PLOS ONE: Analys av avreglerade mikroRNA och deras målgener i Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

MicroRNAs (miRNA) är allmänt studerade icke-kodande RNA som modulerar genuttryck. MiRNA avregleras i olika tumörer inklusive magcancer (GC) och har potentiella diagnostiska och prognostiska konsekvenser. Syftet med vår studie var att bestämma miRNA profil i GC vävnader, följt av utvärdering av avreglerade miRNA i plasma av GC patienter. Användning av tillgängliga databaser och bioinformatiska metoder vi syftar också att utvärdera potentiella målgener av bekräftad differentiellt uttryckta miRNA och validera dessa fynd i GC vävnader.

Metoder

I studien ingick 51 GC patienter och 51 kontroller. Initialt screenades vi miRNA uttrycksprofilen i 13 vävnadsprover av GC och 12 normala mag vävnader med TaqMan låg densitet array (TLDA). I det andra steget, var differentiellt uttryckta miRNA valideras i ett replikerings kohort med hjälp av QRT-PCR i vävnads och plasmaprover. Därefter analyserade vi potentiella målgener av avreglerade miRNA använder bioinformatik tillvägagångssätt, bestäms deras uttryck i GC vävnader och utförde korrelationsanalys med inriktning miRNA.

Resultat

Profilering med TLDA avslöjade 15 avreglerade miRNAs i GC vävnader jämfört med normal magslemhinna. Replikering analys bekräftade att MIR-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-223-3p och MIR-375 genomgående avreglerad i GC vävnader. Analys av GC patientplasmaprover visade signifikant nedreglering av MIR-148a-3p, MIR-375 och uppreglering av MIR-223-3p jämfört med friska försökspersoner. Vidare, med hjälp av bioinformatiska verktyg vi identifierat mål av replikerade miRNA och utförde sjukdomsassocierade genen anrikning analys. I slutändan har vi utvärderat potentiella målgen BCL2 Mössor och DNMT3B
uttryck av QRT-PCR i GC vävnad, vilket korrelerade med inriktning miRNA uttryck.

Slutsatser

Vår studie visade miRNA profil i GC vävnader och visade att mIR-148a-3p, mIR-223-3p och mIR-375 avregleras i GC plasmaprover, men dessa cirkulerande miRNAs visade relativt svag diagnostisk prestanda som enda biomarkörer. Målgenen analys visade att BCL2 Mössor och DNMT3B
uttryck i GC vävnad korrelerade med deras inriktning miRNA uttryck

Citation. Juzėnas S, Saltenienė V, Kupcinskas J, Link A , Kiudelis G, Jonaitis L, et al. (2015) Analys av avreglerade mikroRNA och deras målgener i magcancer. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10.1371 /journal.pone.0132327

Redaktör: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA

Mottagna: 22 april 2015, Accepteras: 13 juni 2015, Publicerad: 14 juli 2015

Copyright: © 2015 Juzėnas et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers- och dess stödjande information filer

Finansiering:. Detta arbete JK, LJ, Siju, LK, var JS stöd från Europeiska socialfonden nr VP1-3.1-SMM-07-K-01 -156. Arbetet med PM stöds av tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning inom ramen för ERA-Net PathoGenoMics. Grant No: BMBF-0315905D. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion [1] [2]

upptäckten av mikroRNA (miRNA) och etablering av deras roll i molekylära vägar har medfört en enorm framsteg inom molekylärbiologi. Dessa små icke-kodande RNA som består av ~ 22bp är inblandade i post-transkriptionell reglering av gen-expression. MiRNA kännetecknas av hög stabilitet i biologiska prover gör dessa molekyler ett attraktivt mål i biomarkör forskningsområdet [3] [4]. Ackumulerande bevis visar att miRNA är involverade i större carcinogenes vägar [5]. Tidigare studier har visat att avregleringen av miRNA förekommer i stort sett i alla större typer av cancer [5] [6]. Vidare har miRNA visat sig ha en diagnostisk eller prognostisk roll och även potentiella kliniska implikationer för riktad genterapi hos cancerpatienter [7] [8].

Förekomsten av magcancer (GC) i västvärlden har minskat under de senaste decennierna; dock står denna typ av cancer fortfarande för nästan en miljon nya sjukdomsfall i världen och bär en mycket hög dödlighet [9]. Ny forskning på GC har visat många nya insikter i patogenesen av denna malignitet. Ändå de exakta mekanismerna för malign transformation från Helicobacter pylori
( H
. pylori
) infektionen till kronisk atrofisk gastrit, intestinal metaplasi och GC fortfarande dåligt förstådd [10 ]. Nuvarande hypotes GC utveckling innebär kombinerade effekterna av bakteriell, värd och näringsfaktorer; Men hittills tyder denna teori mycket få kliniskt sunda translationella konsekvenser [11]. Majoriteten av GC fall diagnostiseras i sena stadier av sjukdomen, som är associerad med dåliga behandlingsresultat. Därför är en av de viktigaste fokus i GC forskning utvärdering av potentiella molekylära biomarkörer som kan användas för tidig icke-invasiv diagnostik av denna malignitet.

Den avgörande roll miRNAs i GC har visats i olika studier [12]. Volinia et al. har som en av de första miRNA uttryck profiler i GC vävnads visar en specifik avreglering mönster [13]. Ytterligare studier har också rapporterat betydande avreglering av miRNA tillhör MIR-17, MIR-21, MIR-223, MIR-135 och många andra familjer. Bland rapporterade studier i GC vävnader, MIR-21, MIR-25, MIR-92, MIR-223 var de mest konsekvent uppreglerat miRNA, medan MIR-375 och MIR-148 var den mest konsekvent nedregleras [14] [ ,,,0],15] [16]. De flesta av dessa studier har tittat på miRNA profil hos patienter med GC och parade angränsande normal magslemhinna [14]. Viktiga studier har visat att miRNA redan avreglerad i tidiga skeden av gastric cancer, inklusive H
. pylori
gastrit och premaligna stadier av gastric atrofi och intestinal metaplasi [17] [18]. Interestingly, några av miRNA har motsatta avreglerings riktningar i närvaro av GC, som separata profilering studier visar signifikant inkonsekvens bland avreglerade miRNA [14]. MIR-9 befanns vara uppreglerade i två studier [15] [19], medan två andra tidningar visade signifikant nedreglering av detta miRNA i GC vävnader [13] [20]. Dessa skillnader avseende motsatt avreglerings resultat MIR-9 och många andra miRNA är mest sannolikt kopplade till skillnader i anatomisk placering av GC, histologiska subtyp, sjukdomsstadium, profileringsplattformar, statistisk analys och många andra potentiella störfaktorer. Dessutom de flesta för närvarande publicerade studier om miRNA profil i GC vävnader omfatta ämnen från asiatiska länder; Samtidigt är fortfarande knappa uppgifter om europeiska GC patienter [21].

Målet med vår nuvarande studie var att bestämma miRNA profil i GC vävnader och jämföra den med den normala friska magslemhinnan med hjälp av bred täckning miRNA TaqMan låg densitet arrayer. I ytterligare analys, som syftar vi att validera våra profilresulterar i vävnad och plasma av en större grupp av GC patienter och friska kontroller av europeisk härkomst. I slutändan, vi utvärderade potentiella målgener bekräftad differentiellt uttryckta miRNA och utförde sjukdomsassociation genen anrikning analys av deras målgener.

Material och metoder

Etik uttalande

studien godkändes av Kaunas regionala Biomedical Research etikkommitté (protokoll nr BE-2-10). Alla patienter undertecknat ett informerat medgivande att delta i studien.

Studiepopulation

Vävnadsprover prospektivt samlat mellan 2011 och 2014 i departementen Gastroenterology och kirurgi, sjukhuset i litauiska Hälsohögskolan (Kaunas, Litauen). I studien ingick totalt 51 kontrollindivider och 51 GC patienter, som delades in profileringen (GC, n = 13, kontroller, n = 12) och validerings kohorter (GC, n = 38, kontroller, n = 39). Alla försökspersoner var av europeisk härkomst. Gastric biopsiprov erhölls från antral del av magsäcken från kontrollpersoner som remitterades för övre GI endoskopi grund av dyspeptiska symptom och hade ingen tidigare historia av malignitet. GC vävnadsprover erhölls från kirurgiska prover omedelbart efter resektion från patienter som genomgick primäroperation för GC utan preoperativ strålning och kemoterapi. Gastric adenocarcinom i GC patienter kontrollerades genom histologi och klassificeras enligt Lauren i diffus och tarmTyper [22]. H
. pylori
status bedömdes i GC och kontrollpersoner med hjälp av indirekt ELISA för att detektera serum-IgG-antigen (Virion /Serion GmbH, Wünrzburg, Tyskland). Kliniska och patologiska egenskaperna hos de patientgrupper, inklusive ålder, kön och sjukdomsstadium sammanfattas i tabell 1.

förberedelse och RNA Tissue provextraktion

Gastric vävnadsprover förvarades i RNAlater (Ambion, Austin , TX, USA) vid + 4 ° C och 24 timmar senare förvaras vid -80 ° C. 30 mg av vävnad homogeniserades i sterilt tillstånd innan total RNA-isolering med Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) för profilering studier och miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) för valideringsstudie, enligt den tillverkarnas instruktioner. Kvaliteten på RNA bedömdes med hjälp av Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, USA). Kvalitativ undersökning av RNA integritet utfördes genom elektrofores på agarosgel (5%).

Plasma provberedning och RNA-extraktion

Plasmaprover samlades in från hälsa patienter och patienter med GC. Mirna uttryck i plasma kohort bestod av plasmaprover från 38 patienter med ventrikelcancer och 39 friska försökspersoner. Venöst blod uppsamlades i EDTA antikoagulationsparametrarna vakuumrör och centrifugerades vid 3500 rpm under 15 min vid rumstemperatur; separerade plasman överfördes till 1,5 ml rör och placerades i en -80 ° C frys under korttidslagring. Små RNA extraherades från 200 pl plasma med hjälp av miRNeasy Serum /Plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) enligt tillverkarens anvisningar.

Mirna profilering med hjälp av TaqMan låg densitet Array

Mirna profilering genomfördes med TaqMan Array Human Mirna kort En v2.1 som gjorde det möjligt att kvantifiera 377 mänskliga miRNA katalogiserade i miRBase v20 [23]. I korthet 350 ng totalt RNA initialt omvänt transkriberat med hjälp av Megaplex RT set pool En version 2.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornien, USA) och 800 pl cDNA produkten laddades sedan på TaqMan Array Human Mirna kort och köras på VIIA 7 realtids-PCR System (Applied Biosystems). Primär analys gjordes med hjälp av VIIA 7 Software (Applied Biosystems) för att få uttryck i termer av Ct. Dataanalys utfördes med hjälp av bioledare HTqPCR paket [24]. MiRNA med Ct värde > 37 ansågs oamplifierat. MiRNA som inte förstärks i mer än 25% av proverna anses vara ringa uttryckt och därmed utesluts från vidare analys. Mirna uttrycksdata normaliserades med hjälp av rang invariant normalisering. NormFinder och geNorm algoritmer användes för att identifiera en referens gen från TLDA data för valideringsstudie [25]. Enligt algoritmerna MIR-127-3p visade lägsta Ct varians och valdes som en referens genen för valideringsstudie. Nyligen genomförda studier visar att uttrycksnivåer RNU6A och några andra små nukleära RNA kan vara instabila i vissa vävnader och villkor och kan inte fungera som bästa referens gener [26] [27] [28] [29]. En nyare publikation har också identifierat MIR-127-3p som en bra kandidat för referensgenen val [30]

Kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktioner (QRT-PCR) katalog

Omvänd transkription (RT. ) reaktioner utfördes med användning av TaqMan Mirna omvänd transkription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornien, USA) och miRNA-specifika RT stam-loop primers (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornien, USA). Singleplex reaktioner utfördes i en volym av 7,5 mikroliter. Varje reaktion innefattade 2,08 mikroliter nukleas fritt vatten, 0,74 pl 10 x RT buffert, 0,08 mikroliter dNTP (100 mM), 1,5 mikroliter 5 × miRNA-specifika RT primers, 0,1 mikroliter RNas-inhibitor, 0,5 mikroliter Multiscribe omvänt transkriptas och en bestämd volym av miRNA mall (2,5

• PLOS ONE: Prediction modell för Gastric Cancer Incidence in Korean Population
• PLOS ONE: roller DPY30 i spridning och motilitet Gastric cancerceller