Azonosítása DNS metiláció változások kapcsolódó emberi gyomor cancer

azonosítása DNS metilációs változások kapcsolódó humán gyomorrák
Abstract
alapon
epigenetikai megváltozása génexpresszió egy gyakori esemény a humán rák. DNS metiláció egy jól ismert epigenetikus folyamat, de ellenőrzése pontos természetét epigenetikai változások kapcsolódó rák továbbra is nehéz. Katalógusa Módszerek katalógusa Mi profilos az methylome humán gyomorrák szövetet 50 bp felbontást biztosít a denaturált DNS-dúsítás technika (denaturált CpG sziget hasznosítási vizsgálat) kombinálva genom analizátor és egy új normalizálás algoritmus. katalógusa Eredmények
tudtunk szerezni egy átfogó képet promóterek különböző CpG sűrűséggel, beleértve CpG-szigetek (CGIS) átirat szervek és a különböző ismétlési osztályok. Azt találtuk, hogy a gyomorrák társult hipermetiláció 5 'CGIS és az 5'-végén a kódoló exonját valamint hipometilációjához ismétlés elemek, mint például a rövid tarkított nukleáris elemeket és a kompozit elemet SVA. Hipermetilációja 5 'CGIS szignifikáns korrelációt downregulációját asszociált gének, mint amilyenek a HOX katalógusa és hiszton géncsaládokat. Azt is felfedezték, hosszú távú epigenetikus hangtompító (LRES) régiók gyomorrák szövetek és talált több hipermetiláltnak gén (MDM2 katalógusa, DYRK2 katalógusa, és lyz katalógusa) ezekben a régiókban. A metilációs állapotát CGIS és gén feliratozást elemek áttétes nyirokcsomók volt közbenső között normális és a rákos szövet, jelezve, hogy metiláció specifikus gének fokozatosan emelkedett rákos szövet.
Következtetések
Eredményeink nyújt értékes adatokat későbbi elemzés CpG metilációs mintázat, hasznos markerek a diagnózis a gyomor rák, valamint egy új elemzési módszer klinikai epigenomics vizsgálatok.
alapon
gyomorrák a második vezető oka a rákos halálesetek világszerte a tüdőrák után, ami a több mint 800.000 halnak meg világszerte. [1] A jelenlegi 5 éves túlélési arány diagnosztizált betegek gyomorrák csak 20-30%, ezzel az alacsony ráta annak a ténynek tulajdonítható, hogy a legtöbb esetben a már előrehaladott állapotban van, amikor diagnosztizálták. Mint minden rák, a korai felismerés továbbra is a legígéretesebb megközelítés javítása a túlélési arány. Ennélfogva, a megértés az oka tumorképzésért emberi gyomor szöveti elengedhetetlen.
Fertőzés H. pylori katalógusa van egy jól megalapozott és gyakori oka a gyomorrák. Azonban eltérések a különböző genetikai tényezők is fontosak növekvő gyomorrák kockázatát. Köztudott, hogy a kromoszómális instabilitás származó genetikai tényezők, például a mikroszatellita instabilitás, valamint a KRAS
és a p53
mutációk eredményeként a daganat kialakulásában. Számos genomikai vizsgálatok azonosították csírasejt-mutáció specifikus gének [2-4] és a betegség hajlamos loci [5, 6] gyomorrák. A legújabb vizsgálatok összehasonlításával gyomorrák és normális szövet azonosított számos genetikai markerek, beleértve a diagnosztikai markerek [NF2 katalógusa [7], INHBA katalógusa [8], SFRP4 katalógusa [9]], prognosztikai markerek [CD9
[10], CDH17 katalógusa [11], PDCD6 katalógusa [12]], és a gyomorrák-asszociált gének [MUC13 katalógusa [9], CLDN1 katalógusa [13], Ki67 katalógusa és CD34 katalógusa [14]]. Ezen túlmenően, epigenetikai mechanizmusok, mint például a DNS metiláció és a hiszton módosítások azt találták, hogy fontos szabályozásában részt vevő gének expresszióját a biológia és a betegség a gyomor-bél traktus [15].
DNS metiláció lényeges szerepet játszik az eukariótákban és társul számos kulcsfontosságú mechanizmusok, beleértve genomiális imprinting, X-kromoszóma inaktiváció, öregedés, és a karcinogenezis. Megváltoztatása DNS metiláció a genomban megtalálható szinte minden típusú rák és ahhoz vezethet, hogy megváltoztatja a génexpressziót, például túlzott expresszió az onkogének és silencing tumor szuppresszor gének során a rák fejlődését [16]. Számos tanulmány kimutatta, hogy a felhalmozódása a genetikai és epigenetikai változások gyomor prekancerózus befolyásolhatja számos célok, mint például a DNS-javító rendszer összetevőit, tumorszuppresszorok, onkogének, sejtciklus szabályozók, növekedési faktorok és adhéziós molekulák [17-20] . Azonban ezek a tanulmányok elsődlegesen néhány jelölt gének vagy fedett csak egy része az egész genomban. Így eléréséhez átfogó képet az epigenetikai változások kapcsolódó rák fejlődését nehéz volt. Különösen megértés DNS metilációs változások a intragénikus régiókban CpG szigetek, gének közötti régióban, és ismétlődő szekvenciák is korlátozott. Következésképpen nagy az érdeklődés a genomra kiterjedő elemzése aberráns DNS metiláció ezekben a régiókban.
Az átfogó genom léptékű profilalkotás DNS metiláció az embriogenezis és karcinogenitás, nagy felbontású teljes genom szekvenálása módszerek, mint a BS-azt követő cikkek [21 -24], MEDIP-SEQ [25, 26], és MethylCap-Seq [27-29] dolgoztak ki. Annak ellenére, hogy a gyors fejlődés a szekvenálás alapú helymeghatározó technológia, még mindig hiányzik a komparatív kutatás, ami kritikus klinikai epigenomics tanulmányok, beleértve összpontosított rák. Ellentétben a microarray-alapú megközelítések, szekvenálás adatokat állítanak elő olyan formában, hogy nem lehet úgy differenciális analízis és az elemzés munkafolyamat nem szabványosították. Ezért számításigényes olcsó normalizációs módszert kezeléséhez szükséges számítási terhet mikor nagy méretű, nagy felbontású szekvenálási adatok.
Itt bevezettük a normalizáció algoritmust, amely figyelembe veszi a minta-specifikus teljes olvasási sűrűség, a térbeli forgalmazása CpG loci, és a háttér szekvenálás elfogultság. Ezután létrehoztunk egy átfogó teljes genom methylome normál gyomor szöveti, gyomorrák szövetet, és áttétes nyirokcsomók a MethylCap-azt követő pontjait módszer és kapott részletes tájékoztatást a perturbáció során carcinogenesis és metasztázis. Ez könnyen alkalmazható összehasonlító elemzése methylomes és más típusú epigenomic adatok, és ez különösen olyan klinikai epigenomics. Katalógusa módszerek
Gyomor szövetminta katalógusa Kaptunk három beépülő fagyasztott gyomor tumorok és kiegyenlített normális gyomor szöveti a szöuli Nemzeti Egyetem College of Medicine a methylome tanulmány. Továbbá, huszonnyolc illesztett pár normál és daganatos szövetek gyomor kaptuk további megerősítést. Az összes mintát kapunk endoszkópos reszekció vizsgálata során a betegek, akik írásos beleegyezését adta.
Denaturált DNS-visszanyerő assay (MIRA) katalógusa genomiális DNS-t 25 mg gyomor szövetet alkalmazásával tisztítottuk DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). Genomi DNS-mintát 3 számú egyesítjük ugyanabban a koncentrációban. MIRA végeztük a korábban leírtak [30-32]. Röviden, a GST-címkézett MBD2b és His-címkézett MBD3L1 fehérjéket állítottunk elő az ismertetett módon. 15 ug genomiális DNS-t a töredezettség, hogy 100 ~ 500 bp ultrahangos kezeléssel, és inkubáltuk 28 ug tisztított GST-MBD2b fehérje, 28 ug His-MBD3L1 fehérje és 7 ug JM110 bakteriális DNS-6 órán át. 30 ul MagneGST gyöngyöket (Promega, Madison, WI) preblocked 7 ug JM110 bakteriális RNS-t adunk hozzá, és inkubáltuk 4 ° C hőmérsékleten forgó-on 45 percig a végső 600 ul MIRA kötő reakcióelegyhez. A gyöngyöket háromszor mossuk 1 ml mosópufferrel, és metilezett fragmenseket eluáltuk inkubálással szobahőmérsékleten 5 percig, majd 56 ° C-on 30 percig 30 ul TE tartalmazó RNáz A (100 ug, Qiagen), és proteináz K ( 15 ug, Qiagen). Az eluált DNS-fragmenseket tovább tisztítjuk QIAquick PCR tisztítási kit (Qiagen).
Illumina Genome Analyzer szekvenálás
használtuk 10 ng eluált DNS Illumina Genome Analyzer szekvenálással. A ligálást követően egy pár Solexa adapterek, ligálási termékek a maximális inszert mérete 200 bp gélen tisztítottuk 2% -os agaróz és alá kell PCR-amplifikáció. Cluster generáció és 36 ciklus szekvenálás végeztük a gyártó utasításai szerint. Mi szekvenálása 120 ul adapterrel ligált, méret frakcionált DNS-t (2 ~ 16:00) a Illumina Genome Analyzer. Sequence címkék vannak hozzárendelve az emberi genomban (UCSC hg18 adatbázis alapján NCBI építsünk 36,1 összeszerelés) a Solexa Analysis Pipeline (version 0.3.0). Szekvenálták olvas 34 bp (kivéve az első és az utolsó nukleotid), amely telt minőség-ellenőrzési szűrőket használtunk.
Adatfeldolgozás és MES számítás
kiterjesztettük a 3 'végén a 34 bp-os olvasás 200 bp fedezésére DNS töredékek köti a MBD fehérjéket. A kiolvasás alakítjuk böngésző bővíthető adatok (BED) fájlok megjelenítését a UCSC genom böngésző http: //genomban. UCSC. Edu /. Mi számít átfedő szekvencia jelölés 50 bp felbontás. Ahhoz, hogy megtalálja dúsított genomiális régiók száma, a leképezett olvas egy csúszó ablak 1 KB összehasonlítottuk a teljes olvasás számát, vagy a háttér olvasás számát a genomban. Mint ilyen, MES-t kétféleképpen számolt; az egyik, mint a log2 a (cél olvasható száma /target méret) /(összes olvasási száma /genom méret) és padlójú nulla, a másik pedig a log2 a (cél olvasható száma /target méret) /(háttér olvasni száma /háttér méret) és padlójú nullára. Beállítani a háttérben szekvenálás elfogultság, MESbg számították azonos módon bemeneti szekvenálás nélkül affinitástisztításához és levonják MES. Katalógusa genomiális pozícióit CGIS, promóterek, átirat szervek, CDS, és repetitív elemek
Összes genomiális pozícióit CGIS, átiratok és ismétlődő elemeket letölthető a UCSC genom böngészőt. Összesen 27.639 CGIS (kivéve véletlenszerűen elhelyezkedő CGIS) adtunk megjósolt a következő kritériumok alapján: GC tartalma 50% vagy nagyobb, hossza nagyobb, mint a 200 bp, és az arány nagyobb, mint 0,6, a megfigyelt számát a CpG dinukleotidok a várható száma [33] . Az NCBI mRNS referencia szekvencia gyűjtemény (RefSeq származó verziót 46; 11 március 2011) használtuk azonosítására transzkripciós egységek a meghatározott transzkripciós start, end helyszínek és CDS kezdete, vége oldalakon. A promoterek, használtuk a régió 500 bp upstream ~ 500 bp-vel lefelé a transzkripciós starthelyet. Kaptunk ~ 5.000.000 ismétlés helyeken határozták volna meg a RepeatMasker alapuló programot RepBase könyvtárának ismétlődik. Katalógusa Metiláció szintű genetikai elem katalógusa A metilációs szintje a CGI, promoter, gén-test, és ismételje elem becsültük útján MES átfedő minden elem. MES = 0 volt meghatározására használt metilálatlan elemekkel. Mérésére hipermetiláció vagy hipometiláció rák, kiszámoltuk az eltérés az étkezőnek, (Cancer MES - Normál MES). Differenciál MES > 1.0 használták a küszöbértéket. Ahhoz, hogy megértsük a funkciók kiválasztott gének, használtuk az ontológia besorolása gének révén DAVID Funkcionális Jegyzet Klaszterek eszköz http: //david. ABCC. Ncifcrf. Gov /. Katalógusa génexpressziós analízise
microarray termék ebben a vizsgálatban alkalmazott volt Codelink humán teljes Genome 55 K chip (GE Healthcare, USA). Minden vizsgálati eljárást, beleértve a cRNS cél előkészítés, hibridizáció, hibridizáció utáni festék kapcsolási végeztük gyártó által javasolt protokoll. Az eredmény fájlok behozták GeneSpring GX 7.3 (Agilent Technologies, USA) szűrési és alapvető statisztikai elemzést. Közül 55 K gének microarray, csak a gének jelen zászlók legalább 50% -a minták kiválasztott későbbi elemzésre. A microarray adatokat letétbe a GEO http: //www. NCBI. NLM. NIH. Gov /geo /(nyilvántartási száma GSE33651).
MIRA és a valós idejű qPCR katalógusa MIRA végeztünk négy további egyedi mintákat. DNS-t megtisztítottuk a felülúszót, és követjük a valós idejű qPCR Roche 480 gép. A szekvenciákat a használt primerek bemutatott Kiegészítő fájl 1: Táblázat S1.
Biszulfit-kezeiés, metiláció-specifikus PCR és Pyrosequencing
Izoláltuk a genomiáiis DNS-t az egyedi mintából Qiagen DNeasy Tissue kit (Qiagen). Biszulfit-kezeiés végeztük az EZ DNS metiláció arany kit (Zymo kutatás), a gyártó utasításai szerint. Biszulfittal kezelt DNS-t -80 ° C-on, amíg a további felhasználásig. A használt primerek MSP alkalmazásával terveztük Methprimer [34], és az eredményeket a kiegészítő fájl 1: Táblázat S1. PCR-t hajtottunk végre HotStarTaq polimeráz (Qiagen), és tartalmazza a kezdeti inkubálás 95 ° C-on 15 percig, majd 40 ciklus: 95 ° C 1 perc, 59 ° C-on 1 percig és 72 ° C-on 40 másodpercig, majd a egy ciklus 72 ° C-on 10 percig. MSP termékeket szétválasztjuk 2% -os agaróz gélen, és láthatóvá tettük EtBr-festéssel. A Pyrosequencing reakciókat automatikusan végrehajthatók egy PSQ 96 rendszer (Pyrosequencing AB), a gyártó utasításai szerint. Röviden, a biotinilezett PCR-termék (50 ul) tisztítjuk, sztreptavidin alkalmazásával-Sepharose gyöngyök (Amersham Biosciences). A tisztított terméket betöltve a reagens kazettát a enzim, szubsztrát és dNTP szerepelnek a PSQ96 SNP reagenskészlettel (Pyrosequencing AB). A szekvenálás primerek piroszekvenálás láthatók Kiegészítő fájl 1: Táblázat S1. Katalógusa eredményei katalógusa feldolgozása MIRA-azt követő pontjait methylome adatok
Mi tisztítjuk a denaturált DNS nemesebbé MIRA (metilezendő CpG sziget hasznosítási teszt) és szekvenálták DNS-generációs szekvenálás. DNS-metilációs szintek segítségével határoztuk meg szekvenálása olvasni számít a megfelelő régiók, a 50 bp időközönként leírtak szerint módszerei. Azért hoztuk létre a DNS metiláció térképek mind normál, mind a rákos gyomor szövetekben. Minden egyes minta esetében kaptunk mintegy 10 millió szekvencia beolvassa (Plusz fájl 1: táblázat S2). Minden methylome tartalmazott ~ 140 millió CpG szól, amely ~ 48% -át genomi CpG helyek kivételével centromérák (Plusz fájl 1: táblázat S3). Az átlagos lefedettség CpG szól minden methylome volt 4,5X. A támogatást a nagy érzékenységű MIRA, genomi szegmensek egyetlen CpG magasabb volt olvasni számít, mint a nem CpG (p katalógusa érték = 0), ami arra utal, hogy egyetlen CpG változásokat lehetne oldani a MIRA. Az átlagos szekvenciát leolvasni arányosan növekedett a száma CpGs belül egy 50 bp intervallum, és valóban, a MIRA lefedettség nem volt alacsony, még azokban a régiókban, az alacsony sűrűségű CpG (Plusz fájl 2: Ábra S1). Összefoglalva, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a MIRA sikeres volt kinyerjük elegendő frakció metilezett régiókban. Ami a pontosságát MIRA, ~ 99% MIRA-elfogott fragmentumok volt legalább egy CpG-helyet azok sorrendjét, jelezve alacsony téves felderítési arány.
Mérésére gazdagodását helyi metiláció jelek kalkuláltunk metiláció dúsítási pontszámok (MES ) a megszerzett olvasni száma egy adott régióban, majd végző normalizálás, hogy ellenőrizzék a teljes olvasni count (mest) a mintában (globális normalizálás), illetve a helyi olvasási count (MESL) a felhasználó által definiált környező régióban (helyi normalizálás) (lásd módszerek). Ez lehetővé teszi a közvetlen összehasonlítást független minták különböző olvasási sűrűség. Ezután végezzük logaritmikus transzformáció a származtatott pontszámot. Együtt, amelyek más matematikai érdemeit, ez az az előnye, variancia stabilizálása, különösen a nagy olvasási számít, ami gyakran párosul a magas technikai eltérések, amelyek okoz jelentős torzítást az adatokat.
Megvizsgáltuk a statisztikai jelentősége a MES két út. Randomizált, MES keletkezett numerikusan permutálva genomiális pozícióit a szekvencia szól. A háttér MES (MESbg) kísérletileg kapott ütemezésével normál genom nélkül affinitás tisztítás. Ahogy az várható volt, a valós adatok kaptunk jelentősen magasabb dúsítási pontszámok (Plusz fájl 2: S2 kép). Nevezetesen, MESbg magasabb volt, mint MES randomizált genomok, azt jelzi, hogy háttér szekvenciák önmagában létrehozhat dúsítás, valószínűleg a kromatin hozzáférhetőség és erősítő torzítás. Összhangban a legutóbbi jelentések [35], ez azt mutatja, hogy szükség van egy megfelelő kalibrálást rejlő szekvenálás elfogultság. Ezért normalizálódott a MES MESbg.
Hogy megtalálja az optimális állapot normalizáció, összehasonlítottuk a statisztikai fitness különböző normalizációs módszert. Tag eloszlása ​​mentén a genom lehet modellezni a Poisson eloszlás [36, 37]. Az illeszkedés teszteltük a Kolmogorov-Smirnov teszt. Ebben a tesztben egy alacsony D statisztika mutatja, egy jó illeszkedést. Míg a Poisson modell felülmúlta a Gauss összességében a MES mutatott jobb illeszkedés, mint a nyers olvasási számít (Plusz fájl 2: Ábra S3), amely szemlélteti a ritka esemény jellege log pikkelyes olvasható száma intézkedést. A normalizált MESL kalibrálni kontroll szekvenálás (MESbg) után még jobb eredményt, mint a normalizált měst kalibrálni kontroll szekvenálás (MESbg). Katalógusa Globális és kromoszomális kilátást metilációs katalógusa Miután meggyőződtünk, hogy a legjobb módszer a pontozási genomot metilációs szintek 50 bp-os időközönként történik, először megvizsgálta a kromoszomális metilációs mintázat normál minta. Az átlagos MES számítani minden kromoszóma javasolta, hogy CpG-gazdag és gén-gazdag kromoszómák gyakran erősen metilált (1A). A metilációs szintje kromoszómák nagy mennyiségű hosszú tarkított nukleáris elemeket (vonalak) viszonylag alacsony (például 4-es kromoszóma). Érdekes, hogy a mennyiség a rövid tarkított nukleáris elemek (Sines) arányos volt a kromoszóma metilációs minta. Ezt valószínűleg az okozta, hogy a szinuszok jellemzően csoportosulnak gén-gazdag régiókban. Sex kromoszómák globálisan hypomethylated alacsonyabb CpG sűrűségű és nagyobb ismétlési tartalom, mint autosomes. Mivel használtuk a szöveteket venni a hím ebben a kísérletben, a globális hipometiláció az X kromoszómán megfigyelt nem társul X inaktivációs. Kromoszóma széles kilátást összefoglalt nagy CpG sűrűségű és magas metiláció körül gén gazdag (lásd fekete sávok alul) és a CGI-gazdag régiókban (lásd kék sáv tetején) (1B). Ezzel szemben az alacsony CpG sűrűségű és kis metiláció észleltek körül gén vidékeken, amelyek gazdagok hosszú távú ismétlődést (> 1 kb) (lásd a piros sávok a tetején). Az átlagos MES sugallja, hogy a metilezést szintje CGIS lényegesen magasabb, mint a patogén régiók vagy ismétlődő (1b ábra). 1. ábra metilációs mintázat normál gyomor szövetet. (A) kromoszóma kiterjedő átlagos MES látható függvényében az átlagos CpG sűrűség, Gene, sűrűség (a gének száma per Mb), LINE mennyisége (a hossza a LINE per Mb), és sinus mennyisége (a hossza szinusz per Mb) minden egyes kromoszómát. (B) kromoszóma 22, az átlagos CpG sűrűség (árnyékolt szürke), és MES (fekete görbe) kapunk 1-Mb csúszó ablakok. A pozíciók átírt gének (fekete sávok alul), CG-szigetek (kék oszlopok tetején), és a hosszú ismétlődést (> 1 kb, piros sáv a tetején) összehasonlítjuk, míg a DNS metiláció és CpG sűrűség ( van hátra). Az átlagos MES számára CGIS, gén szervek, és az ismétléseket (jobbra). (C) A terjesztési gén szervek és CGI MES (balra). Az átlagos MES promoter-asszociált és promoter független CGIS látható a jobb oldalon. (D) Az átlagos MES promoter alcsoportok alapuló létezését CGI (balra). (E) Alapvető információk a gének közötti, exon és intron régiók szerint hossz, CpG számát, és leképezett olvas (balra). A terjesztési gének közötti, exon és intron káosz a jobb oldalon látható. (F) Alapvető információk a upstream 1-kb régióban 5 'UTR exon, kódoló exon 3' UTR exon és downstream 1-kb régió hossza szerint, CpG számát, és leképezett olvas (balra). Az elosztó a MES minden elem a jobb oldalon látható.
Általában CGIS is maradnak metiláció szabad a normális szövetben. Elemezni a magas metilációs mintázat CGIS, megnéztük az átlagos MES eloszlása ​​és találtam egy kissé bimodális minta (1C). Mintegy 66% -a (11.376 /17.284) CGIS a bal csúcs átfedik promóter (1 kb által definíció). Ezzel szemben a 13% -os (1,386 /10.357) CGIS a jobb csúcs egybeesett egy promotert, ami arra utal, hogy a legtöbb promotor-asszociált CGIS metilálatlan. Ellentétben a promoterrel kapcsolatos CGIS, promóter-független CGIS nagy mértékben metilezett (1C). Bár a legtöbb CGI-pozitív promóterek nem metilezett, CGI-negatív promóterek együtt viszonylag magas metilációs szintek (1D). Azt is ellenőrzik a metilációs szintje promóterek CpG sűrűsége a fentiekben meghatározott [38] (kiegészítő fájl 3: Táblázat S4). A metilációs mintázatát promóterek fordítottan arányos a CpG sűrűség (Plusz fájl 2: Ábra S4). Másrészt, a CGI-gént tartalmazó szervek magasabb volt metilációs szinteket, mint azoknál, akik nem CGIS (1D ábra).
Ezután elemeztük metilációs dúsítási minták különböző annotált genomi elemek felfedezéséhez régiókat, amelyek preferenciálisan metilezzük. Patogén régiók foglalják el mintegy 40% -a emberi genom, de körülbelül 53% a teljes olvasás belül van ebben a régióban, a legtöbb olvasás helyezik a intronikus régió (1. táblázat). Bár jelentős hányadát metilezett fragmensek tartoznak intron régiókat, az arány a leképezett beolvassa a hossza exonok lényegesen magasabb, mint az intronok, ami arra utal, hogy a exont több magasan metilezett mint intronokat (1 E. ábra). Belül gén-asszociált régiókban a gazdagodását kódoló exonját még magasabb, mint a többi régiók korábban közölt (ábra az 1F és 2. táblázat) [39]. Ez erősen arra utal, hogy metiláció szerepet játszik a exon regulation.Table 1 humán genom normál minta információk patogén és intergenikus régió
Human Genome információ Matton normál minta Information

viszonylagos gazdagodása Ratio
Funkcionális Kategória Matton Hosszúság (bp) Matton Ratio Matton # CpG Matton Ratio Matton olvasás Matton Ratio Matton vs. hossz Matton vs. CpG Count

Genic
1,184,139,094
39.46
13,262,253
47.09
20,854,434
53.25
1.35
1.13
Exon
68,035,894
2.27
1,808,089
6.42
4,350,405
11.11
4.90
1.73
Intron
1,122,817,725
37.41
11,613,113
41.23
17,358,273
44.32
1.18
1.07
Intergenic
1,816,976,186
60.54
14,901,610
52.91
18,310,273
46.75
0.77
0.88
Human Genom katalógusa 3001115280 katalógusa 100 katalógusa 28163863 katalógusa 100 katalógusa 39164707 katalógusa 100 katalógusa 1.00 katalógusa 1.00 katalógusa 2. táblázat Az emberi genom és a normál minta információk gén jegyzetekkel ellátott régiók
Human Genome információ Matton normál minta Information

viszonylagos gazdagodása arány
Funkcionális Kategória Matton Hosszúság (bp) Matton Ratio Matton # CpG Matton Ratio Matton olvasás katalógusa
Ratio Matton vs. hossz Matton vs. CpG Count Matton Upstream 1 kb katalógusa 24468069 katalógusa 0,82 katalógusa 937748 katalógusa 3.33 katalógusa 535593 katalógusa 1,37 katalógusa 1,68 katalógusa 0.41 katalógusa 5'UTR exon
8436529
0,28 katalógusa 411563 katalógusa 1.46 katalógusa 292654 katalógusa 0.75 katalógusa 2.66 katalógusa 0.51 katalógusa kódoló exonját katalógusa 33384619 katalógusa 1.11 katalógusa 1077913
3,83 katalógusa 3448755 katalógusa 8,81 katalógusa 7,92 katalógusa 2.30 katalógusa 3'UTR exon katalógusa 28387978 katalógusa 0.95 katalógusa 378012 katalógusa 1,34 katalógusa 806832 katalógusa 2,06
2,18
1,53 katalógusa Downstream 1 kb katalógusa 23136263 katalógusa 0,77 katalógusa 340866 katalógusa 1.21 katalógusa 551071 katalógusa 1.41 katalógusa 1.83 katalógusa 1.16 katalógusa emberi genom katalógusa 3001115280 katalógusa 100 katalógusa 28163863 katalógusa 100 katalógusa 39164707 katalógusa 100 katalógusa 1.00 katalógusa 1,00 katalógusa Változások a DNS metilációs mintázat összefüggő gyomorrák katalógusa Amikor a átlagos kromoszomális MES a rák methylome összehasonlítottuk a kontroll szövet, azt találtuk, hogy az összes kromoszómák a rákos szövet jellemzően az hypomethylated (Plusz fájl 2: ábra S5). A kromoszóma-szintű nézetek, CGI-gazdag régiók találták kifejezetten hipermetiláltnak, míg ismételt gazdag régiók széles körben hypomethylated (2A ábra; Kiegészítő fájl 2. ábra: S6). Elemezni metiláció változások genetikai elem, tájoltunk minden elem elején és végén oldalakat, majd kapott átlagos MES minden egyes helyzetben. Meglepő, kimutattuk hipermetiláció az upstream régiót, különösen 500 bp upstream a transzkripciós starthely (2b ábra). Ez összhangban van a hipermetiláció promóter régiók gyakran megfigyelhető a rák. 2. ábra összehasonlítása metilációs mintázat normál és rákos szövet. (A) Átlagos MES görbe normál (fekete) és a rákos (piros) szövet kromoszóma 19 (balra). Az átlagos MES számára CGIS, gén szervek, és az ismétléseket (jobbra). (B) a DNS-metilációs gén annotált elemekkel. Minden egyes elem (upstream 1 kb, exon, intron, és a downstream 1 kb) osztjuk a 20 rekeszek és az átlagos MES kaptuk minden egyes bin az összes megfelelő elemekkel. (C) a DNS metiláció átirat vége és kódoló régiót véget ér. Az átlagos MES kapunk egy csúszó 50-BP ablak szerint a távolság a transzkriptum start (első) és vége (második) a CGI-pozitív promoterek, valamint az átirat start (harmadik) és vége (negyedik) a CGI- pozitív támogatói. (D) a DNS-metilációs teljes 5 'UTR exonok (balra) és az 5' UTR kódoló exonját (jobbra).
A régió középpontú a transzkripciós starthelyet mutatta, teljesen különböző mintákat függően a jelenléte egy CGI, ami az alacsony metilációs állapotát CGI-t tartalmazó promóterek (2C ábra). Azt is megállapította, hogy a rákos szövet, méltó hipermetiláció CGI-t tartalmazó promóterek fordul elő, és hogy a sűrűsége CpGs kulcsfontosságú a növekedés a DNS metiláció (2C ábra). Tovább elemezni, hogy az 5 'régiójában géneket hipermetiláltnak hasonlóan génpromotereket, megnéztük a metilációs mintázatát az első exon. Érdekes módon azt találtuk, hogy az első exon hipermetiláltnak csak akkor, ha ez volt az 5'-végén egy kódoló exon, de akkor nem, ha ez egy 5 'UTR exon (2D, ábra). Ezek a régiók is tartalmazott nagy CpG sűrűsége. Ezért CGIS az upstream régiók gének, a promoter és a kódoló kezdő tűnik a fő célpontjai DNS hipermetiláció a rák. Katalógusa metilációs mintázatát CpG szigetek katalógusa feltárása közötti összefüggést helyét CGIS és DNS metiláció, mi alcsoportokra CGIS elfoglalt helytől a genomban. Pontosabban, azokat minősíteni 5 '(között található 1 kb upstream és a kódoló starthely egy gén), intragenikus (intragenikus CGIS kívül az 5' végen) és intergénes (található nem-patogén régió) (Plusz fájl 1: táblázat S5). Bár CpG sűrűsége hasonló volt a három csoport között, nem 5 'CGIS (intragenikus és tergenikus CGIS) szignifikánsan gyakrabban denaturált mint 5' CGIS (Plusz fájl 2: Ábra S7). Mi képest tovább az átlagos MES alcsoportokra CGIS és megállapította, a metilációs összes CGIS általában nőtt. Ugyanakkor a relatív eltérés MES azt javasolta, hogy a változás a metiláció 5 'CGIS szignifikánsan nagyobb volt, mint a többi CGIS (3A), ami a fontos szerepet az 5' CGIS a rák. A mértéke 5 'CGI hipermetiláció szignifikánsan korrelált az átfedés a transzkripciós starthelyet (3B ábra). 3. ábra DNS metiláció CpG szigeteken. (A) relatív eltérés MES alcsoportokra CGIS. (B) közötti összefüggés eltérés CGI metilezés és a távolság a transzkripciós starthelyet. (C) közötti korreláció génexpressziós szintje és hipermetiláció CGIS. (D) metilezés-specifikus PCR-hiszton-gének mutatja a legmagasabb eltérés MES értékeket. M1 és U1 megfelelnek az HIST3H2A, míg az M2 és a U2 megfelelnek az HIST3H2B.
Feltárása funkciójának gének átesett eltérés metiláció 5'CGIS, mi kiválasztott gének erősen differenciál CGI MES (MES eltérés 1-nél). Ezután végre gén ontológia (GO) elemzés, hogy betekintést nyerjünk a felelős mechanizmusok rák (3. táblázat). Amikor a géneket csoportosulnak különféle GO kategóriákba, azt találtuk, hogy a HOX
gén klaszterek és a nukleoszóma összeszerelés kapcsolatos gén klaszterek voltak célpontjai hipermetilációt míg apoptózissal kapcsolatos gén klaszterek voltak célpontjai hipometilációt. Érdekes, hogy a megállapítás, hogy a HOX katalógusa géncsoport volt kedvezményes célokat DNS metiláció összhangban van a korábbi jelentésben [40]. Emellett gén parcellák megerősítette, hogy hipermetiláltsági volt CGI-specifikus rákos (Plusz fájl 2: Ábra S8). Megbecsülni a változások expressziós mintázat okozta hipermetiláció 5 'CGIS végeztünk funkcionális elemzését génexpressziós adatok nyert cDNS microarray kísérletek. Hipermetilációja 5 'CGIS szignifikáns korrelációt downregulációját gének (p = 0,03 katalógusa) (ábra 3C Kiegészítő fájl 3: Táblázat S6 és S7). Ez azt jelzi, hogy a hangtompító gének által metiláció lehet közvetlenül befolyásolja a mértékét CpG sűrűség és 5 'CGI hipermetiláció. Elemeztük a DNS metiláció állapotát gének hipermetiláltnak 5 'CGIS és downregulált expressziós mintázatok. Ezek között volt a kódoló gén hiszton H2B típusú 3-B (HIST3H2BB katalógusa). Elemzés HIST3H2BB katalógusa promoter metiláció alkalmazásával metiláció-specifikus PCR során kiderült, hogy a legtöbb rákos beteg (8/10, 80%) mutatott fokozott metilezés a promoter régió (ábra 3D) .table 3 Funkcionális annotáció klaszterezése gének hipermetilációja 5'CGIs
Jegyzet 1. klaszter Matton alkoholtartalom-Score: 3.27 Matton Count Matton P_Value Matton GOTERM_BP_FAT
nukleoszóma szerelvény katalógusa 11 katalógusa 3.90E-04 katalógusa GOTERM_BP_FAT katalógusa kromatin szerelvény katalógusa 11 katalógusa 5.20E-04 katalógusa GOTERM_BP_FAT katalógusa DNS-fehérje komplex építési katalógusa 11 katalógusa 7.40E-04 katalógusa Jegyzet Cluster 2 | Dúsítás Score: 2.92 katalógusa Gróf katalógusa P_Value katalógusa INTERPRO katalógusa hiszton core katalógusa 8 katalógusa 6.80E-04
SP_PIR_KEYWORDS katalógusa nukleoszóma mag katalógusa 8 katalógusa 8.60E-04 katalógusa GOTERM_CC_FAT katalógusa nukleoszóma katalógusa 8 katalógusa 3.10E-03 katalógusa Jegyzet 3. klaszter katalógusa alkoholtartalom-Score: site
17
5.10E-03
INTERPRO
Homeobox
17
5.70E-03
SP_PIR_KEYWORDS
Homeobox
17
5.80E-03
INTERPRO
Homeodomain-related
17
6.40E-03
SMART
HOX
17
1.40E-02
D4
3
9.10E-03
SP_PIR_KEYWORDS
embryo
3
3.30E-02
PIR_SUPERFAMILY
PIRSF002612:homeotic

• Felfedezni az emberi történelem gyomor baktérium
• Jelenléte S100A9-pozitív gyulladásos sejtek rákos szövetekben korrelál a korai szakaszban a rák és egy jobb prognózis betegeknél gyomorrák