Identifikavimas DNR metilinimas pokyčius, susijusius su žmogaus skrandžio cancer

nustatymas DNR metilinimas pokyčius, susijusius su žmogaus skrandžio vėžio
tezės
Background pervežimas epigenetinius keičiant genų ekspresijos yra dažnas reiškinys žmogaus vėžio. DNR metilinimas yra gerai žinomas epigenetinius procesas, tačiau patikrinti tikslią pobūdį epigenetinių pokyčius, susijusius su vėžiu išlieka sudėtinga.
Metodai
Mes profiliuoti žmogaus skrandžio vėžio audinio methylome 50-bp rezoliucijos, naudojant metilintas DNR praturtėjimą Technika (metilo CpG sala atkūrimas Analizės) kartu su genomo analizatoriaus ir naują normalizavimo algoritmą.
rezultatai
Mums pavyko įgyti išsamų vaizdą apie vykdytojų su įvairiais CpG tankių, įskaitant CpG salos (CGIS), stenograma įstaigos, ir įvairių pakartoti klasės. Mes nustatėme, kad skrandžio vėžys buvo susijęs su hypermethylation nuo 5 'CGIS ir 5'-galo, koduojančių egzonų, taip pat hipometilinimą pakartotinių elementų, tokių kaip trumpų įterptais kuro elementų ir sudėtinio elemento SVA. Hypermethylation 5 "CGIS reikšmingai koreliavo su downregulation gretutinių genų, pavyzdžiui, į HOX parsisiųsti ir histono genų šeimų. Mes taip pat atrado ilgo nuotolio epigenetinius triukšmo slopinimo (LRES) Regionai skrandžio vėžio audinyje ir nustatė keletą hypermethylated genų (MDM2
, DYRK2
ir LYZ
) pagal šiuose regionuose. Metilinimo statusas CGIS ir genų anotacija elementų metastazių limfmazgiuose buvo tarpinis tarp normalaus ir vėžinių audinių, nurodant, kad metilinimas konkrečių genų palaipsniui išaugo vėžinių audinių.
Išvados
Mūsų išvados suteiks vertingų duomenų būsimo analizės CpG metilinimas modelių, naudingų žymenų, skirtų skrandžio vėžio diagnozę, taip pat naujos analizės metodą, klinikiniai epigenomics tyrimus.
Background pervežimas skrandžio vėžys yra antra pagrindinė priežastis mirčių nuo vėžio visame pasaulyje po plaučių vėžio, todėl daugiau nei 800.000 mirčių kasmet pasaulyje [1]. Dabartinė 5 metų išgyvenamumas asmenų diagnozuota skrandžio vėžys yra tik 20-30%, su tokia maža norma yra paaiškinamas tuo, kad daugeliu atvejų jau pažengęs, kai diagnozuojama. Kaip ir visose vėžio, anksti aptikti išlieka perspektyviausia požiūris siekiant pagerinti išgyvenamumas. Taigi, suprasti Tumorigenesis priežastį žmogaus skrandžio audinyje yra labai svarbus.
H. pylori infekcija pervežimas yra nusistovėjęs ir dažna skrandžio vėžio. Tačiau, keičiant įvairių genetinių veiksnių, taip pat svarbu padidinti skrandžio vėžio riziką. Ji yra gerai žinoma, kad chromosomų nestabilumo kilmės iš genetinių veiksnių, tokių kaip mikrosatelitiniai nestabilumo, taip pat KRAS
ir p53
mutacijų sukelti auglių vystymąsi. Keli genomikos tyrimai nustatė gemalo mutacijas konkrečių genų [2-4] ir ligų jautrių loci [5, 6] skrandžio vėžio. Naujausi tyrimai lyginant skrandžio vėžiu ir sveikus audinius nustatė genetinių žymenų skaičių, įskaitant diagnostikos žymenų [NF2
[7], INHBA
[8], SFRP4
[9]] prognostiniai žymenys [CD9
[10], CDH17
[11], PDCD6
[12]], ir skrandžio vėžys susijęs genai [MUC13
[9], CLDN1
[13], KI67
ir CD34
[14]]. Be to, buvo nustatyta, Epigenetiniai mechanizmai, pavyzdžiui, DNR metilinimo ir Histonas modifikacijų būti svarbus reguliuojant genų, dalyvaujančių biologijos ir ligos, virškinimo trakto [15] išraiška.
DNR metilinimas vaidina svarbų vaidmenį eukariotų ir yra susijęs su pagrindinių mechanizmų, įskaitant genomo įspausti, X chromosomos inaktyvaciją, senėjimo, ir kancerogenezės skaičius. Keitimas DNR metilinimo į genomą randamas beveik visose vėžio tipų ir gali sukelti pokyčius genų ekspresiją, pavyzdžiui, per išraiška onkogenų ir nuslopinami naviko slopintuvas genų metu vėžio vystymosi [16]. Keletas tyrimų parodė, kad genetinių ir epigenetinių pokyčių skrandžio ikivėžinius pakitimus kaupimosi gali turėti įtakos daug tikslų, kaip antai DNR remonto sistemų komponentais naviko slopintuvai, onkogenų, ląstelės ciklo reguliavimo, augimo faktoriai, ir adhezijos molekulių [17-20] , Tačiau šie tyrimai pirmiausia buvo orientuota į keletą kandidačių genų arba padengtos tik viso genomo dalį. Taigi, gauti išsamų vaizdą apie epigenetinių pokyčių, susijusių su vėžio išsivystymo buvo sunku. Visų pirma, supratimo DNR metilinimas pokyčių intrageninės regionuose, CpG salų, intergenic regionų ir pakartokite sekų išlieka ribotas. Taigi, yra didelis susidomėjimas genomo analizės nukrypusiu nuo normos DNR metilinimo šiuose regionuose.
Dėl išsamios genomo masto profiliavimo DNR metilinimo į embriogenezės ir kancerogeninio poveikio, didelės skiriamosios gebos visa genomo iššifravimas metodai, tokie kaip BS-seq [21 -24], MeDIP-punktus [25, 26], o MethylCap-paskesni [27-29] buvo sukurta. Nepaisant sparčios plėtros sekos pagrindu kartografavimo technologija, vis dar yra lyginamosios tyrimų stoka, kuri yra svarbi klinikinių epigenomics tyrimų, įskaitant sutelktas į vėžį. Skirtingai microarray pagrįstą požiūrį, sekos duomenys yra gaminami formatu, kuris yra neįmanomas diferencialinių analizę ir analizės darbo eigos nebuvo standartizuotas. Taigi, skaičiavimais nebrangūs normalizavimo metodai yra reikalingi, kad galėtų tvarkyti skaičiavimo našta apdorojimo didelio dydžio, didelės skiriamosios gebos sekvenavimo duomenis.
Čia mes pristatė normalizavimo algoritmą, kuriame atsižvelgiama į mėginio konkrečių bendro skaitymo tankį, erdvinis pasiskirstymas CpG loci ir fono sekos šališkumo. tada mes sudarėme išsamų viso genomo methylome normalus skrandžio audinio, skrandžio vėžio audinyje, ir metastazavusiu limfmazgių naudojančių MethylCap-tolesnius metodą ir gauti išsamią informaciją apie savo sutrikdymo kancerogenezėje ir metastazių metu. Tai lengvai taikomas lyginamosios analizės methylomes ir kitų rūšių epigenomic duomenimis, ir jis turi ypatingų pasekmių klinikinių epigenomics.
Metodai
skrandžio audinio mėginiai
gavome tris Snap-šaldytų skrandžio navikai ir suderinti normalu skrandžio audinių iš Seulo nacionalinio universiteto medicinos koledžo už methylome tyrimas. Be to, dvidešimt aštuonių suderintų porų normalių ir vėžinių skrandžio audinių buvo gauti papildomos patvirtinimo. Visi mėginiai buvo gautas endoskopinės rezekcijos išnagrinėjus pacientų, kurie davė informuoto asmens sutikimą metu
denatūruotu DNR atkūrimas analizė (Mira)
Genomo DNR nuo 25 mg skrandžio audinyje buvo gryninamas naudojant DNeasy Kraują &.; Audinių komplektas (Qiagen, Valensija, Kalifornija). Genomo DNR mėginiai iš 3 asmenų sujungiamos tuo pačiu koncentracijos. MIRA buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau [30-32]. Trumpai GST-tagged MBD2b ir Jo-tagged MBD3L1 baltymai buvo paruoštas kaip aprašyta. 15 ug genomo DNR buvo suskaidyta į 100 ~ 500 bp ultragarsu ir inkubuojami su 28 UG išgryninto PVM-MBD2b baltymų, 28 UG Jo-MBD3L1 baltymų ir 7 UG ir JM110 bakterijų DNR 6 valandas. 30 UL MagneGST karoliukai (Promega, Madison, WI) preblocked 7 UG ir JM110 bakterijų RNR buvo pridėta ir inkubuojami esant 4 ° C sukasi 45 min galutinio 600 ul mira privalomas reakcijos mišinį. Granulės tris kartus buvo plaunamos su 1 ml plovimo buferiu, ir metilinti fragmentai buvo išplaunami inkubacijos kambario temperatūroje 5 minutes ir tada 56 ° C temperatūroje 30 minučių su 30 ul TE, kurių sudėtyje yra RNaze A (100 ug, Qiagen) ir proteinazės K ( 15 ug, Qiagen). Išplaunami DNR fragmentai buvo toliau gryninamas naudojant Qiaquick PGR valymo rinkiniai (Qiagen).
Illumina genomo Analyzer sekos
Už mes panaudojome 10 ng išplaunami DNR už Illumina genomo analizatoriaus sekos. Taip ligavimo iš Solexa adapteriai, ligavimo produktų poroje su didžiausiu įterpti dydžio 200 bp buvo gelis gryninama 2% agarozės ir veikiamas PGR. Klasteris kartos ir 36 ciklų seką buvo atlikta pagal gamintojo instrukcijas. Mes sekos 120 UL adapteris-susiūta, dydis-frakcionuotas DNR (2 ~ 4 PM) dėl ILLUMINA genomo Analyzer. Sekos žymės buvo susietas su žmogaus genomo (UCSC hg18 duomenų bazėje remiantis NCBI Sudėjimas 36,1 surinkimas), naudojant Solexa analizė naftotiekį (versija 0.3.0). Sekos skaito 34 bp (išskyrus pirmą ir paskutinį nukleotidų), kad praėjo buvo naudojamos kokybės kontrolės filtrai.
Duomenų apdorojimas ir ŠMM skaičiavimas
Mes pratęstas 3 'galo 34-BP skaito 200 bp padengti DNR fragmentai saistomas MBD baltymų. Rodmens buvo konvertuojami į naršyklės pailginamas duomenų (lova) failus vizualizacija į UCSC genomo naršyklės http: //. Genomas UCSC edu "/.. Mes skaičiuojamos sutampančių sekos žymes 50 bp rezoliucijos. Rasti praturtintos genomo regionus, iš priskirti skaito stumdomas langas 1 kb skaičius buvo palyginti su bendru skaičiumi skaito ar fonas skaičius skaito genomo. Kaip, pavyzdžiui, ŠMM buvo apskaičiuojamas dviem būdais; vienas yra kaip (tikslinės skaityti skaičius /norimo dydžio atžvilgiu) /(bendras skaityti skaičius /genomo dydžio) log2 ir suapvalinama iki nulio, o kitas yra kaip (tikslinės skaityti skaičius /norimo dydžio atžvilgiu) log2 /(fono skaityti skaičius /fono dydis) ir suapvalinama iki nulio. Norėdami reguliuoti fono sekos šališkumo, MESbg buvo apskaičiuojamas ta pačia tvarka už įėjimo sekos be išgryninti ir atimama iš ŠMM.
Genomo pozicijas CGIS, rėmėjams, stenograma įstaigos, CDS, ir pasikartojantys elementai
Visi genomo pozicijas CGI, nuorašai ir pakartokite elementai buvo atsisiųsti iš UCSC genomo naršyklėje. A 27,639 CGIS (išskyrus atsitiktinai įsikūręs CGIS) buvo prognozuojama pagal šiuos kriterijus iš viso: GC kiekis 50% ar didesnis, ilgis didesnis nei 200 bp, ir santykis didesnis kaip 0,6 pastebėtas skaičių CpG dinucleotides į tikėtasi [33] , NCBI iRNR pagalbos sekas kolekcija (RefSeq iš laidos versijos 46; kovo 11, 2011) buvo naudojamas nustatant transkripcijos vienetų, nustatytų transkripcijos pradžia, pabaiga svetaines ir CD pradžia, pabaiga svetainėse. Projektų rengėjams, mes panaudojome regionas 500 bp prieš ~ 500 bp pasroviui transkripcijos starto svetainėje. Gavome ~ 5 mln pakartoti vietoves, buvo nustatyta pagal RepeatMasker programą, grindžiamą RepBase bibliotekoje kartojasi.
Metilinimas lygis genomo elementų Viesbutis The metilinimo lygio CGI, promotoriaus, genų kūno, ir pakartokite elementą buvo apskaičiuota naudojant ŠMM sutampančių kiekvieną elementą. RES = 0 buvo naudojamas apibrėžti nemetilintas elementus. Norint išmatuoti hypermethylation arba hipometilinimas vėžiu, mes apskaičiavome diferencialinį netvarka AS "(vėžio ŠMM - Normalus ŠMM). Skirtumas ŠMM > 1,0 buvo naudojamas kaip ribinis dydis. Suprasti pasirinktų genų funkcijas, mes panaudojome ontologijos klasifikaciją genų per DAVID Funkcinis Anotacija Klasteriai įrankių http:.... //David abcc ncifcrf valst /
Genų ekspresijos analizė Viesbutis The Mikrogardelė produktas, naudojamas šiame tyrime buvo Codelink žmogaus visą genomą 55 K mikroschema ( "GE Healthcare", JAV). Visi eksperimentiniai procedūras, įskaitant Juodos tikslinės paruošimo, hibridizacija, po hibridizacijos dažų mova buvo atliekama naudojant pardavėjas rekomenduojama protokolus. Rezultatus failai importuojami į GeneSpring GX 7.3 (Agilent Technologies, JAV) filtravimo ir pagrindinės statistinės analizės. Tarp 55 K genų mikrogardelių, tik genų su esama vėliavėlės ne mažiau kaip 50% mėginių buvo atrinkti vėliau analizės. Mikrogardeliq duomenys buvo deponuota GEO http:.. //Www ncbi NLM NIH valst /GEO /(inventorinį numerį GSE33651)
mira ir realiu laiku qPCR
MIRA... buvo atliktas keturių papildomų individualių mėginių. DNR buvo išvalytas nuo virš nuosėdų ir stebėti realiu laiku qPCR naudojant "Roche 480 mašina. Naudojamų gruntų sekos yra pateikta papildomų failų 1:. Lentelė S1
bisulfite gydymą, metilinimo konkrečių PGR ir pyrosequencing
Mes izoliavo genomo DNR nuo individualaus mėginio, naudojant Qiagen DNeasy audinių rinkinį (QIAGEN). Bisulfite gydymas buvo atliekamas naudojant EZ DNR metilinimas aukso komplektas (Zymo tyrimų) pagal gamintojo instrukcijas. Bisulfito gydytų DNR buvo laikomi -80 ° C temperatūroje, kol tolesniam naudojimui. Naudojamos JEP pradmenys buvo sukurta, naudojant [34] Methprimer ir rodomi Papildoma failą 1: Stalas S1. PGR buvo atliekama su HotStarTaq polimerazės (Qiagen) ir įtraukti pradinį inkubuojamas 95 ° C temperatūroje 15 min, po to 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 1 min, 59 ° C temperatūroje 1 min ir 72 ° C temperatūroje 40 sek, o po to vienas ciklas 72 ° C temperatūroje 10 minučių. MSP produktai buvo atskirtas nuo 2% agarozės gelyje ir regimos EtBr dažymo. Į pyrosequencing reakcijos buvo automatiškai atliekamas su PSQ 96 sistemos (Pyrosequencing AB) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, biotinilinto PGR produktas (50 ul) buvo gryninamas naudojant streptavidinu-Sepharose rutuliukai (Amersham BioSciences). Išvalytas prekė buvo pakrautas į reagento kasetėje su fermento substrato ir dNTP įtraukta į PSQ96 SNP reagentų rinkinys (Pyrosequencing AB). Sekos gruntai pyrosequencing yra parodyta Papildoma failą 1. Lentelė S1
rezultatai
tvarkymu Mira-paskesni methylome duomenys
Mes išgrynintas metilintas DNR praturtintą MIRA (metilo CpG sala atkūrimo tyrimas) ir sekas DNR naudojant naujos kartos seka. DNR metilinimo lygis buvo nustatomas naudojant sekos skaityti grafų atitinkamų regionų, 50 bp intervalais, kaip aprašyta metodika. Mes sukūrėme DNR metilinimas žemėlapius tiek normaliomis ir vėžinių skrandžio audinius. Kiekvienam mėginiui gavome apie 10 mln seka skaito (papildomas failą 1: Stalas s2). Kiekvienas methylome esančius ~ 140 mln CpG skaito, apimantis ~ 48% visų genomo CpG svetainių išskyrus centromerų (papildomas failų 1: Lentelė S3). Vidutinis aprėptis CPG skaito kiekvieną methylome buvo 4.5X. Grįsdama didelio jautrumo mira, genomikos segmentai, kuriuose yra tik vienas CPG turėjo didesnis skaityti skaičių nei be CpG (psl pervežimas value = 0), tai rodo, kad vienišų CpG pokyčiai gali būti išspręsta naudojant mira. Vidutinis seka skaito padidėjo proporcingai CpGs skaičius per 50-bp intervalo, ir iš tikrųjų, Mira aprėptis nebuvo mažas, net regionuose mažo CpG tankį (Papildoma failo 2: S1 paveiksle). Kartu paėmus, šie rezultatai rodo, kad Mira buvo sėkmingai atsigauna pakankamai frakcija Metilinto regionuose. Kalbant apie Mira tikslumo, ~ 99% Mira-užfiksuoti fragmentai turėjo bent vieną CPG puslapį per jų seką, nurodant mažą klaidingą aptikimo lygis.
Norint išmatuoti sodrinimą vietos metilinimas signalų, mes apskaičiavome metilinimas praturtėjimo balai (netvarka ) gaudama skaityti skaičių tam tikrame regione ir tada atlikti normalizuoti kontroliuoti už visą perskaičiau skaičius (mest) mėginio (Global normalizuoti) arba vietos skaitymui skaičius (MESl) į vartotojo nustatytą aplinkinių regiono (vietos normalizavimas) (žr metodus). Tai leidžia tiesiogiai palyginti nepriklausomų mėginių, kurių skaitymo tankio. Mes tada atliko logaritminį transformavimą į gautą rezultatą. Kartu su turintys kitus matematinius esmės, tai suteikia dispersinė stabilizavimo naudą, ypač aukštos skaityti skaičiaus, kurie dažnai sujungtų su aukštais techniniais variantų, kurie gali pateikti reikšmingi šališkumo duomenų.
Mes įvertino statistinį reikšmingumą ŠMM ir dviem būdais. Randomizuoti RES buvo sukurtas Skaitmeninė sukeitimą su genomo pozicijas mūsų seka skaito. Fono ŠMM (MESbg) buvo eksperimentiškai gautas sekos normalų genomą be išgryninti. Kaip ir tikėtasi, tikrieji duomenys davė ženkliai didesnes sodrinimo balai (papildomas failą 2: S2 pav.) Pažymėtina, MESbg buvo didesnis nei ŠMM randomizuotų genomų, nuoroda, kad fonas sekas vienas gali sukurti sodrinimo, tikriausiai dėl chromatino prieinamumo ir amplifikacijos šališkumo. Atitiktų naujausius pranešimus [35], tai rodo, kad reikia tinkamai kalibravimą būdingo sekos šališkumo poreikį. Todėl mes normalizuoti mūsų ŠMM MESbg.
Rasti optimalų sąlyga normalizuojant, mes palyginti statistinę tinkamumą įvairių normalizavimo metodus. Gairė pasiskirstymas išilgai genomo galima modeliuoti pagal Puasono pasiskirstymo [36, 37]. Iš tinka gėris buvo išbandytas naudojant Kolmogorovo-Smirnovo testą. Šiame bandyme, žemas D Statistika rodo gerai tinka. Nors Puasono modelis aplenkė Gauso Apskritai, ŠMM parodė geriau tinka nei žaliavų skaityti skaičius (Papildoma failą 2: S3, paveikslą), iliustruojantis retais atvejais pobūdį žurnalo masto skaityti grafo priemonė. Normalizuotos MESl kalibruotuose valdymo sekos (MESbg) davė dar geresnių rezultatų nei normalizuotas mest kalibruotu pagal kontrolės seką (MESbg).
Pasaulio ir chromosomų vaizdu DNR metilinimo
po patvirtinimo geriausią būdą balais genomo metilinimo lygio 50-bP intervalais, pirmiausia išnagrinėjo chromosomų metilinimas modelius normalių pavyzdžių. Vidutinė ŠMM apskaičiuotos kiekvienam chromosomos pasiūlė, kad CpG-turtingas ir genų turtingas chromosomos yra linkę būti labai denatūruotas (1a pav.) Metilinimo lygis chromosomų su dideliu kiekiu ilgai trumpo branduolinių elementų (eilučių) buvo palyginti mažas (pvz, chromosomos 4). Įdomu tai, kad trumpų įterptais kuro elementų kiekis (Sines) buvo proporcingas chromosoma metilinimo modelio. Tai greičiausiai sukėlė tai, kad Sines yra paprastai sugrupuotos genų-daug regionuose. Lytis chromosomos buvo visame pasaulyje hypomethylated su mažesniu CpG tankio ir aukštojo pakartoti turinį nei autosomes. Kadangi mes panaudojo audinius, kurių buvo imtasi iš vyrų šiame eksperimente, pasaulinė hipometilinimas X chromosomos pastebėtas nėra susijęs su X nukenksminimą. Chromosomų mastu peržiūros suformulavo aukštą CPG tankio ir didelio metilinimas aplink genų turtingas (žr juodas juostas apačioje) ir CGI-turtingas regionuose (žr mėlynas juostas viršuje) (1b pav.) Priešingai, mažos CpG tankumas, žemas metilinimas buvo pastebėtas maždaug genų skurdžiuose regionuose, kurie buvo daug ilgo nuotolio kartojasi (> 1 kb) (žr raudonas juostas viršuje). Vidutinė ŠMM teigia, kad metilinimas lygis CGIS yra žymiai didesnis nei genic regionų ar kartojasi (1b pav.) 1 pav metilinimo dėsningumai normalų skrandžio audinio. (A) Chromosomų mastu vidutinis ŠMM rodomas kaip vidutinio CpG tankio funkcija, genų tankis (genų už MB numerį), linija kiekio (nuo linijos per Mb ilgio), ir sąlyga kiekio (apie Sine ilgis per mb) už kiekvieną chromosomą. (B) chromosomos 22, vidutinis CpG tankis (nuspalvinta pilkai) ir ŠMM (juoda kreivė) buvo gauta 1 MB stumdomomis langai. Į aranžuotų genų pozicijos (juodos juostos apačioje), CG salos (mėlynos juostos viršuje), ir ilgas atkartoja (> 1 KB; raudonas juostas viršuje) lyginamos su DNR metilinimo ir CpG tankio fone ( kairėje). Vidutinė ŠMM dėl CGIS, genų įstaigos ir kartojasi (dešinėje). (C) genų įstaigų ir CGI ŠMM (kairėje) paskirstymo. Vidutinė ŠMM dėl promotoriaus susijęs ir propaguotojas nepriklausomas CGIS yra parodyta dešinėje. (D) vidutinis ŠMM dėl promotoriaus pogrupius, remiantis CGI (kairėje) egzistavimą. (R) Pagrindinė informacija apie intergenic, exonic ir intronic regionuose, atsižvelgiant į ilgį, CpG skaičius ir prijungti skaito (kairėje). Iš intergenic, exonic ir intronic netvarka paskirstymas parodyta dešinėje. (F), pagrindinė informacija apie tiekėjų 1 KB regione, 5 'UTR egzonų, kodavimo egzonų, 3' UTR egzonų ir pasroviui 1-KB regionas pagal ilgį, CpG skaičius ir prijungti skaito (kairėje). Iš kiekvieno elemento ŠMM paskirstymas parodyta dešinėje.
Apskritai, CGI linkę likti metilinimas nemokamai normalaus audinio. Analizuoti aukštos metilinimas modelius CGIS, mes patikrinti vidutinį MES paskirstymą ir rado šiek tiek bimodalinio modelis (1c pav.) Apie 66% (11.376 /17.284) iš CGIS kairiajame piko sutapo su promotoriaus (1 kb pagal mūsų apibrėžimą). Priešingai, 13% (1386 /10.357) iš CGIS teisinga piko sutapo su promotoriaus, tai rodo, kad dauguma rengėjas susijęs CGI yra nemetilintas. Priešingai Rėmėjas susijusių CGI, rengėjas nepriklausomas CGI buvo labai denatūruotas (1c pav.) Nors dauguma CGI-teigiamas rengėjai nebuvo denatūruotas, CGI-neigiamas rengėjai parodė gana aukštą metilinimo lygis (1d pav.) Mes taip pat patikrino metilinimo lygis rengėjams iki CpG tankio kaip anksčiau apibrėžta [38] (Papildoma failą 3: Lentelė S4 "). Metilinimo modelio vykdytojų buvo atvirkščiai susijęs CpG tankio (papildomas failą 2: S4 pav). Kita vertus, CGI, kurių sudėtyje yra genų įstaigos turėjo didesnes metilinimo lygis, nei tiems, kurie neturi CGIS (1d pav.)
Pirmyn, mes analizuojami metilinimas sodrinimo modelius įvairiuose komentuojami genomo elementų ištirti regionus, kurie buvo pirmenybė denatūruotu. Genic regionai užima apie 40% žmogaus genomo, o apie 53% viso rašoma yra šiame regione, su skaito yra įsikūrusi intronic regione (1 lentelė) balsų dauguma. Nors didelė dalis denatūruotu fragmentai patenka intronic regionuose skatinti susietas santykis skaito prie egzonų ilgis yra gerokai didesnis, nei kad intronai, tai rodo, kad egzonų yra labiau metilo nei intronai (1E pav). Per genų susijusių regionų kodavimo egzonų sodrinimas yra net didesnis nei kituose regionuose, kaip anksčiau pranešama (1F paveiksle ir 2 lentelė) [39]. Tai aiškiai rodo, kad metilinimas vaidina svarbų vaidmenį Exon regulation.Table 1 žmogaus genomo ir normalaus mėginių informacijos genic ir intergenic regione
žmogaus genomo Informacija
Normalus Imties Informacija

Santykinis praturtėjimo santykis
Funkcinė Kategorija
ilgis (bp)
santykis

# CpG pervežimas pervežimas santykis pervežimas pervežimas Skaityta
santykis
vs ilgis
vs CpG Count

Genic
1,184,139,094
39.46
13,262,253
47.09
20,854,434
53.25
1.35
1.13
Exon
68,035,894
2.27
1,808,089
6.42
4,350,405
11.11
4.90
1.73
Intron
1,122,817,725
37.41
11,613,113
41.23
17,358,273
44.32
1.18
1.07
Intergenic
1,816,976,186
60.54
14,901,610
52.91
18,310,273
46.75
0.77
0.88
Human Genomo
3001115280
100
28.163.863
100
39.164.707
100
1.00
1.00
2 lentelė Žmogaus genomo ir normalus pavyzdys informacija genų anotuotų regionuose
žmogaus genomo Informacija
Normalus Imties Informacija

Santykinis praturtėjimo santykis

Funkcinis Kategorija
ilgis (bp)
santykis

# CpG pervežimas pervežimas santykis
Skaityta

Santykis
vs ilgis
vs CPG Grafo
Upstream 1 kb
24.468.069
0,82
937.748
3.33
535.593
1.37
1.68
0.41
5'UTR egzonų
8.436.529
0,28
411.563
1.46
292.654
0,75
2.66
0,51
kodavimo egzonų
33.384.619
1.11
1.077.913
3,83
3.448.755
8.81
7.92
2.30
3'UTR egzonų
28.387.978
0,95
378.012
1.34
806.832
2.06
2.18
1.53
Pasroviui 1 kb
23.136.263
0,77
340.866
1.21
551.071
1.41
1,83
1.16
žmogaus genomo
3001115280
100
28.163.863
100
39.164.707
100
1.00
1.00
pokyčiai DNR metilinimas raštų, susijusių su skrandžio vėžio
Kai vidutinis chromosomų ŠMM vėžio methylome buvo palyginti su kontrolinio bandinio audinio, mes nustatėme, kad visi chromosomų vėžio audinio linkę būti hypomethylated (papildomas failą 2: S5 pav). Su chromosomų lygmens nuomonėmis, buvo nustatyta, CGI turtingas regionai turi būti specialiai hypermethylated, o kartotinių turtinguose regionuose buvo plačiai hypomethylated (2A pav; Papildoma failą 2: S6 pav.) Analizuoti metilinimo pokyčiai genomo elementų, mes suderinti kiekvieną elementą pradžios ir pabaigos vietas ir tada gauti vidutinį RES kiekvieno atitinkamo padėtį. Įdomu pastebėti, mes nustatėme, hypermethylation į tiekėjų regione, ypač nuo 500 bp tiekėjų į transkripcijos starto svetainėje (2b pav.) Tai atitinka su promotoriaus regionuose hypermethylation dažnai stebimas vėžiu. 2 pav palyginimas metilinimas modelių normaliai ir vėžinių audinių. (A), Vidutinis ŠMM kreivė normaliai (juoda) ir vėžiniai (raudonas) audinių chromosomos 19 (kairėje). Vidutinė ŠMM dėl CGIS, genų įstaigos ir kartojasi (dešinėje). (B), DNR metilinimo genų komentuojami elementų. Kiekvienas elementas (prieš srovę 1 kb, galinio egzono, intronas, ir pasroviui 1 kb) buvo padalintas į 20 dėžės ir vidutinės ŠMM buvo nustatytas kiekvieno visų atitinkamų elementų dėžę. (C) DNR metilinimas ne transkripto galuose ir koduojančios srities galus. Vidutinis ŠMM buvo gautas slankiojančiame 50-bp langas pagal bet jo atstumas nuo stenograma pradžios (pirmasis) ir pabaigoje (antrojo) CGI-teigiamų skatinančių medžiagų, taip pat stenograma pradžios (trečiosios šalies) ir pabaigoje (ketvirtoji) dėl CGI- teigiami rengėjai. (D), DNR metilinimo viso 5 'UTR egzonų (kairėje) ir 5' UTR kodavimo egzonų (dešinėje).
Regiono centru transkripcijos starto svetainėje parodė visiškai skirtingus modelius, priklausomai nuo CGI buvimą, atsižvelgiant į mažas metilinimas statusas CGI turinčių vykdytojų (2c pav.) Mes taip pat nustatė, kad vėžinių audinių, puikus hypermethylation CGI turinčių vykdytojų vyksta ir kad CpGs tankis yra labai svarbus DNR metilinimo (2C paveikslas) padidėjimas. Toliau analizuoti, ar 5 'regionai genų buvo panašiai hypermethylated genų vykdytojų, mes patikrinti metilinimo modelis iš pirmųjų egzonų. Įdomu tai, kad mes nustatėme, kad pirmasis galinio egzono buvo hypermethylated tik tada, kai jis buvo 5'-galą kodavimo egzono, bet ne tada, kai jis buvo 5 'UTR galinio egzono (2D pav). Šie regionai, taip pat yra didelis CPG tankį. Todėl CGI ne tiekėjų regionuose genų, promotoriaus ir kodavimo pradžios atrodo, kad pagrindiniai tikslai DNR hypermethylation į vėžį.
Metilinimas modelio CpG salos
Tirti tarp CGIS ir vietą koreliaciją DNR metilinimas, mes subgrouped CGIS atsižvelgiant į jų padėtį per genomą. Konkrečiau kalbant, jie buvo suskirstyti į kategorijas kaip 5 '(esančio tarp 1 kb vertikaliai aukštyn, ir kodavimo pradžios vietą, jo geno), intrageninės (intrageninės CGIS prie 5' gale), ir intergenic (esančios ne-Genų regione) (papildomas failo 1: lentelėje S5). Nors CpG tankumas buvo panašus tarp trijų grupių, ne 5 'CGI (intrageninės ir intergenic CGI), buvo žymiai daugiau metilo nei 5 "CGIS (papildomas failą 2: S7 pav). Mes taip pat palyginti vidutinius vienuolis subgrouped CGIS ir nustatė, kad visų CGIS metilinimas paprastai buvo padidintas. Tačiau santykinis skirtumas ŠMM siūlė, kad metilinimo pokyčiai 5 "CGIS buvo žymiai didesnis, nei kitų CGIS (3a paveikslas), atspindintis svarbiausius vaidmenis 5 'CGIS vėžiu. Iš 5 "CGI hypermethylation mastu žymiai koreliuoja su transkripcijos pradžios vietoje (3B pav) iš dalies sutampa. 3 pav DNR metilinimo CpG salų. (A), Santykiniai diferencialinės vienuolis subgrouped CGIS. (B) Koreliacija tarp diferencinę CGI metilinimo ir atstumo į transkripcijos starto svetainėje. (C) Koreliacija tarp genų ekspresijos lygį ir CGIS hypermethylation. (D), Metilinimas konkrečių PGR iš Histonas genų, parodančius aukščiausius diferencialinės RES vertybes. . M1 ir U1 atitinka HIST3H2A, o P2 ir "U2" atitinka HIST3H2B
ištirti genų atliekama diferencinė metilinimas esant 5 "CGIS funkcijas, mes išrinkome genus su labai diferencinę CGI netvarka (diferencinis ŠMM > 1). Tada atliekamas genų ontologijos (GO) analizė įgyti pažvelgti į mechanizmų, atsakingų vėžio (3 lentelė). Kai genai buvo susitelkę į įvairius GO kategorijas, mes nustatėme, kad HOX
genų grupių ir nukleosoma surinkimo susijusių genų klasterių buvo tikslus hypermethylation, o apoptozę susiję genų klasterių buvo tikslus hipometilinimą. Įdomu tai, kad mūsų išvada, kad HOX
genų klasterių buvo lengvatinės tikslai DNR metilinimo yra suderinamas su ankstesnėje ataskaitoje [40]. Be to, genų sklypai patvirtino, kad hypermethylation buvo CGI specifinis vėžio (papildomas failą 2: S8 pav). Apskaičiuoti išraiška modelių pokyčius sukelia hypermethylation 5 "CGIS, mes atliekame funkcinę analizę genų ekspresijos duomenimis, gautais iš kDNR microarray eksperimentams. Hypermethylation 5 "CGIS reikšmingai koreliavo su downregulation genų (psl pervežimas = 0,03) (Fig.3C; Papildoma failų 3: Lentelė S6 ir S7). Tai rodo, kad triukšmo slopinimo genų metilinimo gali būti tiesiogiai įtakos CpG tankio ir 5 'CGI hypermethylation laipsnis. Tyrėme DNR metilinimo statusą genų su hypermethylated 5 "CGIS ir downregulated raiškos modelius. Tarp jų buvo genas, koduojantis iuose H2B tipo 3-B (HIST3H2BB
). Analizė HIST3H2BB
promotoriaus metilinimo naudojant metilinimo būdingus PGR atskleidė, kad dauguma vėžiu sergančių pacientų (8/10, 80%) eksponuojama padidėjęs metilinimas į promotoriaus regione (3D paveikslas) .table 3 Funkcinis anotacija grupavimo genų su hypermethylated 5'CGIs
Anotacija klasteris 1
sodrinimas Taškai: 3.27
Grafas
P_VALUE
GOTERM_BP_FAT
nukleosoma surinkimas
11
3.90E-04
GOTERM_BP_FAT
chromatino surinkimas
11
5.20E-04
GOTERM_BP_FAT
baltymų DNR kompleksas surinkimo
11
7.40E-04
Anotacija klasteris 2
sodrinimas Taškai: 2.92
Grafas
P_VALUE
Interpro
Histono šerdis
8
6.80E-04
SP_PIR_KEYWORDS
nukleosoma šerdis
8
8.60E-04
GOTERM_CC_FAT
nukleosoma
8
3.10E-03
Anotacija klasteris 3
sodrinimas Taškai: site
17
5.10E-03
INTERPRO
Homeobox
17
5.70E-03
SP_PIR_KEYWORDS
Homeobox
17
5.80E-03
INTERPRO
Homeodomain-related
17
6.40E-03
SMART
HOX
17
1.40E-02
D4
3
9.10E-03
SP_PIR_KEYWORDS
embryo
3
3.30E-02
PIR_SUPERFAMILY
PIRSF002612:homeotic

• Atrasti žmonijos istoriją nuo skrandžio bakterijos
• Buvimas S100A9 teigiamas uždegiminių ląstelių vėžiu audinių koreliuoja su ankstyvoje stadijoje vėžys ir geriau prognozės pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu