Identifikatioun vun der mënschlecher gastric cancer

Identifikatioun vun DNA methylation Verännerunge mat mënschlechen gastric Kriibs
méiglech verbonne verbonne methylation Ännerungen DNA Background VerfÜgung Epigenetic Verfall vun der Gentherapie Ausdrock ass eng gemeinsam Manifestatioun zu Mënsch Kriibs. DNA methylation ass eng gutt-bekannt epigenetic Prozess, mä mat Kriibs der geneeër Natur vun epigenetic Ännerungen verbonne dër schwiereg. VerfÜgung Method VerfÜgung Mir der methylome vum Mënsch gastric Kriibs Otemschwieregkeeten um 50-BP Resolutioun Beräicherung mat engem methylated DNA profiléiert Technik (methylated CpG assay Insel Erhuelung) a Kombinatioun mat engem Nepgen Organer an engem neie normalization sind. VerfÜgung Resultater VerfÜgung Mir kënnen sech eng ëmfassend Vue vun Promoteuren ze gewannen mat verschiddenen CpG Inhaltsverzeechnes, dorënner CpG Islands (CGIen), ët Gremien, a verschidde widderhuelen Klassen. Mir hu fonnt, datt gastric Kriibs mat hypermethylation vun 5 'CGIen an der 5'-Enn vun coding exons souwéi hypomethylation vun widderhuelen Elementer verbonne war, wéi kuerz john.b nuklear Elementer an der Komposit Element SVA. Hypermethylation vun 5 'CGIen war vill mat downregulation vun verbonne Genen, wéi déi vun der HOX VerfÜgung an histone Gentherapie Famillen soll. Mir och laang-Gamme epigenetic silencing (LRES) Regiounen am gastric Kriibs Otemschwieregkeeten entdeckt an identifizéiert puer hypermethylated Genen (MDM2 VerfÜgung, DYRK2 VerfÜgung, an LYZ VerfÜgung) an dëse Regiounen. D'methylation Status vun CGIen an der Gentherapie Annotation Elementer an metastatic lymph Wirbelen war Tëscherapport tëscht normal a kriibserreegend Otemschwieregkeeten, wat beweist, datt methylation vun spezifesch Genen lues zu kriibserreegend Otemschwieregkeeten fräi ass. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung Eis Conclusiounen ginn wäertvoll Daten fir Zukunft Analyse déi vun CpG methylation zeréckzeféieren, nëtzlech ze lues fir d'Diagnos vun Mo. Kriibs, souwéi eng nei Analyse Method fir Medeziner epigenomics Ënnersich. VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs ass den zweete Spëtzekandidat Ursaach vum Kriibs weltwäit no haett Kriibs Doudesfäll, déi zu méi wéi 800.000 Doudesfäll weltwäit all Joer [1]. Déi aktuell 5-Joer Iwwerliewe Taux vu Persounen mat gastric Kriibs diagnostizéiert gëtt nëmmen 20-30%, mat dësen niddregen Taux un der Tatsaach, zum Deel, datt meeschte Fäll si schons zu Diplôme Etapp wou diagnostizéiert. Wéi an all Cancers, bleift fréi ze erkennen der villverspriechendst Approche fir d'Iwwerliewe Tarif ze verbesseren. Dohier, am Mënsch gastric Otemschwieregkeeten d'Cause vun tumorigenesis Versteesdemech ass essentiel. VerfÜgung Wonn mat H. pylori VerfÜgung ass eng gutt etabléiert a gemeinsam Ursaach vun gastric Kriibs. Mä si hire Restaurant zu verschiddenen genetesch Faktoren och wichteg an gastric Kriibs Risiko waarden. Et ass bekannt, datt chromosomal Onstabilitéit vun genetesch Facteure wéi microsatellite Onstabilitéit ursprünglech souwéi KRAS VerfÜgung an p53 Resultat VerfÜgung Projet'en an d'Entwécklung vun erhéijen. Puer Frankräich studéiert hunn germline kennen spezifesch Genen identifizéiert [2-4] a Krankheet Rief loci [5, 6] fir gastric Kriibs. Rezent Studien gastric Kriibs an normal Otemschwieregkeeten vergläichen hunn eng Zuel vun genetesch lues, dorënner diagnostic lues identifizéiert [NF2 VerfÜgung [7], INHBA VerfÜgung [8], SFRP4 VerfÜgung [9]], prognostic lues [CD9
[10], CDH17 VerfÜgung [11], PDCD6 VerfÜgung [12]], an gastric Kriibs-verbonne Genen [MUC13 VerfÜgung [9], CLDN1 VerfÜgung [13], Ki67 VerfÜgung an CD34 VerfÜgung [14]]. Ausserdeem hunn epigenetic Mechanismen wéi DNA methylation an histone Ännerunge fonnt goufen an der Biologie an Krankheet vun der gastrointestinal TRACT [15]. VerfÜgung DNA methylation spillt eng wesentlech Roll an eukaryotes Équipe an Regulatioun dem Wëllen vun Genen wichteg ze ginn an ass mat enger Rei vu wichtege Mechanismen dorënner Frankräich imprinting, X chromosome inactivation, Alterungsprozess, an carcinogenesis assoziéiert. Verfall vun DNA methylation an der Nepgen ass an bal all Zorte vu Kriibs fonnt a kann zu Ännerungen an der Gentherapie Ausdrock, wéi iwwer-Ausdrock vun oncogenes an silencing vun entholl suppressor Genen während Kriibs Entwécklung [16] Féierung. Puer Studien hunn, datt Heefung vun genetesch a epigenetic hire Restaurant zu gastric precancerous lesions dës enger grousser Zuel vun Ziler Afloss kann, wéi DNA Reparatur System ëmgestallt, entholl suppressors, oncogenes, Zell Zyklus Reglementatioun, Wuesstem Faktoren, an Haftung Molekülle [17-20] . Allerdéngs goufen dës Studien haaptsächlech op e puer Kandidat Genen do oder nëmmen en Deel vun der ganzer Nepgen iwwerzunn. Sou, mat Kriibs Entwécklung eng global Visioun vun der epigenetic Ännerungen Accès assoziéiert ass schwiereg ginn. Besonnesch, Versteesdemech DNA methylation Ännerungen am intragenic Regiounen, CpG Inselen, intergenic Regiounen, an widerhuelen Message bleift limitéiert. Demno, et ass super Interessi Nepgen-breet Analys vun aberrant DNA methylation an dëse Regiounen. VerfÜgung Fir ëmfaassend Nepgen-Skala profiling vun DNA methylation zu embryogenesis an carcinogenesis, héich-Resolutioun ganz Nepgen sequencing Methode wéi BS-weider [21 -24], MeDIP-weider [25, 26], an MethylCap-weider [27-29] entwéckelt goufen. Trotz der rapid Entwécklung vun sequencing-baséiert androën Technologie, ass et nach e Manktem vun Komparativ Fuerschung, déi fir de Medeziner epigenomics Studien kritesch ass, inklusiv déi iwwert Kriibs konzentréiert. Anescht microarray-baséiert Approche, sequencing Donnéeë sinn an engem Format produzéiert dat net atomar ass Analyse ze Ënnerscheed, an der Analyse fort fun der Strooss standardiséierte net gouf. Dofir, computationally präiswäert normalization Methoden néideg sinn der computational Belaaschtung vun Veraarbechtung grouss-Gréisst, héich-Resolutioun sequencing Donnéeën ze verschaffen. VerfÜgung Hei, agefouert mir eng normalization sind, déi de Prouf-spezifesch total liesen Dicht Rechnung hëlt, déi raimlech Verdeelung vun CpG loci, an Hannergrond sequencing Westen. Mir hunn dann eng ëmfaassend ganzt-Nepgen methylome vun normal gastric Otemschwieregkeeten, gastric Kriibs Otemschwieregkeeten, an metastatic lymph Wirbelen der MethylCap-weider Method benotzt a kritt detailléiert Informatiounen iwwert seng perturbation während carcinogenesis an Metastasen. Dëst ass erhale eventuell zu engem Komparativ Analyse vun methylomes an aner Zorte vun epigenomic Daten, an dat ass besonnesch Implikatioune fir Medeziner epigenomics. VerfÜgung Method Gastric Otemschwieregkeeten Echantillon
Mir kritt dräi virgezunnen-gefruer gastric erhéijen an stemmt normal gastric Otemschwieregkeeten vun Seoul National University College vun Medezin fir methylome studéieren. Ausserdeem, zwanzeg-aacht reagéiert Puer normal an entholl Mo. Stoffer sech fir weider Bestätegung kritt. All Echantillon sech duerch Bild resection während Ënnersichung vun de Patienten kritt deen Accord informéiert huet VerfÜgung Methylated DNA Erhuelung assay (MIRA) VerfÜgung Frankräich DNA aus 25 mg vun gastric Otemschwieregkeeten war stilvoller vun DNeasy Blood &benotzt. Ray Kit (QIAGEN, Valencia, CA). Frankräich DNA Echantillon vun 3 Persounen waren am selwechten Konzentratioun hinzeginn. MIRA war wéi virdru beschriwwen duerchgefouert [30-32]. Kuerz,-GST afp MBD2b a sech Seng-afp MBD3L1 Proteinen ëmschriwwen virbereet. 15 ug vu Frankräich DNA war bis 100 ~ 500 BP vun sonication fragmentaresch a mat 28 ug vun sidd GST-MBD2b FAQ, 28. ug vun Seng-MBD3L1 FAQ a 7 ug vun JM110 bakteriell DNA fir 6 Stonnen incubated. 30 ech vun MagneGST Glaspärelen (Promega, Madison, allem) preblocked mat 7 ug vun JM110 bakteriell RNS bäigebaut an op 4 ° C incubated mat an final 600 ech vun MIRA bindend Reaktioun Mëschung fir 45 Minutten rotativ. Glaspärelen waren dräi mol mat 1 ml vun wäschen gefiermt gewäsch, an methylated Fragmenter fir 5 Minutten vun incubation um RT eluted goufen an dann 56 ° C fir 30 Minutten mat 30 ech vun TE wouvun RNase A (100 ug, QIAGEN) an Proteinase K ( 15 ug, QIAGEN). Eluted DNA Fragmenter waren sidd weider duerch Qiaquick Hinnen alleguer Offäll Trikoten benotzt (QIAGEN). VerfÜgung Illumina Genom Organer sequencing VerfÜgung Mir benotzt 10 NG vun eluted DNA fir Illumina Genom Organer sequencing. No ligation vun engem Pair vu Solexa adapters, ligation Produite mat de Maximum Neiegkeet Gréisst vun 200 BP sech gelies op 2% agarose sidd an zu Hinnen alleguer amplification ënnerworf. Stärekoup Generatioun an 36 Zykle vun sequencing sech folgend Fabrikant d'Instruktioune gesuergt. Mir Nepgen 120 ech vun adapter-Jonglenster, Gréisst-fractionated DNA (2 ~ 4 Auer) op der Illumina Genom Organer. Haaptrei Tags sech un de Mënsch Nepgen (UCSC hg18 Datebank op NCBI Build 36,1 Versammlungs- baséiert) mat der Solexa Analys Pipelineaarbechter (Versioun 0.3.0) Ëmgéigend. Nepgen liest vun 34 BP (ausser déi éischt an déi lescht Nukleotid) dass Qualitéit batter Kontroll Filter benotzt goufen. VerfÜgung Data Veraarbechtung an MES Berechnung VerfÜgung Mir der 3 'Enn vun der vun 200 BP liest 34-BP verlängert DNA ze decken vun der MBD Proteinen gebonnen Fragmenter. D'readout war zu Browser extensible Donnéeën (Bett) Fichieren fir visualization am http Nepgen Browser UCSC ëmgerechent:. //Nepgen ucsc hat /.. Mir gezielt phpNuke Haaptrei Tags um 50 BP Opléisung. Fir beräichert Frankräich Regiounen fannen, vun der Zuel Ëmgéigend liest an eng hëlze Fënster vun 1 KB war den Total Verglach vun liest oder den Hannergrond Zuel vun liest am Nepgen. Well esou, war MES zu zwee Weeër berechent; eent ass den log2 vu (Zil- liesen Grof /Zil- Gréisst) /(total liesen Grof /Nepgen Gréisst) an zu null Stäck, déi aner wéi der log2 vu (Zil- liesen Grof /Zil- Gréisst) ass /(Hannergrond liesen Grof /Hannergrond Gréisst) a bis null Stäck. Ze ajustéieren, fir de Westen Hannergrond sequencing, war MESbg an der selwechter Manéier fir Input sequencing berechent ouni Bezuch Offäll an subtracted vum MES. VerfÜgung Frankräich Positioune vun CGIen, Promoteuren, ët Kierper, CDSs, an repetitive Elementer VerfÜgung All Frankräich Positioune vun CGIen, gët an widderhuelen Elementer goufen aus der UCSC Nepgen Browser erofgeluede. A Ganzen 27.639 CGIen (ausser CGIen zoufälleg wellkomm) vun de folgende Critèrë virausgesot huet: GC Inhalt vun 50% oder méi, Längt méi wéi 200 BP, an Verhältnis méi wéi 0.6 vun observéiert Zuel vun CpG dinucleotides fir d'erwaart Zuel [33] . D'NCBI mRNA Referenzmaterial Message Kollektioun (RefSeq aus release Versioun 46; 11 Mäerz 2011) war fir Erkenntnesser Transkriptiouns Unitéiten mat definéiert Transkriptiouns ufänken, Enn Siten an Disken Ufank benotzt, Enn Siten. Fir Promoteuren, déi mir der Regioun 500 BP Offloss ~ 500 BP afgerappt vun der Transkriptiouns Start Site. Mir kritt ~ 5 Milliounen widderhuelen Plazen déi vun der RepeatMasker Programm sech schonn déi baséiert op der RepBase Bibliothéik vun Widerhuelung. VerfÜgung Methylation Niveau vun Frankräich Elementer VerfÜgung D'methylation Niveau vun engem CGI, Promoteur, Gentherapie-Kierper, an widerhuelen Element phpNuke all Element huet mat Hëllef vun MES geschat. MES = 0 gouf benotzt unmethylated Elementer ze definéieren. Fir hypermethylation oder hypomethylation zu Kriibs Moossnam, mir den Ënnerscheed Mess als (- Normal MES Cancer MES) berechent. Ënnerscheed MES > 1.0 war als loung benotzt. Fir d'Funktioun vun ausgewielt Genen verstoen, déi mir der Ontologie Klassifikatioun vun Genen duerch den DAVID Fonctionnement Annotation Käre Outil http:.... //David abcc ncifcrf Gov /VerfÜgung Gene Ausdrock Analyse VerfÜgung D' microarray Produit an dëser Etude benotzt gouf Codelink Mënscherechter Lait Genom 55 K Chip (GE Gesondheetswiesen, USA). All experimentell Prozeduren dorënner Crna Zil- Virbereedung, hybridization, post-hybridization Hoerfaarw Kopplung goufen benotzt Verkeefer recommandéiert Ëmwelt- gesuergt. D'Resultat Fichieren waren an GeneSpring GX importéiert 7.3 (Agilent Technologies, USA) fir Filter an elementar statistesch Analyse. Dorënner 55 K Genen op d'microarray, nëmmen d'Genen mat dobäi Fändelen an op d'mannst 50% vun Echantillon waren fir spéider Analyse ausgewielt. D'microarray Date goufen um Geo http Datum:.. //Www ncbi nlm nih Gov /Geo /(Bäitrëtt Zuel GSE33651) VerfÜgung MIRA an real-Zäit qPCR VerfÜgung MIRA... war op véier zousätzlech eenzelne Echantillon gesuergt. DNA war vun der supernatant sidd an iwwerwaacht déi real-Zäit qPCR Roche 480 Maschinn benotzen. De Message vun benotzt primers sinn zu Weider Fichier virgestallt 1:. Table S1 VerfÜgung Bisulfite Behandlung, methylation-spezifesch Hinnen alleguer an pyrosequencing VerfÜgung Mir der Frankräich DNA aus eenzelne Prouf isoléiert vun engem QIAGEN DNeasy Ray Kit (QIAGEN) benotzt. Bisulfite Traitement war d'EZ DNA methylation Gold Kit mat gemaacht (Zymo Fuerschung) no der Taktik vum Produzent. Bisulfite-behandelt DNA war bei -80 ° C bis weider benotzt ginn. D'primers fir MSP benotzt goufen benotzt Methprimer [34] entworf, a sinn am Weider Fichier 1 gewisen: Table S1. Hinnen alleguer war mat HotStarTaq Polymerase (QIAGEN) gesuergt an och eng éischte incubation bei 95 ° C fir 15 min, gefollegt vun 40 Zykle vun 95 ° C fir 1 min, 59 ° C fir 1 min an 72 ° C fir 40 sec, gefollegt vun een Zyklus vun 72 ° C fir 10 Minutten. MSP Produiten waren op 2% agarose gels getrennt a vun ETBR staining visualized. D'pyrosequencing Reaktioune sech automatesch mat engem PSQ 96 System (Pyrosequencing AB) laut den Hiersteller d'Instruktioune gesuergt. Kuerz, war d'biotinylated Hinnen alleguer Produit (50 ech) mat streptavidin-sepharose Glaspärelen (Amersham Biosciences) sidd. D'sidd Produit gouf an der reagent Patroun mat der Aktivitéit, Realitéiten an dNTP am PSQ96 SNP Reagent Kit (Pyrosequencing AB) abegraff iwwerlaascht. D'sequencing primers fir pyrosequencing sinn zu Weider Fichier dës 1:. Table S1 VerfÜgung Resultater VerfÜgung Processing vun MIRA-weider methylome Donnéeën VerfÜgung Mir der methylated DNA duerch MIRA (methylated CpG Insel Erhuelung assay) beräichert sidd an Nepgen der DNA nächste-Generatioun sequencing benotzt. DNA methylation Niveauen huet sech sequencing zielt vun de jeeweilegen Regiounen liesen benotzt, um 50 BP gebotzt, wéi ënner Method beschriwwen. Mir hunn DNA methylation Kaarten fir béid normal an kriibserreegend gastric Stoffer. Fir all Prouf, dèi mir iwwer 10 Millioune leien liest (Zousätzleche Fichier 1: Table S2). All methylome enthale ~ 140 Milliounen CpG liest, Eechenholz ~ 48% vun all Frankräich CpG Siten centromeres Smartphone (Zousätzleche Fichier 1: Table S3). D'Moyenne Deckung vun CpG liest an all methylome 4.5X war. An Ënnerstëtzung vun der héich Empfindlechkeet vun MIRA, wouvun Frankräich Segmenter nëmmen ee CpG haten héich liesen zielt wéi déi mat kee CpG (p VerfÜgung Wäert = 0) suggeréiert datt MIRA Single CpG Ännerungen geléist kéint benotzen. Der Moyenne leien liest am Undeel un der Zuel vun CpGs bannent engem 50-BP nolauschterer fräi, an am fong, MIRA duerginn war net héich, och fir Regioune vun niddereg CpG Dicht (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S1). Geholl zesummen, weisen dës Resultater datt MIRA Erfolleg war e genuch Ëmwandlung vun methylated Regiounen an Autonomie. Wéi fir d'Richtegkeet vun MIRA, ~ 99% vun MIRA-ageholl Fragmenter haten op d'mannst ee CpG Site bannent hir leien, eng niddereg falsch erkennen Taux besot. VerfÜgung Fir Beräicherung vun lokal methylation Signaler Moossnam, mir methylation Beräicherung Fändelen berechent (Mess ) vun engem liesen zielen zu enger bestëmmter Regioun Maîtrise an dann normalization fir de ganzen liesen zielen (MESt) an d'Prouf (global normalization) oder déi lokal liesen zielen (MESl) zu engem User-definéiert ronderëm Regioun (lokal normalization zu Kontroll leeschtungsfäeg) (kuckt Method). Dëst erméiglecht engem direkte Verglach vun onofhängege Echantillon mat verschiddene liesen Dicht. Mir duerchgefouert dann eng Mooss Transformatioun vun der ofgeleet stoung eraus. Laanscht aner mathematesch Notzen mat mussen, gëtt dëst am Virdeel vun Varianz Stabiliséierung, besonnesch fir héich liesen zielt, deen oft mat héich techneschen Variatioune zesummen sinn déi bedeitendst de Westen an d'Donnéeë aféieren kann. VerfÜgung Mir statistesch Bedeitung vun den MES évaluéieren an zwee Weeër. Zoufälleg Mess sech duerch permuting der Frankräich Positiounen vun eiser Haaptrei liest numerically entsteet. Den Hannergrond MES (MESbg) war vun sequencing déi normal Nepgen ouni Bezuch Offäll experimentally kritt. Wéi erwaart, Kriseperiod, d'real Donnéeën Ofstand héich Beräicherung Fändelen (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S2). Gëlt, war MESbg héich wéi MES aus zoufälleg genomes, eng Indikatioun datt dësen Hannergrond Message Beräicherung schafe kann, wahrscheinlech wéinst chromatin Accessibilitéit a amplification Westen. Konsequent mat rezent Rapporten [35], weist, dat déi néideg fir eng adequat Eechung fir Onfruchtbarkeet sequencing Westen. Dofir, mir eise MES mat MESbg normalized. VerfÜgung Fir d'optimal Konditioun fir normalization fannen, am Verglach mir d'Statistik fitness vun verschiddenen normalization Methoden. Tag Verdeelung laanscht de Nepgen kënnt vun der Poisson Verdeelung Virbild ginn [36, 37]. D'Gemengeconsellje vun fit war mat der Kolmogorov-Smirnov Test getest. An dësem Test, beweist eng niddreg D iwwerleen eng gutt fit. Während der Poisson Model der Gaussian globale outperformed, huet den MES eng besser fit wéi Matière liesen zielt (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S3), de rare event Natur vun der Läschlëscht--och liesen Grof Moossnam z. D'normalized MESl zur Kontroll sequencing z'erreechen (MESbg) Kriseperiod esouguer besser Resultater wéi normalized MESt zur Kontroll sequencing z'erreechen (MESbg). VerfÜgung Global an chromosomal Meenung vun DNA methylation VerfÜgung Nom bescht Method fir ukomm Nepgen-grouss methylation Niveauen confirméiert um 50-BP Intervalle, iwwerpréift mir éischter der chromosomal methylation Musteren vun normal Echantillon. D'Moyenne MES fir all chromosome berechent gëtt ugeholl, datt CpG-räich a Gentherapie-räiche chromosomes tendéiert duerchaus methylated (Dorënner 1A) ze ginn. D'methylation Niveau vun chromosomes mat grousse Quantitéiten vun laang john.b nuklear Elementer (Linnen) waren relativ niddreg (e.g., chromosome 4). Spannen, war d'Quantitéit vu kuerz john.b nuklear Elementer (SINEs) proportional zu der chromosome methylation Muster. Dat ass wahrscheinlech déi vun der Tatsaach ëmmer dass SINEs si generell an der Gentherapie-räiche Regiounen op der Strooss. Sex chromosomes sech weltwäit mat manner CpG Dicht an héich widderhuelen Inhalt wéi autosomes hypomethylated. Well mir Stoffer aus engem männlech an dësem Experiment geholl ginn, observéiert d'global hypomethylation vun der X chromosome ass net mat X inactivation assoziéiert. Chromosome-breet Meenung recapitulated héich CpG Dicht an héich methylation ronderëm Gentherapie-räich (gesinn schwaarz Baren ënnen) an CGI-räiche Regiounen (kuckt blo Baren uewen) (Dorënner 1B). Am Géigesaz, huet niddereg CpG Dicht an niddreg methylation ronderëm Gentherapie-aarm Regiounen observéiert datt am laangen-Gamme Widerhuelung räich waren (> 1 KB) (kuckt rout Baren uewen). D'Moyenne MES hindeit, datt d'methylation Niveau vun CGIen ass vill méi héich wéi déi vun genic Regiounen oder Widerhuelung (Dorënner 1B). Figur 1 Methylation Musteren vun normal gastric Otemschwieregkeeten. (A) Chromosome-grouss Duerchschnëtt MES ass wéi eng Funktioun vun der Moyenne CpG Dicht, Gentherapie Dicht (d'Zuel vun Genen pro Mo), LINN Quantitéit (d'Längt vun LINN pro Mo), an SINE Quantitéit (d'Längt vun SINE dës pro Mo) fir all chromosome. (B) Fir chromosome 22, der Moyenne CpG Dicht (Festung gro) an MES (schwaarz Linn) waren an 1-Mo hëlze Fënsteren kritt. D'Positioune vun ausserdeem Genen (schwaarz Baren ënnen), CG Inselen (blo Baren uewen), a laang Widerhuelung (> 1 KB; rout Baren op uewen) sinn Verglach géint d'Kuliss vun DNA methylation an CpG Dicht ( lénks). D'Moyenne MES fir CGIen, Gentherapie Gremien, a Widerhuelung (riets). (C) D'Verdeelung vun der Gentherapie Kierper an CGI MES (lénks). D'Moyenne MES fir Promoteur-assoziéiert an Promoteur-onofhängeg CGIen ass zu Recht gewisen. (D) D'Moyenne MES fir Promoteur subgroups, baséiert op der Existenz vun CGI (lénks). (E) Grondakommes Informatiounen iwwert intergenic, exonic, an intronic Regiounen, no laangen, CpG Zuel, an Ëmgéigend liest (lénks). D'Verdeelung vun intergenic, exonic, an intronic Mess ass zu Recht gewisen. (F) Grondakommes Informatiounen iwwert d'Offloss 1-KB Regioun, 5 'UTR exons, coding exons, 3' UTR exons, an afgerappt 1-KB Regioun no Längt, CpG Zuel, an Ëmgéigend liest (lénks). D'Verdeelung vun den MES fir all Element fir d'Recht dës Distanz ass. VerfÜgung Generell, éischter CGIen methylation gratis an normal Otemschwieregkeeten ze bleiwen. Fir d'héich methylation Musteren vun CGIen analyséieren, vergewësseren mir der Moyenne MES Verdeelung a fonnt e bësse bimodal Muster (Dorënner 1c). Iwwer 66% (11,376 /17,284) vun CGIen an der lénker Héichpunkt overlapped mat engem Promoteur (1 KB vun eis Definitioun). Am Géigesaz, 13% (1,386 /10,357) vun CGIen am Recht Héichpunkt overlapped mat engem Promoteur, proposéiert, datt déi meescht Promoteur-verbonne CGIen unmethylated sinn. Am Géigesaz zu Promoteur-Zesummenhang CGIen, Promoteur-onofhängeg CGIen sech kräfteg methylated (Dorënner 1c). Obwuel déi CGI-positiv Promoteuren net methylated waren, CGI-negativ Promoteuren awer relativ héich methylation Niveauen (Dorënner 1D). Mir kontrolléieren och déi methylation Niveau vun Promoteuren vun CpG Dicht wéi virdrun definéiert [38] (Zousätzleche Fichier 3: Table S4). D'methylation Muster vun Promoteuren war inversely zu CpG Dicht dinn (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S4). Wéinst dem CGI-haltege Gentherapie Kierper hu héich methylation Niveau wéi déi ouni CGIen (Dorënner 1D). VerfÜgung Next, mir methylation Beräicherung Musteren op verschiddene forcéiert Frankräich Elementer analyséiert Regiounen ze wëssen dass zéien methylated goufen. Genic Regiounen gelant ronn 40% vun der Mënschheet Nepgen, mä iwwer 53% vun de gesamten liest ass bannent dëser Regioun, mat der Majoritéit vun liest am intronic Regioun (Table 1) etabléiert gëtt. Obwuel e wichtegen Deel vun methylated Fragmenter bannent intronic Regiounen falen, ass d'Verhältnis vun der Ëmgéigend liest fir d'Längt vun exons däitlech méi héich, wéi dat fir introns suggeréiert, dass exons méi héich methylated sinn wéi introns (Dorënner 1E). An der Gentherapie-verbonne Regiounen, ass de Räichtum vun coding exons souguer méi héich wéi déi vun anere Regioune wéi virdrun erwähnt (Dorënner 1F an Table 2) [39]. Dëst deit drophin staark dass methylation eng Roll an Exon regulation.Table 1 Mënscherechter Nepgen a normal Prouf Informatiounen vun genic an intergenic Regioun spillt VerfÜgung Mënscherechter Genom Informatiounen
normal Sample Informatiounen rel Beräicherung Verhältnis
Fonctionnement Kategorie
Längt (BP)

Verhältnis
# vun CpG
Verhältnis
liest
Verhältnis
vs. Längt
vs. CpG Count

Genic
1,184,139,094
39.46
13,262,253
47.09
20,854,434
53.25
1.35
1.13
Exon
68,035,894
2.27
1,808,089
6.42
4,350,405
11.11
4.90
1.73
Intron
1,122,817,725
37.41
11,613,113
41.23
17,358,273
44.32
1.18
1.07
Intergenic
1,816,976,186
60.54
14,901,610
52.91
18,310,273
46.75
0.77
0.88
Human Nepgen VerfÜgung 3.001.115.280 VerfÜgung 100 VerfÜgung 28.163.863 VerfÜgung 100 VerfÜgung 39.164.707 VerfÜgung 100 VerfÜgung 1.00 bis 1.00 VerfÜgung Table 2 Mënscherechter Nepgen a normal Prouf Informatiounen vun der Gentherapie forcéiert Regiounen
Mënscherechter Genom Informatiounen
Normal Sample Informatiounen VerfÜgung rel Beräicherung Verhältnis zur VerfÜgung
Fonctionnement Kategorie
Längt (BP)
Verhältnis
# vun CpG
Verhältnis
liest VerfÜgung VerfÜgung Verhältnis
vs. Längt
vs. CpG Grof
Offloss 1 KB VerfÜgung 24.468.069 VerfÜgung 0,82 VerfÜgung 937.748 VerfÜgung 3,33 VerfÜgung 535.593 VerfÜgung 1,37 VerfÜgung 1,68 VerfÜgung 0,41 VerfÜgung 5'UTR Exons VerfÜgung 8.436.529 VerfÜgung 0,28 VerfÜgung 411.563 VerfÜgung 1,46 VerfÜgung 292.654 VerfÜgung 0,75 VerfÜgung 2,66 VerfÜgung 0,51 VerfÜgung Coding Exons VerfÜgung 33.384.619 VerfÜgung 1,11 VerfÜgung 1.077.913
3,83 VerfÜgung 3.448.755 VerfÜgung 8,81 VerfÜgung 7,92 VerfÜgung 2,30 VerfÜgung 3'UTR Exons VerfÜgung 28.387.978 VerfÜgung 0,95 VerfÜgung 378.012 VerfÜgung 1.34 VerfÜgung 806.832 VerfÜgung 2,06 VerfÜgung 2,18 VerfÜgung 1,53 VerfÜgung afgerappt 1 kB VerfÜgung 23.136.263 VerfÜgung 0.77 VerfÜgung 340.866 VerfÜgung 1,21 VerfÜgung 551.071 VerfÜgung 1.41 VerfÜgung 1,83 VerfÜgung 1.16 VerfÜgung Mënscherechter Nepgen VerfÜgung 3.001.115.280 VerfÜgung 100 VerfÜgung 28.163.863 VerfÜgung 100 VerfÜgung 39.164.707 VerfÜgung 100 VerfÜgung 1.00 bis 1.00 VerfÜgung Neierung an DNA methylation Musteren verbonne mat gastric Kriibs VerfÜgung Wann der duerchschnëttleche chromosomal MES vun de Kriibs methylome war am Verglach zu där vun Kontroll Otemschwieregkeeten, fonnt mir dass all chromosomes an der Kriibsfuerschung Otemschwieregkeeten gin hypomethylated Lien (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S5). Mat chromosome-breet Meenung, CGI-räich Géigende fonnt speziell hypermethylated ze ginn, iwwerdeems widderhuelen-räiche Regioune waren dicht hypomethylated (Dorënner 2A; Weider Fichier 2: Dorënner S6). Fir methylation Ännerungen am Frankräich Elementer analyséieren, bilden mir all Element um Ufank an um Enn Siten a kritt dann d'Moyenne MES bei all respektiven Positioun. Contreras, nogewise mir hypermethylation an der Offloss Regioun, besonnesch aus 500 BP Offloss zu der Transkriptiouns Start Site (Dorënner 2B). Dëst ass am Aklang mat der hypermethylation vum Promoteur Regiounen dacks zu Kriibs observéiert. Figur 2 Se methylation Musteren an normal an kriibserreegend Otemschwieregkeeten. (A) Duerchschnëttlech MES rop fir normal (schwaarz) an kriibserreegend (rout) Otemschwieregkeeten zu chromosome 19 (lénks). D'Moyenne MES fir CGIen, Gentherapie Gremien, a Widerhuelung (riets). (B) DNA methylation vun der Gentherapie Elementer forcéiert. All Element (Offloss 1 KB, Exon, intron, an afgerappt 1 KB) waren an 20 Poubellen Eruewerungspolitik an der Moyenne MES war fir all bin vun all entspriechend Elementer kritt. (C) DNA methylation um ët goung an Regioun goung coding. D'Moyenne MES war an enger hëlze 50-BP Fënster no hirer Distanz vum beim Start (éischten) an zum Schluss (zweeter) fir CGI-positiv Promoteuren souwéi d'beim Start (drëtte) an zum Schluss (véiert) fir CGI- kritt positiv Promoteuren. (D) DNA methylation vun insgesamt 5 'UTR exons (lénks) an 5 "UTR coding exons (riets). VerfÜgung D'Regioun am Transkriptiouns Start Site läit awer komplett verschidden Musteren je op d'Präsenz vun engem CGI, bidden de niddereg methylation Status vun CGI-haltege Promoteuren (Dorënner 2C). Mir hunn och, datt, an kriibserreegend Otemschwieregkeeten, bemierkenswäert hypermethylation vun CGI-haltege Promoteuren existeiert an datt d'Dicht vun CpGs ass wichteg fir d'Erhéijung vun DNA methylation (Dorënner 2C). Fir weider ob Regioune vun Genen '5 analyséieren waren ähnlech an der Gentherapie Promoteuren hypermethylated, vergewësseren mir de methylation Muster vun den éischte exons. Spannen, hunn mir déi éischt Exon nëmmen hypermethylated war wann et der 5'-Enn vun engem coding Exon war, mä net wann et engem 5 'war UTR Exon (Dorënner 2D). Dës Géigende Texter och héich CpG Dicht. Dofir, CGIen um Offloss Regioune vun Genen, de Promoteur, an der coding Start schéngen déi grouss Ziler vun DNA hypermethylation zu Kriibs ze ginn. VerfÜgung Methylation Muster vun CpG Inselen VerfÜgung Fir d'Korrelatioun tëscht der Lag vun CGIen Entdeckung an DNA methylation, subgrouped mir CGIen no hirer Positioun am Nepgen. Speziell, huet si als 5 "(matzen tëschent 1 KB Offloss an der coding Start Site vun engem Gene), intragenic (intragenic CGIen ausserhalb der 5" kategoriséiert Enn), an intergenic (matzen an Net-genic Regioun) (Zousätzleche Fichier 1: Table S5). Obwuel CpG Dicht ënnert der dräi Gruppen ähnlech war, Net-5 'CGIen (intragenic an intergenic CGIen) huet däitlech méi methylated wéi 5' CGIen (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S7). Mir Verglach weider der Moyenne MES vun subgrouped CGIen an fonnt der methylation vun all CGIen normalerweis fräi war. Allerdéngs, proposéiert d'famill Ënnerscheed MES datt de Changement an methylation zu 5 'CGIen wéi déi vill méi grouss war fir aner CGIen (Dorënner 3A), déi wichteg Roll vun 5 bidden "CGIen zu Kriibs. D'Ausmooss vun de 5 "CGI hypermethylation vill mat der iwwerlageren vun der Transkriptiouns Start Site (Dorënner 3B) soll. Figur 3 DNA methylation vun CpG Inselen. (A) famill Ënnerscheed MES vun subgrouped CGIen. (B) Korrelatioun tëscht Ënnerscheed CGI methylation an Distanz zu der Transkriptiouns Start Site. (C) Korrelatioun tëscht Gentherapie Ausdrock Niveau an der hypermethylation vun CGIen. (D) Methylation-spezifesch Hinnen alleguer vun histone Genen der héchster Ënnerscheed MES Wäerter weist. . M1 an U1 zu HIST3H2A entspriechen, iwwerdeems M2 an U2 zu HIST3H2B sëlwecht VerfÜgung Fir d'Funktioune vun Genen amgaang Ënnerscheed methylation um 5 'CGIen beschen, mir Genen mat héich Ënnerscheed CGI Mess ausgewielt (Ënnerscheed MES > 1). Mir standing dann Gentherapie Ontologie (BEI) Analyse Abléck an d'Mechanisme vun Kriibs responsabel ze gewannen (Table 3). Wann de Genen an verschiddenen GO Kategorien op der Strooss waren, hu mir dat HOX VerfÜgung Gentherapie Stärekéip an nucleosome Montage-Zesummenhang Gentherapie Stärekéip Ziler fir hypermethylation waren, iwwerdeems apoptosis-Zesummenhang Gentherapie Stärekéip Ziler fir hypomethylation goufen. Spannen, eise fannen dass HOX VerfÜgung Gentherapie Stärekéip privilegiéierten Ziler fir DNA methylation sech ass konsequent mat enger viregter gemellt [40]. Zousätzlech, confirméiert Gentherapie Diagrammen, déi hypermethylation war CGI-spezifesch zu Kriibs (Zousätzleche Fichier 2: Dorënner S8). Fir d'Ännerungen am Ausdrock Musteren déitlech hypermethylation vun 5 'CGIen schätzen, standing mir eng funktionell Analyse vun der Gentherapie Ausdrock Donnéeë kritt aus cDNA microarray Experimenter. Hypermethylation vun 5 'CGIen war vill mat downregulation vun Genen (p VerfÜgung = 0,03) (;: Table S6 an S7 Weider Fichier 3 Dorënner 3C) soll. Dat bedeit, datt vun Genen vun methylation silencing kann direkt duerch den Ofschloss vun CpG Dicht a 5 'CGI hypermethylation betraff sinn. Mir analyséieren déi DNA methylation Status vun Genen mat hypermethylated 5 'CGIen an downregulated Ausdrock zeréckzeféieren. Dorënner war de Gene Zeechesaatz histone H2B Typ 3-B (HIST3H2BB VerfÜgung). Analyse vun HIST3H2BB VerfÜgung Promoteur methylation methylation-spezifesch Hinnen alleguer mat opgedeckt, datt déi meescht Kriibs Patienten (8/10, 80%) fräi methylation an de Promoteur Regioun (Dorënner 3D) Schatzkummer .Table 3 Fonctionnement Annotation Käre vun Genen mat hypermethylated 5'CGIs VerfÜgung Annotation Koup 1
Beräicherung Punktzuel: 3,27
Grof
P_Value
GOTERM_BP_FAT
nucleosome Versammlungs- VerfÜgung 11 VerfÜgung 3.90E-04 VerfÜgung GOTERM_BP_FAT VerfÜgung chromatin Versammlungs- VerfÜgung 11 VerfÜgung 5.20E-04 VerfÜgung GOTERM_BP_FAT VerfÜgung FAQ-DNA komplex Versammlungs- VerfÜgung 11 VerfÜgung 7.40E-04 VerfÜgung Annotation Koup 2 VerfÜgung Beräicherung Punktzuel: 2,92 VerfÜgung Grof VerfÜgung P_Value VerfÜgung INTERPRO VerfÜgung Histone Kär VerfÜgung 8 VerfÜgung 6.80E-04
SP_PIR_KEYWORDS VerfÜgung nucleosome Kär VerfÜgung 8 VerfÜgung 8.60E-04 VerfÜgung GOTERM_CC_FAT VerfÜgung nucleosome VerfÜgung 8 VerfÜgung 3.10E-03 VerfÜgung Annotation Koup 3 VerfÜgung Beräicherung Punktzuel: site
17
5.10E-03
INTERPRO
Homeobox
17
5.70E-03
SP_PIR_KEYWORDS
Homeobox
17
5.80E-03
INTERPRO
Homeodomain-related
17
6.40E-03
SMART
HOX
17
1.40E-02
D4
3
9.10E-03
SP_PIR_KEYWORDS
embryo
3
3.30E-02
PIR_SUPERFAMILY
PIRSF002612:homeotic

• Entdecken mënschlech Geschicht vum Mo. Bakterien
• Präsenz vun S100A9-positiv demagogesch Zellen zu Kriibs Stoffer deemolegt Weltbild mat engem fréie Etapp Kriibs an eng besser hätt an Patienten mat gastric Kriibs