, smo podskupine CGI programi glede na njihov položaj v genomu. Še posebej so bili kategorizirani kot 5 '(ki se nahaja med 1 kb navzgor in zagon spletne strani kodiranje gena), intragenic (intragenic CGI zunaj koncem 5'), in medgenskega (ki se nahajajo v ne-gensko regiji) (Dodatni datotek 1: miza S5). Čeprav je CpG gostota podobna izmed treh skupin, "so CGI (intragenic in medgenskega CGI) bistveno bolj methylated kot 5" non-5 CGI (Dodatni datoteke 2: Slika S7). Nadaljevali smo primerjali povprečne STG iz podskupine CGI in ugotovila metilacija vseh CGI programi so na splošno povečal. Vendar pa je relativna razlika MES predlagal, da "je CGI bistveno večja kot pri drugih CGI programi (slika 3A), kar kaže na pomembno vlogo 5" sprememba metilacije v 5 CGI programi v raka. Obseg 5 "CGI hypermethylation pomembno povezana s prekrivanjem začetnim mestom transkripcije (slika 3B). Slika 3 DNA metilacija CpG otokov. (A) Relativni diferencialne MES iz podskupine CGI programi. (B) Korelacija med diferencialno CGI metilacije in razdaljo do mesta prepis zagon. (C) Korelacija med stopnjo izražanje genov in hypermethylation za CGI programi. (D) Metiliranje specifični PCR histonskih genov prikazujejo najvišje diferencialni MES vrednosti. . M1 in U1 ustrezajo HIST3H2A, medtem ko M2 in U2 ustrezajo HIST3H2B
želite raziskati funkcije genov, ki sodelujejo diferencialno metilacije na 5 'CGI, smo izbrali genov z visoko diferencialno CGI MESS (diferencialna MŠŠ > 1). Nato smo izvedli ontologija analize genov (GO), da dobijo vpogled v mehanizme, ki so odgovorni pri raku (tabela 3). Ko so bili geni zbrani v različne kategorije GO, smo ugotovili, da so bili HOX
gruče genov in nukleosomom povezanih z sestavljanja gruče genov tarče hypermethylation, medtem ko je v zvezi z apoptosis gruče genov so bili cilji za hipometilacije. Zanimivo je, da je naša ugotovitev, da so bili HOX
gruče genov prednostne cilje za metilacije DNA je v skladu s predhodnim poročilom [40]. Poleg tega gena parcele potrdila, da je hypermethylation CGI-specifična raka (Dodatni datoteke 2: Slika S8). Za oceno spremembe vzorcev izražanja s hypermethylation 5 "CGI povzroča, smo opravili funkcionalno analizo podatkov izražanja genov, pridobljenih iz cDNA mikromrež poskusov za. Hypermethylation 5 "CGI je pomembno povezana z downregulation genov (p
= 0,03) (slika 3C; Dodatna datotek 3: Tabela S6 in S7). To kaže, da utišanje genov z metilacije lahko s stopnjo CpG gostote in 5 'CGI hypermethylation neposredno prizadete. Analizirali smo metilacijski status DNA genov z hypermethylated 5 'CGI in navzdol reguliranih izražanja vzorce. Med njimi je bil gen, ki kodira tipa histon skupinoCbH2b 3-B (HIST3H2BB
). Analiza HIST3H2BB
promotor metilacije uporabo metilacijo-specifične PCR je pokazala, da večina bolnikov z rakom (8/10, 80%), razstavljena povečano metilacije v promotorski regiji (slika 3D) .table 3 Funkcionalna označevanje gruče genov z hypermethylated 5'CGIs
Komentar Cluster 1
Obogatitev Ocena: 3.27
Štetje
P_Value
GOTERM_BP_FAT
nukleosomom sklop
11
3.90E-04
GOTERM_BP_FAT
kromatin sklop
11
5.20E-04
GOTERM_BP_FAT
protein-DNA kompleks montažo
11
7.40E-04
Komentar Cluster 2
Obogatitev Ocena: 2.92
Štetje
P_Value
INTERPRO
histon core
8
6.80E-04
SP_PIR_KEYWORDS
nukleosomom core
8
8.60E-04
GOTERM_CC_FAT
nukleosomom
8
3.10E-03
Komentar Cluster 3
Obogatitev Ocena: site
17
5.10E-03
INTERPRO
Homeobox
17
5.70E-03
SP_PIR_KEYWORDS
Homeobox
17
5.80E-03
INTERPRO
Homeodomain-related
17
6.40E-03
SMART
HOX
17
1.40E-02
D4
3
9.10E-03
SP_PIR_KEYWORDS
embryo
3
3.30E-02
PIR_SUPERFAMILY
PIRSF002612:homeotic

• Odkrivanje človeško zgodovino iz želodca bacteria
• Prisotnost S100A9 pozitivnih vnetnih celic v tumorskih tkivih povezana z zgodnjim rakom fazi in boljšo prognozo pri bolnikih z razjedo cancer