Deep sequencing van maagcarcinoom onthult somatische mutaties aan gepersonaliseerde geneeskunde relevant

Deep sequencing van maagcarcinoom onthult somatische mutaties aan gepersonaliseerde geneeskunde relevante
De abstracte Achtergrond Wereldwijd
, maagkanker is de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde dood, met de meerderheid van de ziektelast door economisch minder gedragen -developed landen.
Methods
Hier melden wij een genetische karakterisering van 50 maagdarmkanker monsters, met behulp van Affymetrix SNP arrays en Illumina mRNA expressie arrays evenals Illumina sequencing van de coderende gebieden van 384 genen die behoren tot verschillende trajecten bekend verandert bij andere kankers.
Resultaten
Genetische veranderingen werden waargenomen in de WNT, Hedgehog, celcyclus, DNA schade en epitheliale naar mesenchymale transitie trajecten.
Conclusies
de gegevens suggereren getarget therapieën goedgekeurd of in klinische ontwikkeling voor maag-carcinoom van nut zou zijn om ~ 22% van de onderzochte patiënten. Daarnaast is de nieuwe mutaties hier gevonden, zijn waarschijnlijk de klinische respons te beïnvloeden en suggesties doen voor nieuwe targets voor drug discovery. Achtergrond
Ondanks de recente daling van de sterftecijfers van maagkanker in Noord-Amerika en in de meeste van Noord en West-Europa blijft maagkanker een van de belangrijkste doodsoorzaken wereldwijd en komt veel voor in Japan, Korea, Chili, Costa Rica, de Russische Federatie en andere landen van de voormalige sovjet-Unie [1]. Ondanks verbeteringen in de behandeling modaliteiten en screening, de prognose van patiënten met adenocarcinoom van de maag blijft slecht [2]. De pathogenese begrijpen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is het essentieel om de moleculaire mechanismen die de progressie van maagkanker regelen ontleden. Vooral de oncogene mechanismen die kunnen worden gericht door gepersonaliseerde geneeskunde. Ondernemingen De term "oncogen verslaving" kankercellen sterk afhankelijk van een bepaalde oncogen of oncogene pathway werd geïntroduceerd door Weinstein beschrijven [3, 4]. Het concept onderstreept de ontwikkeling van gerichte therapieën die probeert een oncogen inactiveren, essentieel voor overleving van kankercellen terwijl spaarde normale cellen die niet op dezelfde verslaafd.
Aantal oncogenen geactiveerd hoogfrequente andere kankers is ook aangetoond te muteren bij maagkanker. Bijgevolg is gebracht therapeutische behoeve van deze oncogenen feitelijk een deel van maagcarcinomen zou behandelen, hetzij als enkelvoudige middelen of in combinatie. In januari 2010 werd trastuzumab in combinatie met chemotherapie goedgekeurd voor de eerste lijn behandeling van ERBB2
-positieve gevorderde en gemetastaseerde maagkanker. Trastuzumab is de eerste gerichte middel moet worden goedgekeurd voor de behandeling van maagcarcinoom en een toename van 12,8% in respons werd gezien met de toevoeging van trastuzumab aan chemotherapie bij ERBB2
positieve adenocarcinoom van de maag [5, 6]. Er wordt geschat dat 2-27% van maagkanker haven ERBB2
amplificaties en kunnen worden behandeld met remmers ERBB2 [7, 8]. Ook overexpressie van een receptortyrosinekinase (RTK) EGFR
, is opgemerkt bij maagkanker en meerdere processen tegen EGFR remmers
in dit type kanker gaande (beoordeeld in [9, 10]). Verder een aantal maagkanker haven DNA-amplificatie of overexpressie van de RTK BMO
[11, 12] en haar paraloog MST1R
[13] en kan worden behandeld met BMO golfreizen of MST1R
remmers [14-20 ]. Tenslotte FGFR2
overexpressie en amplificatie is waargenomen bij een klein deel van maagkanker (scirrhous) [21] en remmers hebben aangetoond enkele werkzaamheid in de kliniek [22].
Stroomafwaarts van de RTK's, KRAS
wildtype amplificatie en mutatie is ook gevonden in ongeveer 9-15% van maagkanker [23, 24] en kunnen effectief worden behandeld met MEK remmers [25, 26]. Activatie van PI3K /AKT /mTOR-route is ook gezien in 4-16% van maagkanker [27-30] en kunnen dus gevoelig PI3K inhibitors [31-34] zijn. Evenzo heeft celcyclus kinase AURKA
aangetoond worden geactiveerd maagkanker [35, 36] en AURKA remmers in klinische ontwikkeling [37] kan klinisch voordeel hebben.
Verslagen van de frequentie van verschillende oncogene activatie en hun co-optreden zijn beperkt. In tegenstelling tot gastrointestinonal stromale tumoren (GIST) die worden gekenmerkt door een hoge frequentie van KIT Kopen en PDGFRA
activatie [38] en daarmee effectief de meerderheid van imitanib en sunitinib [39, 40] behandeld, wordt maagdarmkanker een moleculair heterogene ziekte met geen high-frequency oncogene verstoring tot nu toe ontdekt zijn. Dit wordt geïllustreerd door een recent onderzoek van somatische mutatie in kinase coderende genen in 14 maagkanker cellijnen en drie maagkanker weefsels die meer dan 300 nieuwe kinase enkele nucleotide variaties en-kinase verwante structurele varianten ontdekt. Echter niet zeer frequent terugkerende mutatie of gemuteerd kinase werd ontdekt [41].
Met het doel het ophelderen van de mogelijke behandeling van maagcarcinoom met gerichte therapieën hetzij op de markt, ontwikkeling of te ontdekken, hebben we klinische kenmerk maagcarcinoom monsters oncogen activatie te detecteren.
We namen een globale benadering door het testen van de monsters op Affymetrix SNP arrays en Illumina mRNA expressie arrays. Deze technologieën zijn goed gevalideerd voor het opsporen van genotype, DNA copy number variatie en mRNA expressie profiel. Zij vatbaar zijn voor heterogene klinische monsters. De monsters werden ook ondervraagd door de tweede generatie (Illumina) sequencing. Relatief nieuwe tweede generatie sequencing technologieën bieden zowel verhoogde doorvoersnelheid en deep sequencing capaciteit. Dit laatste is vooral van belang voor het karakteriseren kanker monsters die vaak een mengsel van celtypen waaronder infiltrerende normale cellen, vasculatuur en de tumorcellen van verschillende genotypen omvatten. In deze studie gebruikt vooreerst specifieke verrijking en Illumina sequencing technologie om de coderende gebieden sequentie van 384 genen. We hebben besloten om de diepte van de dekking voorkeur boven ruimere dekking om mutaties aanwezig in subpopulaties binnen de tumoren vast te leggen. Recente studies hebben aangetoond kankers vaak vele veranderingen haven in een kleiner aantal signaalwegen [42, 43] Daarom we gericht op genen in deze trajecten. We hebben ook genen die coderen voor eiwitten die eerder aangetoond dat het antwoord op gerichte therapieën en meer kans succes te worden gericht door kleine molecule interventie, als ons doel is om efficiënter en nieuwe manieren om de behandeling maagcarcinoom vinden.
Methods invloed
tissue monsters
DNA en RNA-monsters werden verkregen uit ziekenhuizen in Rusland en Vietnam volgens IRB goedgekeurde protocollen en met IRB goedgekeurd toestemming vormen voor moleculaire en genetische analyse. De medische centra zelf hebben ook de interne ethische comités beoordeeld het protocol en ICF. De monsters werden geproduceerd door middel van Tissue Solutions Ltd http: //www. Tissue-oplossingen com /.. Voor monster kenmerken zie aanvullende file 1 tafel S1
Arrays
genotypen en kopieer aantal profielen werden gegenereerd voor elk monsters met behulp van 1 ug DNA run op Affymetrix SNP V6 arrays met behulp van Affymetrix protocollen. Copy number variation gegevens werden geanalyseerd in het ArrayStudio software http: //www. Omicsoft com.. De gegevens werden genormaliseerd met behulp van Affymetrix algoritme en gesegmenteerd met behulp van CBS. Een transcript profiel werd gegenereerd voor elk monster met behulp van 1 pg totaal RNA run op Illumnia HG-12 RNA-expressie arrays na de Illumina protocollen. De gegevens werden geanalyseerd binnen de Illumina GenomeStudio software. Http: //www. Illumina com /software /genomestudio_ software ILMN.. Als data pre-processing procedure een probeset alleen behouden als het een "huidige" (d.w.z. twee standaarddeviaties boven achtergrond) bellen in ten minste één monster. Signaalwaarden van de overblijvende probe sets werden omgezet in 2-gebaseerde logaritmische schaal en quantile normalisatie werd uitgevoerd. DNA kopiëren en RNA-expressie niveaus werden geïntegreerd op het gen niveau binnen de ArrayStudio software http: //www. Omicsoft com.. Pathway verrijking analyse werd uitgevoerd binnen de GeneGo metacore analyse suite http: //www. GeneGo com /.. Alle reeks gegevens uit deze studie is beschikbaar in GEO http: //www NCBI NLM nih gov /geo /onder serie toegangsnummer GSE29999
Gerichte diepe DNA sequencing
5..... ug DNA werd PCR-verrijkt voor de coderende exons van alle bekende transcript van 384 genen van belang (extra bestand 2 tabel S2) met behulp van de Raindance platform http:... //www raindancetechnol gieën com /
De verkregen doelwit banken werden gesequentieerd met behulp Illumnia Gaii een lees-lengte van 54 nt. Sequentie leest in kaart gebracht met de referentie genoom (hg18) met de BWA programma [44]. Bases buiten de beoogde regio's werden genegeerd toen samenvatten dekking statistieken en variant gesprekken. SAMtools werd gebruikt om de uitlijning genotypen [45] en ontleden, en elke oproep die afwijkt van referentiebasis beschouwd als een actuele variant. De SAMtools pakket genereert consensus kwaliteit en de variant kwaliteit schattingen de genotype gesprekken karakteriseren. Nauwkeurigheid van genotype gesprekken werd geschat door concordantie aan oproepen van de Affymetrix 6.0 SNP microarray genotype. Concordantie matrices van monsters op basis van zowel de SNP en de volgorde gegevens werden gegenereerd om te controleren of het monster verkeerde etikettering (extra bestand 3 figuur S1). Concordantie en kwantiteit van genotype gesprekken werden getabelleerd voor drempels van consensus kwaliteit, variant kwaliteit en diepgang. De laatste reeks variant oproepen geïdentificeerd middels consensus kwaliteit groter dan of gelijk aan 50 en variant kwaliteit groter dan 0. somatische veranderingen alleen de mutaties aanwezig in het monster kanker en niet gedetecteerd in de normale monsters werden behouden uitsluitend identificeren. Als extra filter voor kiembaan varianten, werden alle aanwezigen in dbSNP en 1000 genoom polymorfisme datasets varianten verwijderd.
Q-PCR
Q-PCR werd uitgevoerd via een standaard protocol met behulp van Fluidigm 48 * 48 dynamische array. In de eerste plaats werd een validatie run uitgevoerd met behulp van samengevoegde controle RNA uit drie exemplaren. Vier ingang RNA bedragen werden getest (125 ng, 250 ng, 375 ng en 500 ng). Drievoud datapunten werden verkregen voor het vervolgens 10-punts seriële verdunning per elke conditie per assay. De beste algemene resultaten waren 250 of 500 ng, waardoor de efficiëntie waarden leverden ~ 85%. Daarom 250 ng ingang bedrag voor de experimentele monsters. De gegevens werden geproduceerd in drievoud en betekenen gecombineerd. CT-waarden werden omgezet in overvloed met behulp van standaard formule overvloed = 10 (40-CT /3.5). Test data werd genormaliseerd voor huishoudelijk gebruik van de analyse van covariantie werkwijze waarbij de twee schoonmakers (GAPDH en beta-actine) gebruikt om een ​​robuuste score te berekenen en de score werd als covariaat de andere genen passen. Data-analyse werd uitgevoerd in de Arraystudio software.
Sanger Sequencing
Genoom DNA PCR-primers werden van IDT (Integrated DNA Technologies Inc, Coralville, Iowa) besteld. PCR reacties werden uitgevoerd met behulp Invitrogen Platnium polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA). 50 ng genomisch DNA werd geamplificeerd gedurende 35 cycli bij 94 ° C gedurende 30 seconden, 58 ° C gedurende 30 seconden en 68 ° C gedurende 45 seconden. PCR producten werden gezuiverd met behulp AmPure Agencourt (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). Directe sequentiebepaling van de gezuiverde PCR producten met sequencing primers werden uitgevoerd met AB v3.1 BigDye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) en sequencing reacties werden gezuiverd met CleanSeq Agencourt (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). De sequencing reacties werden geanalyseerd met een Genetic Analyzer 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). Alle sequenties, werden gegevens verzameld en geanalyseerd met behulp Codon Code Aligner (CodonCode Corporation, Dedham, MA).
Resultaten
DNA- en RNA-amplificatie patronen in monsters zijn in overeenstemming met eerdere studies
overeenstemming met de meeste andere humane kankers, duplicaties opgetreden in het genoom van de 50 maagkanker monsters vs. gematchte normale monsters (figuur 1). Grote gebieden van frequente amplificatie werden gevonden op chromosomale regio 8Q, 13q, 20q en 20p. Bekende oncogenen MYC Kopen en CCNE1 Wat zijn in het 8q en 20p amplicons, respectievelijk waarschijnlijk bijdragen aan een groei voordeel van de amplificatie verleend. Deze versterkingen zijn waargenomen in eerdere studies bij maagkanker samen met de versterking van 20p waarvoor ZNF217 Kopen en TNFRSF6B
zijn als kandidaat-bestuurder-genen [46] voorgesteld. Figuur 1 Weergave van CNV aberraties in alle 50 maagkanker monsters, voor elke autosoom. De y-as komt overeen met de som van het aantal positieve of negatieve veranderingen in een bepaald segment van de log2 verhouding van die verandering. Gebieden met een verhoogd of verlaagd aantal kopieën consistent in alle geanalyseerde monsters of zeer grote veranderingen in enkele monsters grote positieve en negatieve verandering maten te laten zien. Elk punt of segment in cijfer wordt gekleurd door monster. De kleurcode is willekeurig met elk van de 50 monsters kanker kleur wordt toegewezen. Amplified segmenten omvatten chromosoom 8Q, 20q, 20p, 3T, 7p en 1Q.
Overeenstemming tussen DNA copy number gain en RNA-expressie onder de kanker monsters werd geëvalueerd en de top 200 genen bevat binnen een gebied van frequente hoge DNA kopie in kanker monsters en die een hoge mRNA niveaus gehad (in vergelijking met gematched normaal weefsel) worden in tabelvorm in extra file 4 tabel S3. Het grootste deel van de genen op deze lijst zijn van chromosomale regio's 20q en 8Q, suggereert dat deze amplificaties hebben het meeste effect op de mRNA niveaus, in de minderheid zijn genen voor 20p, 3Q, 7p, en 1Q. Figuur 2 toont het RNA profielen gemeten door Q-PCR van een voorbeeld gen uit elke regio weergegeven algemene overexpressie bij maagkanker, met name in bepaalde monsters. Naast MYC Kopen en CCNE1
, zijn er meerdere genen in deze regio's, die zouden kunnen bijdragen aan een groei voordeel voor de kankercel. De biologische pathways meest aanzienlijk verrijkt versterkt en overexpressie genen zijn betrokken bij de regulatie van de vertaling (p = 0,000015) en DNA-schadeherstel (p = 0,003). Monsters met amplificaties in deze genomische gebieden worden geannoteerd in figuur 3. Er is geen waarneembare neiging amplificaties in deze regio's samen voorkomen of uit te sluiten. In overeenstemming met een eerdere studie [47], de PERLD1
locus werd versterkt (binnen de ERBB2
amplicon) in de steekproef van 08.280 en MMP9
werd tot overexpressie gebracht, maar niet waarneembaar versterkt. Ook in figuur 3 focale DNA amplificaties met overeenstemmende RNA expressie van genen waarschijnlijk de reactie op gerichte therapieën beïnvloeden worden aangeduid, bijvoorbeeld onderliggende gegevens zie aanvullende file 5 figuur S2. Figuur 2 Expressie van voorbeeld genen van elk geamplificeerd chromosomaal gebied in proefmonsters bevestigd door Q-PCR. Rode stippen duiden samples kanker en witte stippen duiden normale monsters. De y-as geeft de mRNA overvloed.
Figuur 3 Mutatie profiel monsters. Tissue monsters worden getoond aan de bovenkant en annotaties voor hen relevant zijn in onderstaande kolommen. Rode dozen duiden DNA-amplificatie en overeenstemmende mRNA overexpressie, oranje dozen duiden RNA overexpressie met geen bewijs van DNA-amplificatie, rode stippen duiden DNA verlies. Blauwe dozen duiden somatische nonsynonymous mutatie gevalideerd door Sanger sequencing en paarse dozen duiden nonsynonymous somatische mutaties, waargenomen in de Illumina gegevens met geen enkele poging om te bevestigen door Sanger sequentiebepaling. Amino veranderingen worden genoteerd in de vakken en de veranderingen die leiden tot verlies of winst van een stopcodon in rode tekst.
Sequencing gegevens blijkt een hoge concordantie met genotypering
Sequencing bibliotheek voorbereiding mislukt voor zes van de oorspronkelijke 50 kanker monsters en veertien van de oorspronkelijke gematched normale monsters. Daarom werden twee gelijke paren toegevoegd aan de analyse, wat resulteert in een dataset van 44 kanker monsters, 36 met aangepaste normale paren (extra bestand 1 tabel S1). De beoogde regio opgenomen 3.28 MB tegenover 6.547 unieke exons in 384 genen (extra bestand 2 tabel S2). Mediaan dekking in alle monsters bedroeg 88,3% en daalde tot 74% wanneer vereist minimale dekking van 20. Alle sequencing werd uitgevoerd met een minimum van 110x gemiddelde read dekking in de verrijkte genomische regio's uitgevoerd voor elk monster. Het leest waren gericht tegen het menselijk genoom en varianten van de referentie-genoom werden genoemd. Als een controle, een analyse te vergelijken genotypering van oproepen van de Affymetrix V6 SNP arrays en de Illumina sequencing werd uitgevoerd. De gebieden gericht voor sequentie bevatte 1005 loci waarop de Affymetrix V6 SNP arrays. Zonder filtering van de sequencing variant vraagt ​​om kwaliteit metrics, de mediaan overeenkomst tussen de genotypering en sequencing resultaat was 97,8% met een bereik van 65-99% (extra bestand 6a, figuur S3a). De rauwe totale genotype oproep concordantie was 96,8%. Kwaliteit metrics werden gekozen om de overeenkomst tussen de genotypering en sequencing gesprekken te maximaliseren terwijl het minimaliseren van valse negatieven. De meest informatieve metrische was consensus kwaliteit en een cut-off van ≥50 resulteerde in verlies van ongeveer 10% van de gedeelde genotypes, maar een algemene 2% stijging van de concordantie tot 98,7% (extra bestand 6b, figuur S3b). Variant genotype gesprekken werden geïsoleerd voor verdere concordantie analyse. In deze reeks, een variant kwaliteit drempel van > 0 verhoogde nauwkeurigheid van variant genotype oproepen tot 98,9% (extra bestand 6c, figuur S3C). Wanneer zowel de kwaliteit drempels de mediane steekproef concordantie werden toegepast, is 99,5% (extra bestand 6d, figuur S3D), die binnen het gebied van genotypering reeks fouten. Zes monsters (08362T1, 08373T2, 336MHAXA, 08337T1, 89362T2, DV41BNOH) had een concordantie van < 98% en twee van deze (08393T2 en DV41BNOH) had een concordantie van 82% en 88% respectievelijk. Dus met een consensus kwaliteit ≥ 50 en een variant kwaliteit > 0, de valse positieve bedroeg 0,5% en 1,6% voor de referentie-genotypes en variant genotypen, respectievelijk (extra bestand 6e figuur S3E).
Vanuit alle single nucleotide veranderingen passeren van de bovengenoemde drempels, alle varianten aanwezig zijn in een van de normale monsters of het polymorfisme databases van dbSNP (v130) en 1000 genomen werden verondersteld kiemlijn varianten en weggegooid worden. Varianten alleen aanwezig in de exons van kankermonsters uitgegaan somatisch te zijn en behouden. 18.549 somatische varianten werden gedetecteerd in totaal over alle 44 monsters (extra bestand 7 Tabel S4), 3357 werden voorspeld exon en nonsynonymous te zijn. Prioriteit voor mutaties met functionele gevolgen we allemaal verder te concentreren analyses nonsynonymous mutaties en benadrukt mutaties die leiden tot verlies of winst van stopcodons. We hebben de SIFT algoritme toegepast [48] om aminozuurveranderingen die niet in de evolutie verdragen en zijn dus meer waarschijnlijk een functie van het eiwit beïnvloeden voorspellen 1509 somatische synonieme mutaties SIFT een score van < 0,05. Het tarief van de mutaties met SIFT score < 0,05 per gen, gecorrigeerd voor CDS lengte berekend (4). Figuur 4 toont, de genen met de hoogste concentratie van lage SIFT scoren mutaties waren S1PR2
, LPAR2
, SSTR1
, TP53
, GPR78
en RET
, met S1PR2 het meest de extreme. Er zijn vijftien mutaties met SIFT score < 0,05 over de 353aa CDS van S1PR2
, geconcentreerd in negen monsters. S1PR2
ook bekend als EDG5
codeert voor een G-eiwit-gekoppelde receptor en activeert S1P RhoGEF, LARG
[49]. Er is weinig bekend van haar rol in kanker en somatische mutaties zijn niet waargenomen in de 44 weefsels gesequenced voor S1PR2
in de COSMIC-database [50]. Figuur 4 Bar grafiek van snelheid van schadelijke mutaties over gen gesequenced. Genen gesequenced worden getoond op de x-as. Het aantal schadelijke somatische nonsynonymous mutaties waargenomen in elk gen /aantal aminozuren in elk CDS in uitgezet.
Sequencing data wordt bevestigd door Sanger sequencing
Sommige nonsynonymous somatische mutaties werden geselecteerd om te worden bevestigd door Sanger sequentiebepaling. Alle mutaties gerapporteerd in blauw in figuur 3 werden bevestigd door Sanger sequentiebepaling en werden bevestigd door sequentiebepaling van somatische de wildtype sequentie in de overeenkomende normaal weefsel (zie Figuur 8 extra bestand S4 bijvoorbeeld sequentiebepaling sporen). Hoewel 74% werden bevestigd, werden er mutaties gedetecteerd in de Illumnia sequentiebepaling niet bevestigd somatische mutaties door Sanger sequentiebepaling. Zestien van de 68 (24%) mutaties we probeerden te bevestigen waren aanwezig in de normale en kanker sample, dit zijn kiemlijn mutaties maar niet in een van de normale monsters gedetecteerd door Illumina sequencing en evenmin vertegenwoordigd dbSNP of 1000 genomen data. Vijf van de zestien kiemlijn mutaties waren uit monsters kanker met geen overeen normaal weefsel in de dataset, de overige elf kwam kankermonsters met matchende normaal weefsel sequentie in de dataset. Dit getuigt van een tarief van kiembaan besmetting niet geëlimineerd door de aangepaste normale controles of de vergelijking met bekende polymorfisme databases. Het kan zijn dat het bereik van de substituties in het normale weefsel gebeurt lager dan in de kanker monster en dus sommige kiemlijn mutaties, ondanks de somatische filters. Twee van de 68 (3%) mutaties we probeerden te bevestigen waren niet in de normale of kanker monster door Sanger sequentiebepaling. Een oorzaak zou kunnen zijn valse positieven in de Illumnia gegevens als gevolg van artefact; echter extra bestand 6 Figuur S3 toont de valse positieve tarief te laag zijn in ieder geval voor die varianten vertegenwoordigd op de Affymetrix V6 arrays. Een andere mogelijkheid is dat deze aanwezig zijn in een subset van het monster onder de gevoeligheid van de Sanger methode maar gedetecteerd door de Illumina sequencing zijn. Daarom mutaties gerapporteerd in de Illumina sequencing worden ook vermeld in paars in figuur 3, is enige voorzichtigheid geboden bij het interpreteren dit resultaat als zij kunnen kiemlijn polymorfismen of slechts in een subset van de tumor monster.
Veranderingen in de RAS /RAF /MEK /ERK pathway
Drie tumormonsters KRAS
genetische veranderingen (figuur 3) suggereert therapeutische kans voor behandeling met MEK remmers. Een van deze wijzigingen is een G12D mutatie. KRAS
G12D mutaties aangetoond carcinogenese en tumor overleving [51] initiëren. Amplificatie en overexpressie van wild-type KRAS
werd gezien in de andere 2 monsters. KRAS
amplificatie werd eerder waargenomen bij 5% van de primaire maagkanker. Maagkanker cellijnen met wild-type KRAS
versterking tonen constitutieve KRAS
activering en gevoeligheid voor KRAS
RNAi knock-down [24]. Een nieuwe mutatie in KRAS
werd ook waargenomen; . (Bij voorbeeld 08.393) de functionele consequentie onbekend Ondernemingen De PIK3CA
mutatie co-voorkomende KRAS
G12D, is bekend de gevoeligheid beïnvloeden MEK remmers [25]; Daarnaast kunnen nieuwe mutaties in deze studie ook gevolgen hebben voor dezelfde klasse van therapeutische middelen. Bijvoorbeeld: KSR2
functioneert als een moleculaire scaffold aan ERK signalering [52, 53] te bevorderen. Daarom mutaties in KSR2
zoals gezien in zeven monsters kan de gevoeligheid beïnvloeden MEK remmers. Een tweede voorbeeld is ULK1
, die positief controleert autofagie stroomafwaarts van mTOR [54] en is gemuteerd in veertien monsters. Autofagie verhoogd met ERK fosforylatie bij maagkanker cellen worden behandeld met een proteasoominhibitor [55] derhalve mutaties in ULK1
kunnen gevoeligheid voor proteasoom inhibitor behandelingen beïnvloeden, zoals bortezomib als monotherapie of in combinatie met MEK remmers.
Veranderingen in de PI3K /AKT-route
Er was aanzienlijke sequentie-verstoring van de fosfoinositide-3-kinase (PI3K) route genen in het sample set. Er zijn een aantal PI3K /AKT /mTOR remmers in klinische ontwikkeling en patiënten met activerende mutaties in de route zijn kandidaten voor behandeling [56]. PIK3CA
mutaties van bekende oncogeniteitsstudie werden gevonden in vier monsters. Dit resulteert in een frequentie van PIK3CA
hotspot mutatie van 9%, iets hoger dan eerdere schattingen van 6% (12/185) [27] en 4,3% (4/94) [57]. De gemeenschappelijke PIK3CA hotspot mutaties van bekende oncogeniciteitsstudie (E545K en H1047R) [58] werden twee keer per waargenomen. Een andere mutatie in PIK3CA
K111E, die ook eerder is waargenomen in vier monsters in de kosmische, was ooit en potentieel nieuwe somatische mutaties waargenomen werden waargenomen bij twee andere monsters.
Vijf nonsynonymous AKT1
mutaties waargenomen. Hoewel AKT1
mutaties komen voor in ongeveer 2% van alle kankers zijn ze vooral optreden bij aminozuur 15 en het functionele belang van mutatie op andere plaatsen is niet bekend. Andere synonieme mutatie in AKT2
waargenomen in monster 08407. AKT2
mutaties veel zeldzamer dan AKT1
mutaties, hoewel een AKT2
mutatie eerder in maagcarcinoom waargenomen met een frequentie 2% [ ,,,0],59]. Tenslotte mutatie van PTEN golfreizen of mTOR
kunnen de respons op remmers pathway beïnvloeden. Verschillende PTEN
mutaties worden genoteerd en mTOR
mutaties zijn frequent.
Veranderingen in receptortyrosinekinasen
De receptortyrosinekinasen (RTK) en drug targets EGFR
, ERBB2
en MET
werden elk versterkt (log2 > 0,6) en tot overexpressie op het RNA-niveau in een monster van kanker. Hieruit volgt dat de tumoren gevoelig voor de remmers van de geamplificeerde RTK's zijn. Bovendien worden meerdere synonieme mutaties waargenomen in de coderende regio. Stroomafwaarts mutaties zou verwachten dat reactie beïnvloeden. Bijvoorbeeld, in de BMO
geamplificeerd monster een afkappen mutatie in Akt3
kan de gevoeligheid beïnvloeden BMO-remmers.
FGFR2
wordt versterkt en RNA overexpressie in twee monsters, zijn er ook meerdere mutaties in FGFR1
-4. Breed bereik RTK-remmers, die FGFR richten onder andere kinasen kunnen
werkzaam zijn bij deze patiënten [60, 61] zijn. Veranderingen in celcyclusproteïnen Ondernemingen De viraal oncogeen homoloog SRC
gemuteerd in vier van de tumor monsters, twee van de mutaties wordt voorspeld dat een schadelijke werking waaronder introductie van een stopcodon hebben. Dit kan tegen-duiden SRC-remmers. BMO
versterking is ook een bekende weerstand marker voor anti-SRC therapeutica zoals dasatanib [62, 63]. De celcyclus-gerelateerde kinase, werd AURKA
versterkt en overexpressie in een monster. AURKA remmers zijn in ontwikkeling voor vaste tumoren [37] en kan daarbij worden vermeld. CCNE1
werd versterkt in twee monsters (08.390 en 08.357). Hoge niveaus van CCNE1
bleken vaak geassocieerd met vroege maagkanker en metastase maar expressieniveaus niet correleren met overleving [64, 65]. Hoge CCNE1
niveaus zijn voorgesteld als een gevoeligheid marker voor de gen-gerichte pro-drug-enzym geactiveerd therapieën [66]
Activering van Wnt-route is gebruikelijk in de carcinoom monsters
Mutaties in het APC werden waargenomen
gen in 22 monsters. APC is een tumor suppressor bekend om CTNNB1 en wnt pathway signalering te activeren, onder andere effecten [67]. De wnt pathway is eerder gevonden vaak worden geactiveerd bij maagkanker [68]. We gebruikten een transcriptionele handtekening gegenereerd uit eerdere studies [69, 70] en die tegen de globale Instituut MSigDB database om de proefmonsters classificeren op basis van hun wnt transcriptionele handtekeningen. Figuur 5A toont een warmte-kaart van de transcriptie niveaus van het WNT handtekening genen in de datasets. Activering van deze route is hoger in bijna alle kanker monsters vergeleken met de normale monsters. Wnt-remmers zijn het onderwerp van intensief onderzoek in de farmaceutische en wetenschappelijk onderzoek [71-73]. Deze resultaten suggereren zij voorbehoud bij maagkanker evenals vele andere kankers. Figuur 5 Transcriptionele handtekeningen over monsters. Geclusterd heatmap toont expressie van een handtekening wnt-genen en B handtekening hedgehog genen in monsters in de studie. Alle uitdrukking waarden zijn Zscore genormaliseerd. Zscore < -1 zijn blauw, Z-score > 1 is rood met een gegradeerde kleuring met wit aan 0. Voorbeeld namen op de x-as, worden ze geclusterd expressiepatroon en monsters met hoge scores zijn handtekening naar rechts. Monsters met somatische nonsynonymous APC mutaties (A) of PTCH1 mutaties (B) en aangeduid met een sterretje boven de heatmaps. WNT handtekening genen (boven naar beneden): FSTL1, DACT1, CD99, LMNA, SERPINE1, TNFAIP3, GNAI2, ID2, MVP, ACTN4, CAPN1, LUZP1, MTA1, RPS19, PTPRE, AXIN2, NKD2, SFRS6, CCND1, SCAP, CPSF4 , SENP2, DKK1, PRKCSH, SLC1A5, HDGF, CBX3, SCML1, PCNA, RPS11, SNRPA1, TGM2, LY6E, IFITM1, NSMAF, TCF20, BCAP31, AXIN1, AGRN, PLEKHA1, SLC2A1, CTNNB1, EIF5A, IMPDH2, GSK3B, PFN1 , UBE, MAP3K11, ARHGDIA, HNRPUL1, FLOT2, GYPC, NCOA3, CENTB1, Syk, POLR2A, KRT5, DHX36, ELF1, SMG2, FGD6, MAPKAP1, LOC389435, RPL27A, SRP19, RPL39L, SFRS2IP, FUSIP1
; Hedgehog handtekening genen (boven naar beneden):. LRFN4, JAG2, RPL29, WNT5A, SNAI2, FST, MYCN, BMP4, CCND1, BMI1, CFLAR, PRDM1, GREM1, FOXF1, CCND2, CD44
Activering van de hedgehog route is ook gebruikelijk in het carcinoom monsters
PTCH1
een tumor suppressor en fungeert als een receptor voor de hedgehog liganden en de functie van smoothened remt. Wanneer smoothened bevrijd, ontvangen Het intracellulair leidt tot de activering van de GLI transcriptiefactoren [74]. Meerdere somatische mutaties van PTCH1
zijn opgenomen in de kosmische, in overeenstemming met zijn tumor suppressor rol. De D362Y mutatie waargenomen in deze studie in voorbeeld FICJG, in het vierde transmembraandomein van PTCH1 en vooraf als een loss-of-function kiemlijn mutatie in een patiënt met Gorlin syndroom predispositie voor neoplasmen (genummerd D513Y door verschillende transcript ) [75].

• Neerwaartse regulatie van de SPARC-expressie afneemt maagkanker cellulaire invasie en overleving
• BRCAA1 monoklonaal antilichaam geconjugeerd fluorescerende magnetische nanodeeltjes voor in vivo doelgerichte magnetofluorescent beeldvorming van de maag cancer