Tunnistaminen DNA metylaatiomuutokset liittyvät ihmisen mahasyöpä

Tunnistaminen DNA: n metylaatio muutoksia, jotka liittyvät ihmisen mahasyöpä
Abstract
tausta
Epigeneettiset muuttaminen geeni-ilmentymisen on yleinen tapahtuma ihmisen syövässä. DNA: n metylaatio on tunnettu epigeneettiset prosessi, mutta tarkistaa tarkka luonne epigenetic muutoksia, jotka liittyvät syöpään on edelleen vaikeaa. Tool Menetelmät
Olemme profiloitu methylome ihmisen mahasyövän kudos 50-bp resoluutio käyttämällä metyloitua DNA rikastus tekniikka (metyloitu CpG-saarekkeen elpyminen määritys) yhdessä genomin analysaattorin ja uusi normalisointi algoritmi.
tulokset
pystyimme saada kattava näkemys promoottorien eri CpG tiheydet, mukaan lukien CpG saaret (CGI), transkripti elimet, ja erilaiset toista luokkaa. Huomasimme, että mahasyövän liittyi hypermetylaatiota 5 'CGI ja 5'-päähän koodaus eksonien sekä hypometylaatio toista elementtejä, kuten lyhyt välissä ydin- elementtejä ja komposiittielementin SVA. Hypermetylaatiota 5 'CGI korreloi merkitsevästi downregulation liittyvien geenien kaltaisia HOX
ja histoni geeniperheistä. Olemme myös havainneet, pitkän kantaman epigeneettisellä hiljentäminen (LRES) alueet mahasyövän kudosten ja tunnistettu useita hypermetyloitunut geenejä (MDM2
, DYRK2
, ja LYZ
) näillä alueilla. Metylaatiostatuksen CGI ja geenin merkintä elementtejä metastaattisessa imusolmukkeisiin oli välimuoto normaalin ja syöpäkudoksen, mikä osoittaa, että metylaatio spesifisten geenien lisätään vähitellen syöpäkudoksessa.
Johtopäätökset
Tuloksemme antavat arvokasta tietoa tulevaa analysointia CpG metylaatiovyöhykkeiden, hyödyllisiä markkereita diagnosointiin mahasyöpä, sekä uusi määritysmenetelmä kliinisten Epigenomics tutkimuksiin.
tausta
mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti keuhkosyövän jälkeen, jolloin yli 800000 kuolemantapausta vuosittain maailmanlaajuisesti [1]. Nykyinen 5 vuoden pysyvyys yksilöiden diagnosoitu mahalaukun syöpä on vain 20-30%, tämä alhainen johtuisi siitä, että useimmissa tapauksissa on jo edennyt pitkälle, kun diagnosoitu. Kuten kaikista syövistä, varhainen havaitseminen on edelleen lupaavin lähestymistapa parantaa eloonjäämisaste. Siksi ymmärtäminen syyn tumorigeneesin ihmisen mahalaukun kudoksesta on välttämätöntä.
Infektio H. pylori
on vakiintunut ja yleinen syy mahasyöpä. Kuitenkin muutokset eri geneettiset tekijät ovat tärkeitä myös lisätä mahasyövän riskiä. On hyvin tunnettua, että kromosomaalisen epävakaus peräisin geneettiset tekijät, kuten microsatellite epävakaus sekä KRAS
ja p53
mutaatiot johtavat kasvainten kehittymisen. Useat genomista tutkimuksissa on todettu ituradan mutaatioita geeneistä [2-4] ja sairaus altis loci [5, 6] mahasyövän. Viimeaikaiset tutkimukset verrataan mahasyövän ja normaalin kudoksen on havaittu useita geneettisiä markkereita, mukaan lukien diagnostiset merkkiaineet [NF2
[7], INHBA
[8], SFRP4
[9]], ennustetekijöitä markkereita [CD9
[10], CDH17
[11], PDCD6
[12]], ja mahalaukun syöpään liittyvä geeni [MUC13
[9], CLDN1
[13], Ki67
ja CD34
[14]]. Lisäksi, epigeneettinen mekanismeja, kuten DNA: n metylaation ja histonimodifikaation on todettu olevan tärkeitä ilmentymisen säätelyyn liittyvien geenien biologian ja sairaus ruoansulatuskanavan [15].
DNA: n metylaatio on keskeinen rooli eukaryooteissa ja liittyy useita keskeisiä mekanismeja kuten leimautuminen, X-kromosomin inaktivaatioon, ikääntyminen ja syövän syntymistä. Muuttaminen DNA: n metylaatio perimässä esiintyy lähes kaikissa syöpätyyppien ja voivat johtaa muutoksiin geenien ilmentyminen, kuten yli-ilmentyminen onkogeenien ja vaiennettu tuumorisuppressorigeeneille aikana syövän kehityksen [16]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että kertyminen geneettiset ja epigeneettiset muutokset mahalaukun syövän esiasteita voi vaikuttaa useita tavoitteita, kuten DNA: n korjaus komponentteja, tuumorisuppressorien, onkogeenien, solusyklin sääntelyviranomaisten, kasvutekijöitä, ja adheesiomolekyylien [17-20] . Nämä tutkimukset ovat ensisijaisesti keskittyneet muutaman kandidaattigeenit tai peittää vain osan koko genomin. Siten pääsy globaali näkymä epigeneettiset muutokset syöpään liittyvä kehitys on ollut vaikeaa. Erityisesti ymmärtäminen DNA metylaatio muutoksia geeninsisäiset alueilla, CpG-saarekkeiden, geenien välinen alueet, ja toista sekvenssit on edelleen vähäistä. Näin ollen on erittäin kiinnostunut genominlaajuisia analyysi poikkeavan DNA: n metylaation näillä alueilla.
Kattavat genomin mittakaavan profilointi DNA: n metylaation alkionkehitysvaiheessa ja Karsinogeneesin korkearesoluutioinen koko Genomikartoituksen menetelmiä, kuten BS-kohdat [21 -24], MeDIP-kohdat [25, 26], ja MethylCap-kohdat [27-29] on kehitetty. Huolimatta nopea kehitys sekvensointilaatuinen pohjainen karttatekniikan, on edelleen puute vertaileva tutkimus, joka on kriittinen kliinisiin Epigenomics tutkimuksiin, mukaan lukien keskittyy syöpään. Toisin microarray lähestymistavat, sekvenointitulosten tuotetaan muodossa, joka ei voida nostaa differentiaali analyysiin, ja analyysi työnkulku ei ole standardoitu. Siten laskennallisesti edullisia normalisointi menetelmiä tarvitaan käsitellä laskennallista taakkaa käsittelyyn isokokoiset, korkean resoluution sekvenointitulosten.
Täällä esittelimme normalisointi algoritmi, joka ottaa huomioon näytteen erityinen yhteensä lukea tiheys, spatiaalinen jakelu CpG loci, ja tausta sekvensointi bias. Sitten luonut kattavan koko genomin methylome normaalin mahalaukun kudoksesta, mahasyövän kudos, ja metastaattinen imusolmukkeiden käyttämällä MethylCap-seq menetelmällä ja saatu yksityiskohtaisia tietoja sen häiritseekin aikana syövän synnyn ja etäpesäke. Tämä on helposti sovellettavissa vertailevan analyysin methylomes ja muita epigenomic datan, ja se on erityisesti vaikutuksia kliiniseen Epigenomics. Tool Menetelmät
Mahalaukun kudosnäytteitä
Saimme kolme snap-jäädytetty mahalaukun kasvaimet ja vastaaviin normaaleihin mahalaukun kudosta Seoul National University College of Medicinen methylome tutkimus. Lisäksi kaksikymmentäkahdeksan pareina normaalin ja kasvaimen vatsa kudokset saatiin lisävahvistusta. Kaikki näytteet saatiin endoskooppinen resektio aikana tutkimisen potilaalla antoi tietoon perustuva suostumus.
Metyloidut DNA elpyminen määritys (MIRA) B Perimän DNA 25 mg mahalaukun kudosta puhdistettiin käyttäen DNeasy Veri & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA). Genomi-DNA-näytteet 3 henkilöä yhdistettiin samana pitoisuutena. MIRA suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30-32]. Lyhyesti, GST-merkitty MBD2b ja His-merkitty MBD3L1 proteiinit valmistettiin, kuten on kuvattu. 15 ug genomista DNA: ta hajanaiset 100 ~ 500 bp sonikoimalla ja inkuboitiin 28 ug: lla puhdistettua GST-MBD2b proteiinia, 28 ug His-MBD3L1 proteiinia ja 7 ug JM110 Bakteeri-DNA: ssa 6 tuntia. 30 ui MagneGST helmiä (Promega, Madison, WI) esiblokattu 7 ug JM110 bakteerien RNA: ta, lisättiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa pyörivällä 45 minuuttia lopullisessa 600 ul: MIRA sitovia reaktioseoksesta. Helmet pestiin kolme kertaa 1 ml: lla pesu- puskuria, ja metyloidut fragmentit eluoitiin inkuboimalla huoneenlämpötilassa 5 minuuttia ja sitten 56 ° C: ssa 30 minuuttia 30 ul: aan TE, joka sisälsi RNaasi A: ta (100 ug, Qiagen) ja proteinaasi K: n ( 15 ug, Qiagen). Eluoidut DNA-fragmentit puhdistettiin edelleen käyttämällä Qiaquick PCR puhdistuskittejä (Qiagen).
Illumina Genome Analyzer sekvensointi
Käytimme 10 ng eluoitua DNA Illumina Genome Analyzer sekvensoinnilla. Ligaation jälkeen parin Solexa adapterit, ligaatio tuotteiden suurin insertin koko 200 bp puhdistettiin geelissä 2% agaroosia ja altistetaan PCR-monistusta. Cluster sukupolven ja 36 sykliä sekvensointi suoritettiin noudattaen valmistajan ohjeita. Sekvensoimme 120 ui adapteri ligoitiin, kokofraktionoitiin DNA (2 ~ kuusitoista) on Illumina Genome Analyzer. Sekvenssimerkkejä kartoitettiin ihmisen genomiin (UCSC hg18 tietokanta perustuu NCBI Build 36.1 kokoonpano) käyttäen Solexa Analysis Pipeline (versio 0.3.0). Sekvensoitiin lukee 34 bp (lukuun ottamatta ensimmäinen ja viimeinen nukleotidi), jotka kulkivat laadunvalvonnan suodattimia käytettiin.
Tietojenkäsittely ja MES laskenta
Me laajennettu 3 'pään 34 bp lukee 200 bp kattaa DNA fragmentteja sitoo MBD proteiineja. Lukema muutettiin selaimen laajennettavissa data (BED) tiedostot visualisointi on UCSC genomin selaimen http: //genomin. UCSC. Edu /. Laskimme päällekkäisen sekvenssin tunnisteet 50 bp resoluutio. Löytää rikastettua genomialuetta määrä kartoitettu lukee liukuikkunaa 1 kb verrattiin kokonaismäärään lukee tai taustan määrä lukee perimässä. Sellaisenaan, MES laskettiin kahdella tavalla; yksi on log2 (kohde luetaan count /kohde koko) /(yhteensä luku- määrä /genomin koko) ja pyöristetään nollaan, toinen on log2 (kohde luetaan count /kohde koko) /(tausta lue count /tausta size) ja pyöristetään nollaan. Säädä tausta sekvensointia bias, MESbg laskettiin samalla tavalla panos sekvensointi ilman affiniteettipuhdistuksen ja vähennetään MES.
Genomisen kannat CGI, promoottorit, transkriptio elimet, CDS, ja toistuvia elementtejä
Kaikki genomista asennot CGI, selostukset ja toista elementtejä ladattiin UCSC genomista selain. Kaikkiaan 27639 CGI (paitsi satunnaisesti sijaitsevat CGI) ennustettiin seuraavat kriteerit: GC-pitoisuus 50% tai suurempi, pituus suurempi kuin 200 emäsparia, ja suhde on suurempi kuin 0,6 todettu määrä CpG dinukleotidien odotettuja määrä [33] . NCBI mRNA viitesekvenssit keräys (RefSeq maasta julkaisuversiosta 46, 11 maaliskuu 2011) käytettiin tunnistamaan transkriptio yksiköiden kanssa määriteltyjen transkription alku, loppu sivustoja ja CDS alku, loppu sivustoja. Sillä promoottoreita, käytimme alueen 500 emäsparia ~ 500 bp alavirtaan transkription aloituskohdasta. Hankimme ~ 5 miljoonaa toista paikoissa, jotka olivat määräytyy RepeatMasker ohjelma perustuu RepBase kirjaston toistoja.
Metylointi taso perimän elementtejä
metylaatio taso CGI, promoottori, geeni-elin, ja toista elementti arvioitiin avulla MES päällekkäisiä elementti. MES = 0 käytettiin määrittelemään metyloitumattomien elementtejä. Mitata hypermetylaation tai hypometylaatio syövän, laskimme ero sekaisin (Cancer MES - Normaali MES). Differential MES > 1.0 käytettiin kynnys. Ymmärtää toiminnot valittujen geenien, käytimme ontologian luokittelua geenien kautta DAVID Functional Annotation Klusterointi työkalu http: //david. Abcc. Ncifcrf. Gov /.
Geeniekspressioanalyysissä
microarray tuote tässä tutkimuksessa käytettiin oli Codelink Human Whole Genome 55 K siru (GE Healthcare, USA). Kaikki koetoimenpiteet lukien cRNA tavoite valmistelu, hybridisaatio, hybridisaation jälkeinen väriaine kytkentä suoritettiin käyttäen myyjä suositteli protokollia. Tulos tiedostot tuotiin GeneSpring GX 7,3 (Agilent Technologies, USA) suodatus- ja perus tilastollinen analyysi. Niistä 55 K geenien microarray vain geenien läsnä liput vähintään 50% näytteistä valittiin myöhempää analysointia varten. Microarray tiedot talletettiin GEO http: //www. NCBI. NLM. NIH. Gov /geo /(hakunumero GSE33651).
MIRA ja reaaliaikaisen qPCR
MIRA suoritettiin neljä muuta yksittäisten näytteiden. DNA puhdistettiin supernatantista ja seurataan reaaliaikaisesti qPCR käyttäen Roche 480 konetta. Sekvenssit käytetyt alukkeet esitetään Muihin tiedosto 1: Taulukko S1.
Bisulfiittikäsittelyn, metylaatiospesifinen PCR ja pyrosekvensointi
Me eristetty genominen DNA yksittäisistä näytteestä käyttäen Qiagen DNeasy Tissue Kit (Qiagen). Bisulfiittikäsittelyn suoritettiin käyttäen EZ DNA: n metylaation kulta Kit (Zymo tutkimus) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Käytetyt alukkeet MSP suunniteltiin käyttäen Methprimer [34], ja ne esitetään Additional tiedosto 1: Taulukko S1. PCR suoritettiin HotStarTaq polymeraasia (Qiagen) ja sisällyttää ensimmäisen inkuboitu 95 ° C: ssa 15 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 1 min, 59 ° C 1 min ja 72 ° C: ssa 40 sekunnin ajan, minkä jälkeen yksi sykli 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan. MSP-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeeleillä ja visualisoitiin EtBr-värjäyksellä. Pyrosekvensointi Reaktiot automaattisesti suoritettiin PSQ 96 järjestelmä (pyrosekvensointi AB) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, biotinyloitua PCR-tuotetta (50 ui), puhdistettiin käyttämällä streptavidiini-Sepharose-helmiä (Amersham Biosciences). Puhdistettu tuote laitettiin reagenssin patruuna entsyymin, substraatin ja dNTP sisällyttää PSQ96 SNP Reagent Kit (pyrosekvensointi AB). Sekvenssointialukkeiden varten pyrosekvensointi esitetään Additional tiedosto 1: Taulukko S1.
Tulokset
käsittely MIRA-seuraavissa methylome data
Puhdistimme metyloitua DNA rikastuttaman MIRA (metyloitu CpG-saarekkeen talteenotto määritys) ja sekvensoitiin DNA: lla käyttäen seuraavan sukupolven sekvensointi. DNA: n metylaatio tasot määritettiin käyttämällä sekvensointia lukea laskee vastaavien alueiden 50 bp välein, kuten kohdassa menetelmät. Loimme DNA: n metylaatio karttoja sekä normaali- että syöpä mahan kudoksissa. Kunkin näytteen, saimme noin 10 miljoonaa järjestyksessä lukee (Additional tiedosto 1: Taulukko S2). Jokainen methylome sisälsi ~ 140 miljoonaa CpG lukee, joka kattaa ~ 48% kaikista genomista CpG sivustot ilman sentromeerien (Additional tiedosto 1: Taulukko S3). Keskimääräinen kattavuus CpG lukee kussakin methylome oli 4.5x. Tueksi korkea herkkyys MIRA, genomista segmenttiä, joka sisältää vain yhden CpG oli korkeampi lukea laskee kuin ne, joilla ei ole CpG (p
arvo = 0), mikä viittaa siihen, että yksi CpG muutoksia voitaisiin ratkaista käyttämällä MIRA. Keskimääräinen sekvenssi lukee kasvoi samassa suhteessa määrän CpG: t sijaitsevat 50-kiehumispisteet, ja itse asiassa, MIRA kattavuus ei ollut alhainen, jopa harvaan CpG tiheys (Additional tiedosto 2: Kuva S1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että MIRA onnistui talteen riittävä osa metyloitu alueilla. Mitä tarkkuutta MIRA, ~ 99% MIRA-kaapattu fragmentteja oli ainakin yksi CpG-sarjoina, mikä viittaa alhainen väärien paljastumisaste.
Mittaamiseksi rikastamista paikallisten metylaation signaaleja, laskimme metylointi rikastus tulokset (MES ) hankkimalla lukea määrä tietyllä alueella ja sen jälkeen suorittamalla normalisointi kontrolloida koko lukenut count (MEST) näytteessä (maailmanlaajuinen normalisointi) tai paikallisen luku- määrä (MESL) in käyttäjän määrittämän ympäröivän alueen (paikallinen normalisointi) (katso menetelmät). Tämä mahdollistaa suoran vertailun riippumattomia näytteitä eri lukea tiheys. Sitten suoritettiin logaritminen muutos johdettujen pisteet. Yhdessä ottaa muita matematiikan ansiot, tämä tarjoaa hyöty varianssi vakauttamista, erityisesti korkea luku laskee, jotka usein yhdessä korkean teknisen vaihtelua, joka voi ottaa käyttöön merkittäviä puolueellisuudesta tiedot.
Olemme arvioineet tilastollista merkitystä MES kaksi tapaa. Satunnaistetut MES kertyi numeerisesti permutoimalla genominen kannat meidän järjestyksessä lukee. Taustalla MES (MESbg) oli kokeellisesti saatu sekvensoimalla normaalin genomin ilman affiniteettipuhdistusjärjestelmässä. Kuten odotettua, todellinen saadut tiedot selvästi suurempi rikastus tulokset (Additional tiedosto 2: Kuva S2). Erityisesti MESbg oli suurempi kuin MES Satunnaistetuista genomeja, osoitus siitä, että tausta sekvenssit yksin voi luoda rikastamiseen, johtunee chromatin saavutettavuutta ja vahvistusta bias. Yhdenmukainen viimeaikaiset raportit [35], tämä osoittaa, että tarvitaan asianmukainen kalibrointi luontaista sekvensointia bias. Siksi me normalisoitui meidän MES kanssa MESbg.
Jotta löydetään paras mahdollinen edellytys normalisointi, vertasimme tilastollinen kunto erilaisten normalisointi menetelmiä. Tag jakelu pitkin genomia voidaan mallintaa Poisson-jakauman [36, 37]. Sovituksen hyvyys testattiin käyttäen Kolmogorov-Smirnov testi. Tässä testissä, alhainen D tilastotieto osoittaa hyvän istuvuuden. Vaikka Poisson malli päihitti Gaussin yleistä, MES osoitti paremmin sopivaksi kuin raaka luku- määrä (Additional tiedosto 2: Kuva S3), joka kuvaa harvinainen tapahtuma luonne log mitoitetaan lukea count toimenpide. Normalisoitu MESL kalibroitu ohjaus sekvensointi (MESbg) tuotti jopa parempia tuloksia kuin normalisoitu mest kalibroida ohjaus sekvensointi (MESbg).
Global ja kromosomi näkymät DNA: n metylaatio
vahvistamisen jälkeen paras tapa pisteytyksen genominlaajuisten metylaatiotasoilla 50-bp välein, ensin tutkittu kromosomaalisen metylaation normaalin näytteitä. Keskimääräinen MES lasketaan kutakin kromosomi ehdotti, että CpG-rikas ja geeni-rikas kromosomit yleensä erittäin metyloituja (kuvio 1A). Metylaatiotasot kromosomien suuria määriä pitkän välissä ydin- elementit (viivat) oli suhteellisen alhainen (esim kromosomi 4). Mielenkiintoista on, että määrä lyhyen välissä ydin- osia (SINES) oli verrannollinen kromosomiin metylaatio. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että Sinesin tyypillisesti ryhmitelty geeni-rikkaita alueita. Sukupuolikromosomien oli maailmanlaajuisesti hypometyloidut pienemmillä CpG tiheys ja suurempi toista sisältöä kuin autosomeiksi. Koska käytimme kudosten otettu mies tässä kokeessa, maailmanlaajuinen hypometylaatio X-kromosomi havaitaan ei liity X inaktivaatioon. Kromosomi-laajat näkymät toisteta korkea CpG tiheys ja korkea metylaatio noin geeni-rikas (katso mustat palkit alareunassa) ja CGI-rikkaita alueita (ks siniset palkit yläosassa) (kuvio 1 B). Sen sijaan alhainen CpG tiheys ja alhainen metylaatio havaittiin noin geeni-köyhiä alueita, jotka olivat runsaasti pitkän kantaman toistoja (> 1 kb) (katso punaiset palkit yläreunassa). Keskimääräinen MES viittaa siihen, että metylaatio taso CGI on huomattavasti korkeampi kuin aiheuttavaa alueiden tai toistoa (kuvio 1 B). Kuva 1 metylaation normaalin mahalaukun kudosta. (A) kromosomi laajuinen keskimääräinen MES on esitetty funktiona keskimääräisestä CpG tiheys, geeni tiheys (määrä geenejä per Mb), LINE määrä (pituus LINE per Mb), ja SINE määrä (pituus SINE kohti mb) kunkin kromosomi. (B) varten kromosomissa 22, keskimääräinen CpG tiheys (harmaat) ja MES (musta käyrä) saatiin 1-Mb työntöikkunoista. Sijainnit litteroitua geenien (mustat palkit alareunassa), CG saaret (siniset palkit yläreunassa), ja pitkät toistot (> 1 kb, punainen palkit päällä) verrataan taustanaan DNA: n metylaation ja CpG tiheys ( vasemmalla). Keskimääräinen MES varten CGI, geeni elimet, ja toistoja (oikealla). (C) jako-geenin elinten ja CGI MES (vasemmalla). Keskimääräinen MES promoottorin liittyvän ja promoottori riippumaton CGI on esitetty oikealla. (D) keskimääräinen MES promoottorin alaryhmiin, perustuu siihen, että CGI (vasemmalla). (E) perustiedot geenien välisen, eksoni, ja introni-alueet, mukaan pituuden, CpG numero, ja kartoitettu lukee (vasemmalla). Jakauma geenien välisen, eksoni, ja introni MES on esitetty oikealla. (F) perustiedot ylävirran 1 kb alue, 5 'UTR eksonia, koodaus eksonit, 3' UTR eksonit, ja loppupään 1-kb alue pituuden, CpG numero, ja kartoitettu lukee (vasemmalla). Jakauma MES jokaisen elementin näkyy oikealla.
Yleensä CGI taipumus jäädä metylaatio vapaasti normaalissa kudoksessa. Analysoida korkea metylaation ja CGI, tarkistimme keskimääräinen MES jakelun ja löysi hieman bimodaalisen kuvio (kuvio 1 C). Noin 66% (11376/17284) ja CGI vasemmassa huippu limittäin promoottorin (1 kb meidän määritelmä). Sen sijaan 13% (1386/10357) ja CGI oikeaan huippu päällekkäin promoottorin, mikä viittaa siihen, että suurin osa promoottori liittyvät CGI ovat metyloimaton. Toisin kuin promoottori liittyvät CGI, promoottori-riippumaton CGI olivat raskaasti metyloitiin (kuvio 1C). Vaikka useimmat CGI-positiiviset promoottorit eivät metyloitu, CGI-negatiivinen promoottorit oli suhteellisen korkea metylaatiotasoilla (kuvio 1 D). Olemme myös tarkistanut metylaatio taso promoottorien CpG tiheys aikaisemmin määritelty [38] (Additional tiedosto 3: Taulukko S4). Mety- promoottorien oli kääntäen verrannollinen CpG tiheys (Additional tiedosto 2: Kuva S4). Toisaalta, CGI sisältävä geeni elimet oli korkeammat metylaatiotasoilla kuin ilman CGI (kuvio 1 D).
Seuraavaksi analysoimme metylaatio rikastamiseen kuvioita eri selityksin genomista elementtejä tutkia alueita, jotka olivat ensisijaisesti metyloituja. Genic alueet vievät noin 40% ihmisen genomin, mutta noin 53% koko lukee on tällä alueella, jossa suurin osa lukee ne sijaitsevat introni alueella (taulukko 1). Vaikka merkittävä osa metyloitua fragmenttien kuulu introni alueiden suhde kartoitettu lukee pituuden eksonien on huomattavasti korkeampi kuin intronit, mikä viittaa siihen, että eksonit ovat erittäin metyloitu kuin intronia (kuvio 1 E). Sisällä geeni liittyvä alueilla rikastaminen koodaus eksonien on jopa korkeampi kuin muiden alueiden, kuten aiemmin on raportoitu (kuvio 1 F ja taulukko 2) [39]. Tämä viittaa vahvasti siihen, että metylaatio on rooli eksonissa regulation.Table 1 Ihmisen genomin ja normaali näyte tietoa aiheuttavaa ja geenien välinen alue
Human Genome Information
Normal Sample Information

Suhteellinen rikastus Ratio
Functional Luokka
Length (ep)
suhde
# CpG
suhde
Lukee
suhde
vs. pituus
vs. CpG Count

Genic
1,184,139,094
39.46
13,262,253
47.09
20,854,434
53.25
1.35
1.13
Exon
68,035,894
2.27
1,808,089
6.42
4,350,405
11.11
4.90
1.73
Intron
1,122,817,725
37.41
11,613,113
41.23
17,358,273
44.32
1.18
1.07
Intergenic
1,816,976,186
60.54
14,901,610
52.91
18,310,273
46.75
0.77
0.88
Human Genome
3001115280
100
28163863
100
39164707
100
1,00
1,00
Taulukko 2 Ihmisen genomin ja normaali näyte tietoa geenien selityksin alueiden
Human Genome Information
Normal Sample Information

Suhteellinen Enrichment Ratio

Toiminnallinen Luokka
Length (ep)
Ratio
# CpG
Ratio
Lukee

Ratio
vs. pituus
vs. CpG Count
Upstream 1 kb
24468069
0,82
937748
3,33
535593
1,37
1,68
0,41
5'UTR- eksonit
8436529
0,28
411563
1,46
292654
0,75
2,66
0,51
Coding eksonit
33384619
1,11
1077913
3,83
3448755
8,81
7,92
2.30
3'UTR eksonit
28387978
0,95
378012
1,34
806832
2,06
2.18
1,53
Loppupään 1 kb
23136263
0,77
340866
1.21
551071
1,41
1,83
1,16
Human Genome
3001115280
100
28163863
100
39164707
100
1,00
1,00
muutoksia DNA metylaation liittyy mahasyövän
Kun keskimääräinen kromosomi MES syöpä methylome verrattiin valvonnan kudoksen, huomasimme, että kaikki kromosomien syöpäkudoksessa oli taipumus hypometyloidut (Additional tiedosto 2: Kuva S5). Jossa kromosomi-laajat näkymät, CGI-rikkaita alueita havaittiin erityisesti hypermetyloitunut, kun taas toista-rikkaita alueita olivat laajalti hypometyloidut (kuvio 2A; Additional tiedosto 2: Kuva S6). Analysoida metylaatiomuutokset genomisessa elementtejä, me kohdistettu kukin elementti alussa ja lopussa sivustoja ja sitten saatu keskimääräinen MES kussakin vastaavassa asemassa. Silmiinpistävän Havaitsimme hypermetylaation alkupään alueella, erityisesti 500 bp ylävirtaan transkription aloituskohdasta (kuvio 2B). Tämä on mukaisesti hypermetylaatiota promoottorialueiden usein havaittu syöpää. Kuvio 2 vertailu metylaatiovyöhykkeiden normaalissa ja syöpä- kudoksessa. (A) Keskimääräinen MES käyrän normaali (musta) ja syöpä (punainen) kudoksen kromosomissa 19 (vasen). Keskimääräinen MES varten CGI, geeni elimet, ja toistoja (oikealla). (B) DNA: n metylaatio geenin selityksin elementtejä. Jokainen elementti (ylävirtaan 1 kb, eksonin, intronin, ja loppupään 1 kb) on jaettu 20 roskakorit ja keskimääräinen MES saatiin kullekin bin kaikkien siihen elementtejä. (C) DNA: n metylaatio klo transkriptio päissä ja koodaavan alueen päät. Keskimääräinen MES saatiin liukuvaan 50 emäsparin ikkuna mukaan sen etäisyys transkripti alusta (ensimmäinen) ja pää (toinen) CGI-positiivisten promoottorit sekä transkripti käynnistys (kolmas) ja lopussa (neljäs) ja CGI- positiivinen promoottorit. (D) DNA: n metylaatio on yhteensä 5 'UTR eksonia (vasemmalla) ja 5' UTR koodaavat eksonit (oikealla).
Alueella keskitetty transkription aloituskohdasta osoittivat täysin erilaisia malleja riippuen siitä, että läsnä on CGI, mikä alhainen metylaatiostatuksen CGI sisältävän promoottorit (kuvio 2C). Olemme myös havainneet, että, syöpäkudoksessa, merkittävä hypermetylaatiota CGI sisältäviä promoottoreita tapahtuu ja että tiheys CpG: t on ratkaisevaa kasvu DNA metylaatio (kuvio 2C). Edelleen analysoida, 5 'alueita geenien hypermetyloitunut samalla tavalla geenin promoottorit, tarkistimme mety- ensimmäisen eksonien. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että ensimmäinen eksoni on hypermetyloitunut vain silloin, kun se oli 5'-pään koodaavan eksonin, mutta ei silloin, kun se oli 5'-UTR: n eksonissa (kuvio 2D). Nämä alueet sisälsivät myös korkeat CpG tiheys. Näin ollen, CGI ylävirran alueiden geenien promoottori, ja koodaus alku näyttää olevan pääkohteita DNA hypermetylaation syövän.
Metylointi kuvio CpG-saarekkeiden
Tutkitaan korrelaatio sijainti CGI ja DNA: n metylaatio, me subgrouped CGI mukaan niiden asema genomissa. Erityisesti ne luokiteltiin 5 "(välissä 1 kb ylävirtaan ja koodaus aloituskohtaa geenin), en sisäinen (geenin sisäinen CGI ulkopuolella 5 'päähän), ja geenien välinen (ulkopuolella sijaitsevien patogeeniset alue) (Additional tiedosto 1: Taulukko S5). Vaikka CpG tiheys oli samankaltainen kaikissa kolmessa ryhmät, 5 'CGI (geeninsisäiset ja geenien välinen CGI), huomattavasti enemmän denaturoidulla yli 5' CGI (Additional tiedosto 2: Kuva S7). Olemme edelleen verrattuna keskimääräiseen MES on subgrouped CGI ja löysi metylaation kaikkien CGI yleisesti lisääntynyt. Kuitenkin suhteellinen ero MES ehdotti, että muutos metylaation 5 'CGI oli merkittävästi suurempi kuin muissa CGI (kuvio 3A), mikä yhtä tärkeää roolia 5' CGI syövän. Laajuus 5 'CGI hypermetylaation korreloi merkitsevästi päällekkäisyys transkription aloituskohdasta (kuvio 3B). Kuvio 3 DNA: n metylaatio CpG-saarekkeiden. (A) Suhteellinen ero MES of subgrouped CGI. (B) välinen korrelaatio ero CGI metylaatio ja etäisyys transkription aloituskohdasta. (C) välinen korrelaatio geenien ilmentymisen taso ja hypermetylaatiota CGI. (D) Metylaatiospesifinen PCR histoni geenien, jolla on suurin ero MES-arvot. M1 ja U1 vastaavat HIST3H2A, kun taas M2 ja U2 vastaavat HIST3H2B.
Tutkitaan toiminnot geenien meneillään ero metylaatio 5 'CGI, valitsimme geenit erittäin ero CGI MES (ero MES > 1). Suoritimme sitten geeni ontologian (GO) analyysi perehtyä vastaavien mekanismien syövän (taulukko 3). Kun geenit koottiin erilaisiksi GO luokkiin, huomasimme, että HOX
geeni klustereita ja nukleosomissa kokoonpano liittyvät geeniryppäät olivat tavoitteet hypermetylaatio, kun taas apoptoosin liittyvät geeniryppäät olivat tavoitteet hypometylaatio. Mielenkiintoista, meidän toteamisesta HOX
geeniryppäät olivat etuoikeutettu tavoitteista DNA: n metylaatio on yhdenmukainen aiemman raportin [40]. Lisäksi geeni tontteja vahvisti, että hypermetylaation oli CGI-spesifinen syöpä (Additional tiedosto 2: Kuva S8). Arvioida muutoksia ilmentymiskuviot aiheuttama hypermetylaatiota 5 'CGI, suoritimme toiminnallinen analyysi geenien ilmentyminen saatavien tietojen cDNA microarray kokeiluja. Hypermetylaatiota 5 'CGI korreloi merkitsevästi downregulation geenien (p
= 0,03) (kuvio 3C; Additional tiedosto 3: Taulukko S6 ja S7). Tämä osoittaa, että hiljentäminen geenien metylointi voidaan suoraan vaikuttaa aste CpG tiheyden ja 5 'CGI hypermetylaation. Analysoimme DNA metylaatiostatuksen geenien kanssa hypermetyloitunut 5 'CGI ja vaimentua ekspressiokuvioiden. Näiden joukossa oli koodaavan geenin histoni H2B tyypin 3-B (HIST3H2BB
). Analyysi HIST3H2BB
promoottorin metylaation käyttäen metylaatiospesifinen PCR osoitti, että suurimmalla osalla potilaista (8/10, 80%) oli lisääntynyt metylaatio promoottorialue (kuvio 3D) .table 3 Toiminnallinen merkinnästä klusterointi geenien kanssa hypermetyloitunut 5'CGIs
Lisäykset Cluster 1
Enrichment Score: 3,27
Count
P_Value
GOTERM_BP_FAT
nukleosomissa kokoonpano
11
3.90E-04
GOTERM_BP_FAT
chromatin kokoonpano
11
5.20E-04
GOTERM_BP_FAT
proteiini-DNA mutkikkaaksi
11
7.40E-04
Huomautukset Cluster 2
Enrichment Pisteet: 2.92
Count
P_Value
Interpro
histoni ydin
8
6.80E-04
SP_PIR_KEYWORDS
nukleosomissa ydin
8
8.60E-04
GOTERM_CC_FAT
nukleosomissa
8
3.10E-03
Huomautukset Cluster 3
Enrichment Pisteet: site
17
5.10E-03
INTERPRO
Homeobox
17
5.70E-03
SP_PIR_KEYWORDS
Homeobox
17
5.80E-03
INTERPRO
Homeodomain-related
17
6.40E-03
SMART
HOX
17
1.40E-02
D4
3
9.10E-03
SP_PIR_KEYWORDS
embryo
3
3.30E-02
PIR_SUPERFAMILY
PIRSF002612:homeotic

Tunnistaminen DNA metylaatiomuutokset liittyvät ihmisen mahasyöpä

tutkimukset

tutkimukset

Other Languages