secuenciación profunda del carcinoma gástrico revela mutaciones somáticas relacionadas con medicine

personalizados secuenciación profunda del carcinoma gástrico revela mutaciones somáticas relacionadas con la medicina personalizada
Resumen Antecedentes

A nivel mundial, el cáncer gástrico es la segunda causa más común de muerte relacionada con el cáncer , con la mayor parte de la carga de salud que soportan los países económicamente menos desarrollados.
Métodos
Aquí, se presenta una caracterización genética de las 50 muestras de adenocarcinoma gástrico, usando vectores Affymetrix SNP y Illumina arrays de expresión de mRNA, así como la secuenciación de Illumina de las regiones codificantes de 384 genes pertenecientes a diversas vías conocidas para ser alterado en otros tipos de cáncer.
Resultados
las alteraciones genéticas se observaron en el WNT, Hedgehog, ciclo celular, daño del ADN y epitelial a mesenquimal transición vías Conclusiones.

los datos sugieren que las terapias dirigidas aprobados o en desarrollo clínico para el carcinoma gástrico serían de beneficio para ~ 22% de los pacientes estudiados. Además, las nuevas mutaciones detectadas aquí, pueden influir en la respuesta clínica y proponer nuevos objetivos para el descubrimiento de fármacos.
Antecedentes
pesar de la reciente disminución de las tasas de mortalidad por cáncer gástrico en América del Norte y en la mayor parte de Europa septentrional y occidental , cáncer de estómago sigue siendo una de las principales causas de muerte en todo el mundo y es común en Japón, Corea, Chile, Costa Rica, Federación de Rusia y otros países de la antigua Unión Soviética [1]. A pesar de las mejoras en las modalidades de tratamiento y la detección, el pronóstico de los pacientes con adenocarcinoma gástrico sigue siendo pobre [2]. Para entender la patogénesis y el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas, es esencial para diseccionar los mecanismos moleculares que regulan la progresión del cáncer gástrico. En particular, los mecanismos oncogénicos que pueden ser objetivo de la medicina personalizada. Comentario El término "adicción oncogén" para describir las células cancerosas altamente dependientes de un oncogén dado o vía oncogénico fue presentado por Weinstein [3, 4]. El concepto pone de relieve el desarrollo de terapias específicas que intentan inactivar un oncogén, crítica para la supervivencia de las células cancerosas, mientras que afectar a las células normales que no son adictos de manera similar.
Varios oncogenes activados a alta frecuencia en otros tipos de cáncer también se han demostrado para ser mutado en el cáncer gástrico. De ello se desprende que la terapéutica comercializados dirigidos a estos oncogenes se tratar con eficacia una proporción de carcinomas gástricos, ya sea como agentes únicos o en combinación. En enero de 2010, se aprobó el trastuzumab en combinación con quimioterapia para el tratamiento de primera línea del cáncer gástrico avanzado y metastásico ErbB2-positivo
. Trastuzumab es el primer agente dirigido para ser aprobado para el tratamiento del carcinoma gástrico y un aumento del 12,8% en la tasa de respuesta fue visto con la adición de trastuzumab a la quimioterapia en ErbB2 positivo
adenocarcinoma gástrico [5, 6]. Se ha estimado que 2 a 27% de los cánceres gástricos puerto ERBB2
amplificaciones y puede ser tratada con inhibidores de erbB2 [7, 8]. Del mismo modo, la sobreexpresión de otro receptor de tirosina quinasa (RTK) EGFR
, se ha observado en el cáncer gástrico y múltiples ensayos de EGFR
inhibidores en este tipo de cáncer están en curso (revisado en [9, 10]). Además, algunos cánceres gástricos albergan la amplificación de ADN o sobreexpresión de la MET RTK
[11, 12] y su paralogue MST1R
[13] y puede ser tratado con MET
o inhibidores MST1R
[14-20 ]. Por último, FGFR2
sobre la expresión y amplificación se ha observado en una pequeña proporción de los cánceres gástricos (escirrosos) [21] y los inhibidores han demostrado cierta eficacia en la clínica [22].
Aguas abajo de las RTK, KRAS
amplificación de tipo salvaje y la mutación también se ha encontrado en aproximadamente el 9-15% de los cánceres gástricos [23, 24] y puede ser tratados eficazmente con inhibidores de MEK [25, 26]. La activación de la vía PI3K /AKT /mTOR también se ha visto en 4-16% de cáncer gástrico [27-30] y así puede ser sensible a inhibidores de PI3K [31-34]. Del mismo modo, el ciclo celular quinasa AURKA
se ha demostrado para ser activado en el cáncer gástrico [35, 36] y los inhibidores de AURKA en desarrollo clínico [37] pueden tener un beneficio clínico.
Informes de la frecuencia de los diferentes tipos de activación oncogénica y sus co-ocurrencia son limitadas. En contraste con gastrointestinonal tumores estromales (GIST) que se caracterizan por una alta frecuencia de KIT
y PDGFRA
activación [38] y por lo tanto un tratamiento eficaz en la mayoría de imitanib y sunitinib [39, 40], aparece adenocarcinoma gástrico que es una enfermedad heterogénea molecularmente sin perturbación oncogénico de alta frecuencia descubierto hasta el momento. Esto se ilustra por una reciente encuesta de mutación somática en la codificación quinasa genes a través de 14 líneas celulares de cáncer gástrico y tres tejidos de cáncer gástrico que descubierto más de 300 nueva quinasa variaciones de nucleótidos individuales y variantes estructurales relacionadas quinasa. Sin embargo, se descubrió la mutación no muy frecuentemente recurrente o quinasa mutada [41]. Vaya con el objetivo de dilucidar el potencial para el tratamiento del carcinoma gástrico con terapias dirigidas ya sea en el mercado, en el desarrollo o por descubrir, que han caracterizado clínica muestras de carcinoma gástrico para detectar la activación de oncogenes.
tomamos un enfoque global mediante el análisis de las muestras de Affymetrix SNP arrays y arrays de expresión de ARNm de Illumina. Estas tecnologías son bien validados para la detección del genotipo, la variación del número de copias de ADN y el perfil de expresión del ARNm. Son susceptibles de muestras clínicas heterogéneas. Las muestras también fueron interrogados por la secuenciación de segunda generación (iluminación). Relativamente nuevas tecnologías de secuenciación de segunda generación ofrecen tanto un mayor rendimiento y capacidad de secuenciación de profundidad. Esto último es especialmente importante para la caracterización de las muestras de cáncer que tienden a incluir una mezcla de tipos de células incluyendo las células normales, la infiltración de la vasculatura y de células tumorales de diferentes genotipos. En este estudio se utilizó el enriquecimiento de destino y la tecnología de secuenciación Illumina para secuenciar las regiones de codificación de 384 genes. Decidimos favorecer la profundidad de la cobertura en una cobertura más amplia con el fin de capturar mutaciones presentes en subpoblaciones dentro de los tumores. Estudios recientes han demostrado cánceres tienden a albergar muchas mutaciones en un menor número de vías de señalización [42, 43], por lo tanto nos concentramos en genes en estas vías. También se incluyeron los genes que codifican para las proteínas previamente demostrado que afectan a la respuesta a las terapias dirigidas y más probabilidades de ser abordado con éxito por la intervención de moléculas pequeñas, ya que nuestro objetivo es encontrar maneras más eficaces y novedosos para el tratamiento de carcinoma gástrico.
Métodos
muestras de tejidos
muestras de ADN y ARN se obtuvieron de los hospitales en Rusia y Vietnam según la IRB aprobó protocolos y de IRB aprobó formularios de consentimiento para el análisis molecular y genética. Los propios centros médicos también tienen comités éticos internos con el protocolo revisado y los ICF. Las muestras se obtienen a través de soluciones de tejido Ltd http: //www. Tisulares soluciones com /.. Por características de la muestra ver archivo adicional 1 mesa S1
matrices
genotipos y copiar perfiles de número se generaron para cada muestra utilizando 1 g de ADN de ejecución de Affymetrix SNP V6 utilizando protocolos de Affymetrix. Copiar datos de la variación del número se analizó en el software http ArrayStudio: //www. Omicsoft com.. Los datos se normalizó utilizando el algoritmo de Affymetrix y segmentado utilizando CBS. Un perfil de transcripción se genera para cada muestra utilizando 1 g de ARN total de ejecución en Illumnia HG-12 arrays de expresión de ARN siguiendo los protocolos de Illumina. Los datos se analizaron en el software http Illumina GenomeStudio:.. //Www Illumina com /software /genomestudio_ software ILMN.. Como procedimiento de pre-procesamiento de datos, un conjunto de sonda única fue retenida si tiene un "presente" (es decir, dos desviaciones estándar por encima del fondo) llamar en al menos una de las muestras. Los valores de señal de la sonda fija restantes fueron transformados a escala logarítmica basada en 2 y se realizó la normalización cuantil. copias de ADN y los niveles de expresión de ARN fueron integrados a nivel del gen dentro del software http ArrayStudio: //www. Omicsoft com.. análisis de enriquecimiento vía se realizó dentro del paquete de análisis GeneGo MetaCore http: //www. GeneGo com /.. Todos los datos de la matriz de este estudio está disponible en GEO http: //www NCBI NLM NIH gov /geo /bajo el número de serie de la adhesión GSE29999
secuenciación del ADN profunda Targeted página 5..... g de ADN por PCR-enriquecida por los exones de codificación de cualquier transcripción conocido de 384 genes de interés (archivo adicional 2 tabla S2) utilizando la plataforma Raindance http:... //www gías raindancetechnol com /
Las bibliotecas de destino resultantes fueron secuenciados utilizando Illumnia GAII a una longitud de lectura de 54 nt. Secuencia lee fueron asignadas al genoma de referencia (hg18) utilizando el programa BWA [44]. Bases fuera de las regiones seleccionadas fueron ignorados al resumir las estadísticas de cobertura y las llamadas variantes. SAMtools se utiliza para analizar las alineaciones y realizar llamadas genotipo [45], y cualquier llamada que se desvía de la base de referencia se considera como una variante potencial. El paquete SAMtools genera estimaciones de calidad consenso y de calidad variante para caracterizar las llamadas genotipo. La exactitud del genotipo llamadas se estimó por la concordancia con el genotipo llamadas de la Affymetrix SNP microarrays 6.0. matrices de concordancia de las muestras basadas en datos de SNP y la secuencia se generaron para comprobar si hay un error de etiquetado de la muestra (archivo adicional 3 Figura S1). Concordancia y la cantidad de llamadas de genotipo fueron tabulados para los umbrales de calidad de consenso, la calidad de variante, y profundidad. El conjunto final de las llamadas variantes se identificaron utilizando calidad consenso mayor que o igual a 50 y la calidad variante mayor que 0. Para identificar exclusivamente cambios somáticos, sólo las mutaciones presentes en la muestra de cáncer y no se detectó en ninguna de las muestras normales se retuvieron. Como un filtro adicional para las variantes de la línea germinal, se eliminaron todas las variantes presentes en dbSNP y 1000 conjuntos de datos de polimorfismo del genoma.
Q-PCR
Q-PCR se realizó a través del protocolo estándar utilizando Fluidigm 48 * 48 matriz dinámica. En primer lugar, una corrida de validación se llevó a cabo utilizando ARN de control agrupados de tres ejemplares. Cuatro cantidades de ARN de entrada fueron probados (125 ng, 250 ng, 375 ng y 500 ng). Se obtuvieron los puntos de datos por triplicado para la dilución posteriormente 10 puntos de serie por cada condición por ensayo. Los mejores resultados globales fueron en 250 o 500 ng, que dio valores de eficiencia ~ 85%. Por lo tanto 250 ng cantidad de entrada para las muestras experimentales. Los datos se produce por triplicado y la media combinada. CT valores fueron convertidos a la abundancia usando la abundancia fórmula estándar = 10 (40-CT /3.5). Los datos de prueba se normalizó a amas de casa utilizando el método de análisis de covarianza con lo cual se utilizaron los dos amas de casa (GAPDH y beta-actina) para calcular una puntuación robusta y se utilizó la puntuación como covariable para ajustar los otros genes. El análisis de datos se realizó en el software Arraystudio.
Sanger de secuenciación de ADN genómico
cebadores de PCR fueron ordenados de IDT (Integrated DNA Technologies Inc, Coralville, Iowa). reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando Invitrogen Platnium polimerasa (Invitrogen, Carlsbad, CA). 50 ng de ADN genómico se amplificó durante 35 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos y 68 ° C durante 45 segundos. Los productos de PCR se purificaron usando Agencourt AmPure (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). La secuenciación directa de productos de PCR purificados con cebadores de secuenciación se realizaron con AB v3.1 BigDye-terminator kit de secuenciación de ciclo (Applied Biosystems, Foster City, CA) y las reacciones de secuenciación se purificaron usando Agencourt CleanSeq (Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA). Las reacciones de secuenciación se analizaron mediante un analizador genético 3730XL (Applied Biosystems, Foster City, CA). Todos los datos de los resultados de secuencias se reunió y analizó utilizando código de codones alineador (CodonCode Corporation, Dedham, MA).
: Resultados de la patrones de ADN y ARN de amplificación a través de las muestras son consistentes con estudios previos
En consonancia con la mayoría de los cánceres humanos, cambios de número de copia ocurrieron en todos los genomas de las 50 muestras de cáncer gástrico en comparación con muestras normales de la misma (Figura 1). Grandes regiones de amplificación frecuente fueron encontrados en regiones cromosómicas 8q, 13q, 20q y 20p. oncogenes conocidos MYC
y CCNE1
se encuentran en los 8q y 20p amplicones, respectivamente, y que probablemente contribuyen a una ventaja de crecimiento conferida por la amplificación. Estas ampliaciones se han observado en estudios previos en el cáncer gástrico junto a la amplificación de 20p para el que ZNF217
y TNFRSF6B
se han sugerido como candidato genes controladores [46]. Figura 1 Vista de las aberraciones de la CNV a través de todas las 50 muestras de carcinoma gástrico, para cada autosoma. El eje Y corresponde a la suma del número de cambios positivos o negativos para un segmento particular con la relación de log2 de los cambios. Las áreas con mayor o menor número de copia consistente a través de todas las muestras analizadas o cambios muy grandes en algunas muestras se mostrarán grandes tamaños positivas y negativas de cambio. Cada punto o segmento de la figura es de color por muestra. El código de color es arbitraria con cada uno de los 50 muestras de cáncer de ser asignado un color. segmentos amplificados incluyen el cromosoma 8q, 20q, 20p, 3q, 7p, y 1q.
Concordancia entre el aumento de número de copias de ADN y la expresión de ARN entre las muestras de cáncer fue evaluado y los 200 genes contenidos dentro de una región de ADN copia de alta frecuencia en muestras de cáncer y que tenían niveles elevados de ARNm (en comparación con el tejido normal correspondiente) se tabulan en la tabla 4 de ficheros adicionales S3. La mayoría de los genes en esta lista son de regiones cromosómicas 20q y 8q, lo que sugiere que estas amplificaciones tienen el mayor efecto sobre los niveles de ARNm, en la minoría son los genes para 20p, 3q, 7p, y 1q. La Figura 2 muestra los perfiles de ARN medido por Q-PCR de un gen ejemplar de cada región que muestra la sobreexpresión general en el cáncer gástrico, en particular en ciertas muestras. Además MYC Opiniones y CCNE1
, hay múltiples genes en estas regiones, que podrían contribuir a una ventaja de crecimiento de la célula cancerosa. Las vías biológicas enriquecido significativamente mayor para los genes amplificados y sobreexpresados ​​están involucrados en la regulación de la traducción (p = 0.000015) y el daño a reparar el ADN (p = 0,003). Las muestras con amplificaciones de estas regiones genómicas son anotados en la Figura 3. No existe una tendencia discernible para amplificaciones de estas regiones para co-producir ni de ser exclusiva. De acuerdo con un estudio previo [47], se amplificó el PERLD1
locus (dentro de la ErbB2
amplicón) en la muestra 08280 y MMP9
se sobreexpresa pero no visiblemente amplificado. También en la Figura 3 se indican las amplificaciones de ADN focales con la expresión del ARN de los genes concordantes que puedan afectar a la respuesta a las terapias dirigidas, por ejemplo, los datos subyacentes, véase el archivo adicional 5 figura S2. Figura 2 Expresión de ejemplo genes de cada región cromosómica amplificada a través de muestras de estudio confirmados por Q-PCR. Los puntos rojos indican las muestras de cáncer y los puntos blancos indican las muestras normales. El eje Y indica la abundancia de ARNm.
La figura 3 el perfil mutacional de muestras. Las muestras de tejido se muestran en la parte superior y las anotaciones correspondientes a ellos están en las columnas de abajo. Red de cajas indican la amplificación de ADN y la sobreexpresión de ARNm concordante, cajas de naranja denotan RNA sobreexpresión sin evidencia de la amplificación de ADN, puntos rojos indican la pérdida de ADN. cajas azules denotan mutación no sinónima somática validado mediante secuenciación Sanger y cajas púrpura denotan mutaciones somáticas no sinónimas, observadas en los datos Illumina sin ningún intento de confirmar mediante secuenciación de Sanger. cambios aminoácidos se indican en las cajas y los cambios que llevan a la pérdida o ganancia de un codón de parada están en rojo.
datos de secuenciación muestra alta concordancia con el genotipado
Secuenciación preparación biblioteca falló para seis de los originales 50 muestras de cáncer y catorce de las muestras normales emparejados originales. Por lo tanto se añadieron dos pares más coincidentes con el análisis, lo que resulta en un conjunto de datos de 44 muestras de cáncer, 36 con pares normales emparejados (archivo adicional 1 mesa S1). La región en estudio incluyó 3,28 MB a través de 6.547 exones únicos en 384 genes (archivo adicional 2 tabla S2). la cobertura mediana de en todas las muestras fue de 88.3% y se redujo a 74% cuando se requiere una cobertura mínima de 20. Toda la secuenciación se llevó a cabo con un mínimo de 110x cobertura promedio de lectura a través de las regiones genómicas enriquecidas para cada muestra. Las lecturas fueron alineados en contra del genoma humano y variantes del genoma de referencia se llama. Como control, un análisis para comparar el genotipado de las llamadas de los vectores Affymetrix SNP V6 y se llevó a cabo la secuenciación de Illumina. Las regiones seleccionadas para la secuenciación de contenidos 1005 loci cubierto por los vectores Affymetrix SNP V6. Sin filtrado de la variante de la secuencia exige métricas de calidad, el acuerdo entre la mediana y la determinación del genotipo de secuenciación resultados fue del 97,8% con un rango de 65-99% (de ficheros adicionales 6a, Figura S3a). La concordancia general prima genotipo llamada era del 96,8%. Las métricas de calidad fueron elegidos para maximizar el acuerdo entre el genotipo y secuenciación de las llamadas y reducir al mínimo los falsos negativos. La métrica más informativo fue la calidad consenso y un punto de corte de ≥50 dieron como resultado la pérdida de aproximadamente el 10% de los genotipos comunes, pero un incremento global del 2% en concordancia con el 98,7% (6b archivo adicional, la figura S3b). Se aislaron las llamadas variantes genotípicas para su posterior análisis de concordancia. En este conjunto, un umbral de calidad variante de > 0 aumentar la precisión de las llamadas variantes genotípicas al 98,9% (6c archivo adicional, la figura S3c). Cuando ambos umbrales de calidad se aplicaron la concordancia de la muestra promedio es del 99,5% (6d archivo adicional, la figura S3d), que se encuentra dentro de la región de errores en la matriz de genotipificación. Seis muestras (08362T1, 08373T2, 336MHAXA, 08337T1, 89362T2, DV41BNOH) tuvieron una concordancia de < 98% y dos de ellos (08393T2 y DV41BNOH) tuvieron una concordancia del 82% y 88%, respectivamente. Por lo tanto, con una calidad de consenso ≥ 50 y una calidad variante > 0, la tasa de falsos positivos fue de 0,5% y 1,6% para los genotipos de referencia y de los genotipos variantes, respectivamente (archivo adicional 6e Figura S3E).
De todos los cambios de un solo nucleótido que pasan los umbrales anteriores, todas las variantes presente en ninguna de las muestras normales o en las bases de datos de polimorfismo de dbSNP (V130) o 1000 genomas se suponía que eran variantes de la línea germinal y se desecha. Variantes presentes sólo en los exones de muestras de cáncer se supone que somática y retenidos. Se detectaron 18.549 variantes somáticas en total en todas las 44 muestras (archivo adicional 7 Tabla S4), 3357 se prevé que ser exonic y no sinónimo. Dar prioridad a las mutaciones con impacto funcional nos concentramos toda ulterior análisis sobre las mutaciones no sinónimas y mutaciones resaltados que conducen a la pérdida o ganancia de los codones de parada. Hemos aplicado el algoritmo SIFT [48] para predecir los cambios de aminoácidos que no son tolerados en la evolución y por lo tanto tienen más probabilidades de afectar a la función de la proteína, 1509 mutaciones no sinónimas somáticas tienen una puntuación SIFT de < 0.05. La tasa de mutaciones con puntuación SIFT < 0,05 por gen, corregido para la longitud de CDS se calculó (4). La figura 4 muestra, los genes con la mayor concentración de mutaciones que califican bajo SIFT eran S1PR2
, LPAR2
, SSTR1
, TP53
, GPR78
y RET
, con S1PR2 siendo más extremo. Hay quince mutaciones con puntuación SIFT < 0,05 en todo el 353aa CDS de S1PR2
, concentradas en nueve muestras. S1PR2
también conocido como EDG5
codifica para un receptor acoplado a proteína G de S1P y activa RhoGEF, LARG
[49]. Poco se sabe de su papel en el cáncer y mutaciones somáticas no se han observado en los 44 tejidos secuenciados para S1PR2 Hoteles en la base de datos COSMIC [50]. Figura 4 Diagrama de barras de la tasa de mutaciones deletéreas a través de genes secuenciados. Los genes secuenciados se muestran en el eje x. El número de mutaciones no sinónimas somáticas nocivos observados en cada gen /número de aminoácidos en cada CDS en trazado.
Datos de secuenciación se confirmó mediante secuenciación de Sanger
Se seleccionaron las mutaciones somáticas no sinónimas ser confirmadas por secuenciación de Sanger. Todas las mutaciones reportadas en azul en la Figura 3 se confirmaron mediante secuenciación de Sanger y también se confirmó que eran somática mediante secuenciación de la secuencia de tipo salvaje en el tejido normal correspondiente (ver ficheros adicionales 8 Figura S4 en busca de rastros de secuenciación ejemplo). Aunque el 74% fueron confirmados, algunas mutaciones detectadas en la secuenciación Illumnia no fueron confirmados como mutaciones somáticas por secuenciación de Sanger. Dieciséis de los 68 (24%) mutaciones se intentó confirmar estaban presentes en la muestra normal y el cáncer, estas son mutaciones de línea germinal, pero no se detectó en ninguna de las muestras normales por secuenciación de Illumina y también no representados en dbSNP o 1000 de datos genomas. Cinco de los diez y seis mutaciones germinales eran de muestras de cáncer sin tejido normal correspondiente incluido en el conjunto de datos, los otros once procedían de muestras de cáncer con la secuencia de tejido normal correspondiente incluido en el conjunto de datos. Esta evidencia una tasa de contaminación de la línea germinal no eliminado por los controles normales de la misma o la comparación con bases de datos de polimorfismos conocidos. Puede ser que la cobertura de las sustituciones en el tejido normal pasa a ser menor que en la muestra de cáncer y por lo que algunas mutaciones de la línea germinal permanecen a pesar de los filtros somáticas. Dos de los 68 (3%) mutaciones se intentó confirmar no estaban presentes en la muestra normal o cáncer mediante secuenciación de Sanger. Una de las causas podría ser falsos positivos en los datos debido a Illumnia artefacto; Sin embargo la disposición 6 Figura S3 muestra la tasa de falsos positivos a ser baja al menos para aquellas variantes representadas en los vectores Affymetrix V6. Otra posibilidad es que estos están presentes en un subconjunto de la muestra por debajo de la sensibilidad de la metodología de Sanger pero detectado por la secuenciación de Illumina. Por lo tanto, también se informó de mutaciones reportadas en la secuenciación de Illumina, de color morado en la figura 3, una cierta precaución se justifica
al interpretar estos resultados, ya que pueden ser polimorfismos de la línea germinal o presente sólo en un subconjunto de la muestra de tumor. Las alteraciones en el RAS /RAF MEK ERK vía //
Tres muestras tumorales tenían KRAS
alteraciones genéticas (Figura 3), sugiriendo oportunidad terapéutica para el tratamiento con inhibidores de MEK. Una de estas alteraciones es una mutación G12D. KRAS
mutaciones G12D se han demostrado para iniciar la carcinogénesis y la supervivencia del tumor [51]. La amplificación y sobreexpresión de tipo salvaje KRAS
se observó en las otras 2 muestras. KRAS
amplificación se ha observado antes en el 5% de los cánceres gástricos primarios. líneas celulares de cáncer gástrico con KRAS de tipo salvaje
muestran la amplificación del gen KRAS constitutivos
activación y sensibilidad a KRAS
RNAi desmontables [24]. También se observó una nueva mutación en el gen KRAS
; . (En la muestra 08393) la consecuencia funcional es desconocida México La mutación PIK3CA
co-produciendo con KRAS
G12D, se sabe que afectan a la sensibilidad a los inhibidores de MEK [25]; Además, nuevas mutaciones observadas en este estudio también pueden tener consecuencias para la misma clase de productos terapéuticos. Por ejemplo: KSR2
funciona como un andamio molecular para promover la señalización de ERK [52, 53]. Por lo tanto, las mutaciones en KSR2
tal como se ve en siete muestras puede afectar a la sensibilidad a los inhibidores de MEK. Un segundo ejemplo es ULK1
, que controla positivamente la autofagia aguas abajo de mTOR [54] y está mutado en catorce muestras. La autofagia se aumenta junto con la fosforilación de ERK cuando las células de cáncer gástrico se tratan con un inhibidor del proteasoma [55], por lo tanto, las mutaciones en ULK1
pueden afectar a la sensibilidad a los tratamientos inhibidores de proteasomal como bortezomib como agente único o en combinación con inhibidores de MEK.
las alteraciones de la vía PI3K /AKT
Hay fue sustancial interrupción de la secuencia de los genes de la vía fosfoinositida-3-quinasa (PI3K) en el conjunto de la muestra. Hay un número de AKT /inhibidores de PI3K /mTOR en desarrollo clínico y pacientes con la activación de mutaciones en la vía son candidatos para el tratamiento [56]. PIK3CA mutaciones
de oncogenicidad conocidos fueron encontrados en cuatro muestras. Esto da lugar a una frecuencia de mutación PIK3CA
punto de acceso del 9%, ligeramente superior a las estimaciones previas de 6% (12/185) [27] y el 4,3% (4/94) [57]. Las mutaciones de punto de acceso común de PIK3CA oncogénico conocido (E545K y H1047R) [58] se observaron dos veces cada uno. Se observó otra mutación en PIK3CA
K111E, que también se ha observado antes en cuatro muestras en COSMIC, una vez y, potencialmente, nuevas mutaciones somáticas se observaron en dos muestras más. Se observaron
Cinco AKT1 nonsynonymous
mutaciones. Aunque AKT1
mutaciones se encuentran en aproximadamente el 2% de todos los cánceres, que se producen principalmente en el aminoácido 15 y la importancia funcional de la mutación en otros sitios es desconocida. Se observó otra mutación no sinónima en AKT2
en la muestra 08407. AKT2
mutaciones son mucho menos frecuentes que AKT1
mutaciones, aunque un AKT2
mutación se ha observado antes en el carcinoma gástrico, a una frecuencia de 2% [ ,,,0],59]. Finalmente mutación del PTEN
o mTOR
pueden afectar la respuesta a los inhibidores de la vía. Varias mutaciones de PTEN
se observan y mTOR
mutaciones son frecuentes.
Las alteraciones en los receptores de tirosina quinasas Empresas El receptor tirosina quinasas (RTK) y Drug Targets EGFR
, ErbB2
y MET
fueron cada amplificado (log2 > 0,6) y se sobreexpresa en el nivel de ARN en una muestra de cáncer. De ello se desprende que los tumores pueden ser sensibles a los inhibidores de las RTK amplificados. Además, las mutaciones no sinónimas múltiples se observan en sus regiones codificantes. Se esperaría que las mutaciones aguas abajo de influir en la respuesta. Por ejemplo, en el MET
muestra amplificada una mutación truncar en Akt3
puede afectar a la sensibilidad a los inhibidores de MET.
FGFR2
se amplifica y sobreexpresa ARN en dos muestras, también hay múltiples mutaciones en FGFR1
-4. inhibidores de RTK Amplia gama, que se dirigen FGFR entre otras quinasas, pueden ser eficaces en estos pacientes [60, 61].
Las alteraciones en la célula Proteínas de Ciclo Francia El oncogén viral homólogo SRC
está mutado en cuatro de tumor muestras, dos de las mutaciones se predice que tienen un efecto perjudicial incluida la introducción de un codón de parada. Esto puede indicar el contraataque, inhibidores de SRC. MET
amplificación es también un marcador de resistencia conocido para la terapéutica anti-SRC como dasatanib [62, 63]. La quinasa relacionada con el ciclo celular, AURKA
se amplifica y se sobreexpresa en una muestra. inhibidores AURKA están en el desarrollo de tumores sólidos [37] y pueden estar indicados en este caso. CCNE1
se amplificó en dos muestras (08390 y 08357). Los altos niveles de CCNE1
se ha demostrado que se asocia frecuentemente con el cáncer gástrico temprano y los niveles de expresión de metástasis, pero no se correlacionan con la supervivencia [64, 65]. Los altos niveles de CCNE1
se han sugerido como un marcador de sensibilidad para los pro-drogas terapias activados por enzimas dirigidos a genes [66]
activación de la vía Wnt es común en las muestras de carcinoma
se observaron mutaciones en el APC
de genes en 22 muestras. APC es un gen supresor tumoral conocido para activar CTNNB1 y la señalización de Wnt, entre otros efectos [67]. La vía Wnt se ha encontrado previamente para ser activado con frecuencia en el cáncer gástrico [68]. Se utilizó una firma transcripcional, generada a partir de estudios anteriores [69, 70] y está disponible en la base de datos del Instituto Broad MSigDB para clasificar las muestras de estudio por sus firmas transcripcional de Wnt. La Figura 5A muestra un mapa de calor de los niveles de transcripción de los genes de la firma de Wnt en los conjuntos de datos. La activación de esta vía es superior en casi todas las muestras de cáncer en comparación con las muestras normales. inhibidores de Wnt son objeto de intensa investigación en la investigación académica [71-73] y farmacéutica. Estos resultados sugieren que tendrán una indicación en el cáncer gástrico, así como muchos otros tipos de cáncer. Figura 5 firmas de la transcripción a través de muestras. mapa de calor en clúster que muestra la expresión de un firma genes Wnt y B firma genes erizo, a través de muestras en el estudio. Todos los valores de expresión son Zscore normalizado. Zscore < -1 son azules, Z-score > 1 son de color rojo con una coloración blanca a través graduada en 0. Los nombres de las muestras están en el eje x, que se agrupan por el patrón de expresión y muestras con altas puntuaciones de la firma están a la derecha. Las muestras con mutaciones somáticas no sinónimas de APC (A) o mutaciones PTCH1 (B) y denotado por un asterisco encima de la heatmaps. WNT firma genes (de arriba a abajo): FSTL1, DACT1, CD99, LMNA, SERPINE1, TNFAIP3, GNAI2, ID2, MVP, ACTN4, capn1, LUZP1, MTA1, RPS19, PTPRE, AXIN2, NKD2, SFRS6, CCND1, SCAP, CPSF4 , SENP2, DKK1, PRKCSH, SLC1A5, HDGF, CBX3, SCML1, PCNA, RPS11, SNRPA1, TGM2, LY6E, IFITM1, NSMAF, TCF20, BCAP31, AXIN1, AGRN, PLEKHA1, SLC2A1, CTNNB1, eIF5A, IMPDH2, GSK3B, PFN1 , UBE, MAP3K11, ARHGDIA, HNRPUL1, FLOT2, GYPC, NCOA3, CENTB1, SYK, POLR2A, KRT5, DHX36, Elf1, SMG2, FGD6, MAPKAP1, LOC389435, RPL27A, SRP19, RPL39L, SFRS2IP, FUSIP1
; Erizo de la firma genes (arriba a abajo):. LRFN4, JAG2, RPL29, WNT5A, SNAI2, FST, MYCN, BMP4, CCND1, IMC1, CFLAR, PRDM1, GREM1, FOXF1, CCND2, CD44
La activación de la vía hedgehog también es común en las muestras de carcinoma
PTCH1
es un supresor de tumores y actúa como un receptor para los ligandos de hedgehog y inhibe la función de alisado. Cuando smoothened se libera, se señales intracelularmente conduce a la activación de los factores de transcripción GLI [74]. Múltiples mutaciones somáticas de PTCH1
se registran en cósmico, en consonancia con su función supresora de tumores.

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