Ozadje
MicroRNAs (miRNAs) so obširno raziskan nekodiranih RNA, ki modulirajo izražanje genov. MiRNAs so deregulacije v različnih tumorjev, vključno z rakom želodca (GC) in imajo potencialne diagnostične in prognostične posledice. Namen naše raziskave je bil ugotoviti Mirne profil v GC tkiva, ki ji sledi ocenjevanje dereguliranih miRNAs v plazmi bolnikov GC. Uporaba baz podatkov na razpolago in bioinformatike metode smo tudi namenjen za oceno možne ciljne gene potrjena različno izražena miRNA in potrditev te ugotovitve v GC tkivih.
V raziskavi je sodelovalo 51 GC bolnikov in 51 kontrol. Sprva smo pregledani Mirna profila izraznosti 13 vzorcev tkiv GC in 12 običajnih želodčnega tkiva s TaqMan paleto nizke gostote (TLDA). V drugi fazi, so različno izražene miRNAs potrjene s replikacije kohorti uporabo QRT-PCR v vzorcih tkiv in plazme. Kasneje smo analizirali možne ciljne gene dereguliranih miRNAs uporabo bioinformatiÄŤnih pristop, ki se določi njihovo izražanje v GC tkivih in izvedli korelacijsko analizo s ciljanjem miRNAs.
profiliranje z TLDA razkrila 15 dereguliranih miRNAs v GC tkiva v primerjavi z običajnim želodčne sluznice. Analiza replikacije je potrdila, da miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p in miR-375 so bile dosledno deregulacije v GC tkivih. Analiza plazemskih vzorcev GC bolnikov je pokazala znatno navzdol ureditev pokoj-148a-3p, MIR-375 in up-regulacije miR-223-3p v primerjavi z zdravimi osebami. Poleg tega s pomočjo bioinformacijskih orodij smo opredelili cilje ponovili miRNAs in izvedli analizo gena za bogatenje povezano bolezni. Konec koncev, smo ocenili potencialni ciljni gen BCL 2 Naša raziskava je pokazala, Mirna profil v GC tkivih in je pokazala, da so miR-148a-3p, miR-223-3p in miR-375 deregulacije v vzorcih GC plazmi, vendar so ti v obtoku miRNAs pokazala relativno šibko diagnostično zmogljivost kot samostojne biomarkerjev. Ciljni gen analiza je pokazala, da je BCL 2 Navedba. Juzėnas S, Saltenienė V, Kupcinskas J, Link , Kiudelis G Jonaitis L, et al. (2015) Analiza deregulirati microRNAs in njihovih ciljnih genov želodčnega raka. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10,1371 /journal.pone.0132327 Urednik: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, UNITED STATES Prejeto: 22. april 2015; Sprejeto: 13. junij 2015; Objavljeno: 14 julij 2015 Copyright: © 2015 Juzėnas et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek Financiranje:. To delo JK, LJ, SiJu, LK, je JS podpira Evropski socialni sklad št VP1-3.1-SMM-07-K-01 -156. Delo PM podpira nemško zvezno ministrstvo za izobraževanje in raziskave v okviru ERA-NET PathoGenoMics. Grant No: BMBF-0315905D. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi Uvod odkritje microRNAs (MiRNAs) in določitev njihove vloge v molekularnih poteh, je prinesla velik napredek v molekularni biologiji [1] [2]. Te majhne RNA nekodiran sestavljena iz ~ 22bp so vključeni v post-transkripcijske regulacije genske ekspresije. MiRNAs je značilna visoka stabilnost v bioloških vzorcev, ki te molekule zanimiv cilj pri biomarkerjev raziskovalnem področju [3] [4]. Kopičijo dokazi kažejo, da so miRNAs vključeni v večjih poti rakotvornost [5]. Prejšnje študije so pokazale, da se pojavi deregulacija miRNAs praktično v vseh glavnih vrstah raka [5] [6]. Poleg tega so bili miRNAs pokazale, da imajo diagnostični ali prognostični vlogo in celo morebitne klinične posledice za ciljno genskega zdravljenja pri bolnikih z rakom [7] [8]. incidenca raka želodca (PK) v zahodnih državah je zmanjšala v zadnjih desetletjih; Vendar pa ta vrsta raka še vedno predstavlja skoraj en milijon primerov novih bolezni po vsem svetu in nosi zelo visoko smrtnost [9]. Nedavne raziskave GC je pokazala številne nove vpoglede v patogenezo te malignosti. Kljub temu, da ni mehanizmi za maligno transformacijo iz Helicobacter pylori Odločilna vloga miRNAs v GC je bilo dokazano v različnih študijah [12]. Volinia sod. so zagotovili eno od prvih miRNA izraznih profilov v GC tkiva, ki kažejo posebno deregulacije vzorec [13]. Nadaljnje študije so poročali tudi znatno deregulacijo miRNAs pripadajo miR-17, miR-21, miR-223, miR-135 in mnoge druge družine. Med poročali študij v GC tkiv, MIR-21, MIR-25, MIR-92, MIR-223 so se najbolj dosledno reguliran miRNAs, medtem ko so bili miR-375 in miR-148 najbolj dosledno navzdol urejena [14] [ ,,,0],15] [16]. Večina teh študij so proučevali miRNA profil pri bolnikih z GC in seznanjenih sosednjih zdravih želodčne sluznice [14]. Pomembne študije so pokazale, da so miRNAs že liberaliziran v zgodnjih fazah želodca rakotvornosti, vključno s H Cilj naše raziskave je bil ugotoviti Mirne profil v GC tkivih in ga primerjati z normalno zdravo želodčne sluznice s pomočjo širokega pokritja miRNA TaqMan nizko gostoto nizi. V nadaljnji analizi smo želeli potrditi naše profiliranja rezultate v tkiva in plazme za večje skupine GC bolnikov in zdravih kontrolah evropskega porekla. Konec koncev, smo ocenili potencialne ciljne gene potrdil različno izražena miRNA in izvedli bolezen-pridružitvenega analizo gena za bogatenje svojih ciljnih genov. izjava Etika materiale in metode študija je odobril regionalni odbor Kaunas biomedicinskih raziskav etiko (Protokol št BE-2-10). Vsi bolniki so podpisali informirano obrazec o soglasju za sodelovanje v raziskavi. tkiva so bili osebki naprej zbirali med letoma 2011 in 2014 v oddelkih za gastroenterologijo in kirurgijo, Bolnišnica litovskega Univerza za zdravstvene vede (Kaunas, Litva). V raziskavi je sodelovalo skupaj 51 kontrolnih preiskovancev in 51 bolnikov GC, ki so bile razdeljene v profiliranju (GC, n = 13; kontrol, n = 12) in potrjevanja kohort (GC, n = 38; kontrol, n = 39). Vsi predmeti so bili evropskega porekla. Želodčne biopsije Vzorci so bili pridobljeni iz antralnih delu trebuha od kontrolne skupine, ki so bili iz na zgornji GI endoskopijo zaradi dispeptičnimi simptomi in ni imela anamnezo malignosti. GC vzorce tkiva so bili pridobljeni iz kirurške osebkov takoj po resekcijo iz bolnikih z osnovno operacijo za GC brez predoperativnega obsevanja in kemoterapije. Adenokarcinom želodca pri bolnikih GC je bil preverjen s histologijo in razvrščeni glede na Lauren v difuzni in črevesne vrst [22]. H priprava vzorec tkiva in RNA ekstrakcija vzorci želodcu tkiva so bili shranjeni v RNAlater (Ambion, Austin , TX, ZDA) pri + 4 ° C in 24 ur kasneje shranimo pri -80 ° C. 30 mg tkiva smo homogenizirali v sterilnem stanju pred popolno izolacijo RNA z mirVana miRNA Izolacija Kit (Ambion, Austin, TX, ZDA) za profiliranje študija in miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, ZDA) za validacijske študije je po podatkih navodila proizvajalcev. Kakovost RNA je bila ocenjena s pomočjo spektrofotometra Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, ZDA). Kvalitativni pregled celovitosti RNA smo izvedli z elektroforezo na agaroznem gelu (5%). Plasma vzorec in RNA ekstrakcija Vzorce plazme so bili zbrani iz zdravstvenih bolniki in bolniki z GC. Mirne izraz v plazmi kohorti sestavljalo vzorcih plazme 38 želodca bolnikov z rakom in 39 zdravih prostovoljcih. Venske krvi smo zbrali v EDTA proti strjevanju vakuumskih cevi in centrifugiramo pri 3500 obratih na minuto za 15 minut pri sobni temperaturi; ločen plazmo smo prenesli v 1,5 ml epruvete in postavi v C zamrzovalniku -80 ° za kratkotrajno skladiščenje. Mala RNA so bili pridobljeni iz 200 ul plazme z uporabo miRNeasy Serum /plazma Kit (Qiagen, Valencia, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. MIRNA profiliranje je bilo opravljeno s TaqMan Array Human Mirna kartico v2.1 kar je omogočilo, da količinsko 377 človeških miRNAs katalogizacije v miRBase V20 [23]. Na kratko, 350 ng celotne RNA je bila sprva reverzno transkripcijo z uporabo Megaplex RT nastavljen združijo Različica 2.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, California, ZDA) in 800 xl cDNA izdelka je bil nato naloži na TaqMan Array Human Mirna Card in vodijo na VIIa 7 Real-Time PCR sistem (Applied Biosystems). Primarna analiza je bila narejena s pomočjo VIIa 7 Programska oprema (Applied Biosystems), da se izraz v smislu Ct. Analiza podatkov je bila opravljena s pomočjo Bioconductor HTqPCR paketa [24]. MiRNAs s Ct vrednosti > 37 so bile upoštevane unamplified. MiRNAs ki niso bila dopolnjena v več kot 25% vzorcev, so menili, da ponižnega izražena in zato izključeni iz nadaljnje analize. MIRNA izraz Podatki so normalizirani z uporabo čin invariantna normalizacije. NormFinder in geNorm algoritmi so bili uporabljeni za identifikacijo referenčni gen iz podatkov TLDA za validacijske študije [25]. V skladu z algoritmi miR-127-3p pokazala najnižjo varianco CT in je bil izbran kot referenčni gen za validacijske študije. Nedavne študije kažejo, da bi lahko stopnje izraženosti v RNU6A in nekaterih drugih manjših jedrskih RNA nestabilen v nekaterih tkivih in pogoji, in ne sme služiti kot [26] [27] [28] [29] najboljših referenčnih genov. Eden od nedavna objava je tudi ugotovila, miR-127-3p kot dober kandidat za izbiro reference genov [30]. Reverse prepis (RT ) reakcije so bile izvedene z uporabo TaqMan Mirna povratne Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California, ZDA) in miRNA specifične RT izvornih zanke začetnih oligonukleotidov (Applied Biosystems, Carlsbad, California, ZDA). Singleplex reakcije smo izvedli v volumnu 7,5 p.L. Vsaka reakcija sestavljena 2.08 tjj- nukleazno proste vode, 0,74 ul 10 x RT buffer, 0.08 xl dNTP-jev (100 mM), 1.5 xl 5 × miRNA specifične RT primerji, 0.1 xl RNase inhibitor, 0.5 xl Multiscribe reverzne transkriptaze in določen obseg miRNA šablona (2,5 xl). RT je bila izvedena v termostat pod naslednjimi pogoji: 16 ° C za 30 minut, 42 ° C za 45 min in 85 ° C za 5 minut, čemur sledi zadržana pri 4 ° C TaqMan realna. -time PCR reakcije smo izvajali v dveh izvodih reakcijam, ki obsegajo 6,25 xl TaqMan 2 × Universal PCR Master mix s št AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, ZDA) 0,625 p.L 20 × miRNA-specifičen primer in sonda mešanica za TaqMan Mirna Vsebnost Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, ZDA), 3 xl reverzne transkripcije proizvoda in 2.625 xl nukleaze proste vode. RT-PCR smo izvedli z uporabo 7500 Hitro realnem času PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, ZDA), pod naslednjimi pogoji: 95 ° C za 10 minut, nato 40 ciklov 95 ° C za 15 sekund, 60 ° C za 60 sekund, nato pa je zadržana pri 4 ° C. Vsak vzorec je bilo teči v dveh izvodih. Podatki so bili analizirani s samodejnimi nastavitvami za dodelitev izhodišče, in so bile izračunane povprečne CT in SD vrednosti. Nivo izražanja miRNA v tkivu smo normalizirali na miR-127-3p in nivo izražanja v plazmi je normalizirano na HSA-miR-16-5p. Rezultati so bili izračunani po metodi ΔΔCT [31]. Podatki so bili analizirani s samodejnimi nastavitvami za dodelitev izhodišče, in so bile izračunane povprečne vrednosti Ct in SD. cDNA za BCL 2 seznami potrjenih ciljnih genov iz miRNAs kandidatk so bili pridobljeni iz miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) in miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) podatkovnih baz. združenje podatki Gene-bolezni so bili pridobljeni iz baze podatkov DisGeNET (http://www.disgenet.org/~~HEAD=pobj). Da bi ugotovili GC-povezanih genov, izraz "želodca adenokarcinom" (umls: C0278701) je bila uporabljena kot poizvedbo za podatkovne baze. Biološki omrežja so bila ustvarjena s pomočjo Cytoscape V3.2 odprtokodno programsko opremo z CyTargetLinker uporabo [32]. klinične značilnosti med skupinami smo primerjali z uporabo χ Mirna izraz profiliranje GC in zdravega želodca sluznice tkiva TLDA TaqMan Human miRNA nizke gostote analiza Array je bila izvedena za ugotavljanje kandidatke miRNAs razstavlja spremenila izraz v želodcu tkivu raka. Tkivo Mirna profili iz bolnikov GC so bile v primerjavi s profili želodčne sluznice pri zdravih posameznikih. Po filtriranju za nizke bogate miRNAs (Ct vrednosti > 37 in brez zaznavnih v več kot 25% vzorcev), niz 193 miRNAs (od skupno 377) je ostalo za nadaljnjo analizo. Primerjava rakavi v primerjavi z normalnim tkivom prepoznani 15 različno izražena miRNAs, od katerih je bilo 7 up-regulirane in 8 so dol-urejeni z FDR prilagojena vrednostjo p < 0,01 in krat sprememb > 2 (tabela 2). Rezultati so pokazali, v vulkanski ploskvi (slika 1). Med njimi je 6 miRNAs (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-375, miR-223-3p in miR-155-5p), ki prikazuje najvišjo pomembnost in krat spreminjanje vrednosti, so bili izbrani za validacijske študije. Hierarhično grozdenje pod evklidski razdalji izbranih miRNA podatkov normaliziranega izražanja pokazala dve podskupini: ena, ki ustrezajo kontrolne skupine in drugi, ki ustrezajo predvsem v skupini bolnikov. (Slika 2). šestih miRNAs kandidatk, izbranih za preverjanje so količinsko, z uporabo QRT-PCR. Za izbiro referenčna gena so bili podatki TLDA analizirajo z uporabo dveh različnih algoritmov (NormFinder in geNorm) za opredelitev referenčnih genov. MIR-127-3p pokazala najvišji izraz stabilnosti v vseh vzorcev v podatkih TLDA in zaradi tega funkcijo miR-127-3p je bil izbran kot referenčni gen za normalizacijo podatkov qPCR. Stopnje izraženosti Mir-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-223-3p in pokoj-375 je pokazala velika razlika v izraz v isto smer, kot v študiji odkritje (FDR prilagojen p < 0,05), medtem ko se ni bistveno razlike so bile odkrite v stopnjah izražanja v pokoj-135a-5p in pokoj-155-5p (FDR prilagojen p > 0,05; slika 3) Plasma miRNAs potencialnih biomarkerjev za rakom želodca Ciljna gene napoved Da bi še dodatno preuči možne tarče pokoj-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-223- 3p in miR-375, vse svoje eksperimentalno potrjenih miRNA ciljno interakcije so bili pridobljeni iz dveh različnih podatkovnih baz (miRTarbase in miRecords). Podatke smo vizualizirali v Cytoscape kot biološki omrežja, ki vsebuje vse omenjene miRNAs in njihovih ciljnih interakcij (slika 5). Vsaka interakcija v omrežju sestavljena iz dveh vozlišč, regulativni miRNA vozlišče (rdeče) in ciljni mRNA vozlišče (roza), povezan z eno usmerjeno rob. Mreža vključenih 593 potrjenih cilje, 419 od njih dodeljena miR-375, 88, dodeljenih pokoj-204-5p, 83 dodeljena pokoj-148a-3p in 21. dodeljena pokoj-223-3p. Analiza je mreža pokazala, da šest skupnih ciljev (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 in RAB10), je imela miR-148a-3p in miR-375 miR-204-5p in miR-375 tudi šest skupne cilje (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 in IL1RAP), miR-148a-3p in miR-204-5p imela dve skupni cilji (AURKB in CDC25B), miR-223-3p in miR-148a-3p je imela tudi dve skupnih ciljev (HSP90B1 in IRS1), je imela miR-223-3p in miR-375 en skupni cilj (PARP1) in MIR-148a-3P, MIR-204-5p in miR-375 je prav tako en skupni cilj (BCL 2). Ciljne genov, ki so bili hkrati ureja dve ali tri miRNAs so zastopani v oranžne in zelene barve, v tem zaporedju (slika 5). Da bi ugotovili, ali je bolezen -associated geni so znatno obogaten v našem nizu ciljev miRNA, je obogatitev analiza je bila opravljena. Prvič, seznam gen so bile pridobljene iz baze DisGeNet. Kot poizvedbo za bazo podatkov smo uporabili izraz "adenokarcinomom želodca" (umls: C0149826). Po filtriranju Mirne, lncRNA in geni, ki niso bili v miRTarbase in miRecords, smo identificirali 115 genov, ki se povezujejo z GC. Pri analizi omrežij so 20-GC, povezanih genov prekrivali, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 in JAG1) od njih dodeljena miR-375, 6 (IL8, MMP9, IL1B, CDX2, SERPINE1 in SPARC) dodeljena miR-204 -5p, 4 (CDKN1B, APC, NR1I2 in CCKBR) dodeljena miR-148a-3p in 2 (STMN1 in IGF1R) dodeljena pokoj-223-3p. Ciljne genov, ki so povezani z GC so zastopani v modrem (slika 5). Nazadnje je bila analiza genov obogatitev povezano bolezen, izvaja z uporabo testa hipergeometrično, ki temelji na distribuciji, ki je privedla do oceniti, ali je število-GC, povezanih genov večja od pričakovane za niz ciljnih genov izbranih miRNAs. Obogatitev analiza je pokazala, da so bile-GC, povezanih genov bistveno preveč zastopane (p < 0,05) v pokoj-148a-3p, MIR-204-5p in pokoj-223-3p, medtem ko ni bilo pomembno obogatitev opaziti v pokoj-375 ciljnih genov (p > 0,05) (tabela 3) BCL 2 Pogovor Spremenjene Mirna izraz profili imajo. poročali so v GC tkivnih in krvnih vzorcev [13] [20] [14] [38]. Nekatere od teh dereguliranih miRNAs so bile povezane s preživetjem, metastatskega obnašanja tumorja in drugih clinicopathological funkcije GC [39] [40]. Poleg tega so bili miRNAs dokazano uravnavajo rast tumorja, ki vplivajo na proliferacije, oprijem, invazijo in migracije v celičnih linijah GC [41]. Še pomembneje je, so ciljni geni dereguliranih miRNAs v GC vključene v apoptozo, celični cikel in drugih ključnih poti rakotvornost [12]. Zato se lahko preiskava miRNAs in njihovih možnih ciljnih genov v GC služijo za nadaljnji razvoj pomembnih diagnostike in zdravljenja alternativ. Očitno je, da so miRNAs glavni akterji v želodcu rakotvornosti, vendar smo še vedno premalo natančne podatke o mehanizmih in morebitne klinične aplikacije teh molekul v GC. Naše sedanje študije je bil določiti profil dereguliranih miRNAs v GC tkiva, jih oceni v vzorcih plazme in oceniti možne ciljne gene deregulirane miRNAs. Uporaba TaqMan miRNA TLDA kartic, ki vključuje 377 miRNAs oligonukleotidov, smo ugotovili, da 15 različno izražene miRNAs med rakasto GC in zdravega želodca tkiva. Osem miRNAs so navzdol regulirano (kaj-7a-5p, naj-7G-5P, MIR-26b-5P, MIR-30b-5p, miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR -375), medtem ko je bilo sedem miRNAs reguliran (miR-146b-5p, miR-155-5p, miR-214-3p, miR-223-3p, miR-224-5p, miR-331-3p in miR- 484). Naši profiliranje rezultati niso razkrili nekatere pogosto dereguliranih miRNAs, ki so bili pred tem poročali, da je treba deregulirati v drugih študijah, vključno s pokoj-21-5p, MIR-25-3p, MIR-92A-3p, MIR-29c-3p, in nekatere druge [15] [19] [14]. Ena od možnih razlag za te manjkajoče miRNAs se lahko povežejo z zelo strogimi statističnih kriterijev, ki so bili uporabljeni pri TLDA analizo naših podatkov (FDR prilagojeni vrednostjo p < 0,01 in krat sprememb > 2). Poleg tega bi določena stopnja razhajanja v miRNA profiliranja rezultatov med študijami izhajajo iz razlik v anatomsko lokacijo želodcu, histološki podtip, statistične analize in metode, predvsem profiliranje [18]. Študija, ki jo Mestdagh et al. kaže, da imajo različne platforme miRNA profiliranja različne stopnje zaznavanja, specifičnost in reprodukcija, in da je najbolj primerna platforma je treba izbrati na podlagi eksperimentalnih nastavitev in posameznih raziskovalnih vprašanj (Mestdagh et al., 2014). v drugi fazi naši raziskavi smo uporabili QRT-PCR v replikacijo kohorti vključno s šestimi najbolj dereguliranih miRNAs v fazi profiliranja (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-155-5p, miR-204-5p , miR-223-3p in miR-375). Pokazali smo, da so bili miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p in miR-375 dosledno deregulacije med normalnimi in rakavimi GC tkiva. Rezultati naše replikacije kohorte so podprte s prejšnjimi poročili. Številne študije so pokazale, da je bila miR-148a-3p občutno navzdol urejeno v celičnih linijah GC in vzorce tkiva v primerjavi s sosednjimi normalnih tkivih [42] [43]. Nizke stopnje izraženosti Mir-375 so poročali tudi študije, hypothesizing da je miR-375 povezana z želodčno rakotvornost [44] [16]. Ugotovili smo, da je bil miR-223-3p precej up-urejena v GC tkivu v primerjavi z normalno tkivo, ki ga je več prejšnjih poročilih [15] [19] predlagal. MIR-204-5p je manj pogosto poročali v GC miRNA profiliranja študij; Kljub temu, naši rezultati so v skladu s prejšnjo raziskavo, ki je pokazala znatno navzdol ureditev tega miRNA v GC tkiva in celičnih linij GC [45]. MIR-135a-5P izraz je bil v GC tkivih nižja kot pri kontrolnih osebah; Vendar pa je bilo opaziti navzdol ureditev trend podobno kot v prejšnjih poročilih [15] in bi lahko dosegel potrebno pomen z večjim številom posameznikov znotraj skupine. Treba je poudariti, da nismo našli razlik za pokoj-155-5p v naši replikacije kohorte primerjavo kontrolne osebe in bolnike GC. Najverjetneje je ta ugotovitev povezana z dejstvom, da so bili v začetni profiliranje kohorte kontrolnih oseb H Da bi raziskali morebitno vlogo različno izraženih miRNAs kot biomarkerjev v GC, smo analizirali deregulirati miRNAs v vzorci plazme. V obtoku miRNAs, zlasti kombinacija več miRNAs, lahko predstavi kot obetavne biomarkerjev za diagnozo raka prebavil [21]. Študija, ki jo Zhu et al. pokazale, da lahko senat petih miRNAs služi kot potencialni biomarker pri odkrivanju zgodnjim stopnjam GC [47]. Do danes, so sporočili iz Mirne profili v GC serumu ali plazmi precej razlikujejo med ločenih študijah [21].
in DNMT3B
izraz, ki ga QRT-PCR v GC tkivu, ki je povezana s ciljno usmerjenostjo na Mirni izraz.
Sklepi
in DNMT3B
izraz v GC tkiva povezana z njihovo ciljanje miRNA izražanja
( H
. pylori
) okužba kroničnega atrofični gastritis, intestinalno metaplazijo in GC je še vedno slabo razumljen [10 ]. Trenutni hipoteza razvoja GC vključuje kombinirane učinke bakterij, gostitelja in prehranske dejavnike; Vendar pa do danes, je ta teorija kaže zelo malo klinično zdrave translacijskih posledice [11]. Večina primerov GC so diagnosticirali v poznem stadiju bolezni, ki je povezana s slabimi rezultati pri pacientih. Zato je eden od glavnih poudarkov v GC raziskave je ocena možnih molekularnih bioloških označevalcev, ki bi jih lahko uporabili za zgodnje neinvazivne diagnostike te malignosti.
. pylori
gastritis in predrakave faze želodca atrofijo in intestinalno metaplazijo [17] [18]. Zanimivo je, da nekateri miRNAs imajo nasprotne deregulacijo navodilom v prisotnosti GC, kot ločene študije profiliranje kažejo znatno neskladje med dereguliranih miRNAs [14]. MIR-9 je bilo ugotovljeno, da je up-urejeno v dveh študijah [15] [19], medtem ko sta drugi dokumenti so pokazali veliko navzdol ureditev tega miRNA v GC tkiva [13] [20]. Te razlike glede nasprotne deregulacijo rezultate za pokoj-9 in mnogih drugih miRNAs so najverjetneje povezani z razlikami v anatomsko lokacijo GC, histološki podtip, fazi bolezni, profiliranje platformah, statistične analize in mnogih drugih morebitnih zavajajočih dejavnikov. Poleg tega je večina od doslej objavljenih študij o miRNA profilu GC tkivih zajema področja iz azijskih držav; Medtem, podatki o evropskih bolnikov GC še malo [21].
Študija prebivalstva
. pylori
jim je bila ocenjena v GC in kontrolnih osebah z uporabo posrednega ELISA za odkrivanje IgG antigen serumu specifična (Virion /Serion GmbH, Wünrzburg, Nemčija). Klinične in patološke značilnosti skupin bolnikov, vključno s starostjo, spolom in stopnjo bolezni, so povzeti v tabeli 1.
Priprava
Mirna profiliranje uporabo TaqMan Low-Density Array na
Kvantitativna reverzna transkripcija polimerazo verižne reakcije (QRT-PCR)
in Analiza DNMT3B
izražanje genov smo sintetizirali iz 500 ng RNK s pomočjo visoke zmogljivosti cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California, ZDA). Singleplex reakcije smo izvedli v volumnu 7,5 p.L. Vsaka reakcija obsegala 2,1 tjj- nukleazno proste vode, 1 p 10 x RT pufer, 0,4 xl dNTP-jev (100 mM), 1 xl 10 × RT Naključno primerji, 0.5 xl Multiscribe reverzne transkriptaze in fiksno prostornino miRNA predlogo (2,5 xl). RT-PCR smo izvedli na termostat pod naslednjimi pogoji: 25 ° C za 10 minut, 37 ° C 120 min in 85 ° C za 5 minut, čemur sledi zadržana pri 4 ° C. Preden so qPCR cDNA vzorce razredčiti v razmerju 1: 1 z nukleazo proste vode in 2 ul uporabljajo v 10,5 p.l RT-qPCR reakcij skupaj z 6,25 ul 2x TaqMan Fast Universal Master mix (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornija, ZDA), 0,625 ul 20x TaqMan Gene Expression Vsebnost (Life Technologies, Carlsbad, California, ZDA) in 3.625 ul sterilno vodo. RT-qPCR analize smo izvedli v treh izvodih na 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornija, ZDA) pod naslednjimi pogoji: 95 ° C za 10 minut, nato 40 ciklov 95 ° C za 15 sekund, 60 ° C za 60 sekund, nato pa je zadržana pri 4 ° C. Ravni izraz za BCL 2
in DNMT3B
v tkivu je bila preračunana na ACTB
.
Ciljna genskih mrež analiza
Statistična analiza
2 preizkus in Fisherjev natančni test za kvalitativne podatke, in t-test za kvantitativne podatke. Podatki TLDA smo analizirali s pomočjo t-testa in korekcije Benjamini Höchberg za lažno stopnjo odkrivanja, tako da je bila razlika izraz šteje, da je velika s p < 0.01. Podatki so normalizirani z uporabo uvrstitev nespremenljivih normalizacijo [33] in analizirali s pomočjo paketa HTqPCR. qPCR izraz podatki potrjevanje in Plazmo smo analizirali z neparametricnim Mann-Whitney U-test. Benjamini Hochberg prilagojena p < 0.05 je štelo, da je statistično značilna. Za podatke QRT-PCR, relativnih stopnjah izražanja v vsako tarčo so miRNA (log2 relativna stopnja), izračunan na podlagi razlike v vrednostih CT med ciljnimi miRNAs in pokoj-127-3p v vzorcih tkiv in pokoj-16-5p v vzorcih plazme (ΔCT) [34]. Hipergeometrijska testu je bila uporabljena za analizo ciljne obogatitev-GC povezana. Sprejemnik deluje značilno (ROC) krivulja je bila ustvarjena za vsako miRNA uporabo podatkov ΔCT. Površina pod krivuljo vrednosti (AUC) in 95% intervali zaupanja (CI) so bili izračunani za določitev specifičnost in občutljivost. Za analizo diagnostično vrednost kombiniranih sprememb vrednosti miRNA plazmi, smo uporabili univariatne izražanje genov v povprečju algoritem [35]. ROC krivulje so bili ustvarjeni s pomočjo ROCR paketa [36]. Vse analize podatkov smo izvedli s pomočjo različica v R 3.1.1 programske opreme.
Rezultati
Mirna potrditev v GC in zdravi želodčne sluznice tkivo s QRT-PCR
-bolezni, povezane gen obogatitev analiza
in DNMT3B
prekomerno ekspresijo in obratno korelaciji s ciljanjem miRNAs v želodčnih tkivih raka
kot domnevni cilj za pokoj-148a-3p, mIR-204-5p in pokoj-375 in DNMT3B
za pokoj-148a-3P in miR-375. Vse te miRNAs v naši raziskavi je bilo ugotovljeno, da se navzdol urejeno želodčnega tkiva raka. Za nadaljnjo podporo teh rezultatov, prvo analizo ekspresije BCL 2
in DNMT3B
geni bila izvedena. Podatki QRT-PCR je pokazala znatno povečanje ravni izražanja obeh BCL 2
in DNMT3B
geni v želodcu tkivu raka. BCL 2
pokazala 2,7-kratno povečanje, medtem ko je DNMT3B
imela 16,7-kratno povečanje ravni mRNA (slika 6). Analiza korelacije Pearson je bila izvedena, da bi odkril povezavo med BCL 2
in DNMT3B
mRNA in njihove ciljanje ravni Mirne v normalnih in rakavih želodčnega tkiva (Slika 6). Obratno sorazmerje opazili za oba napovedana DNMT3B
-targeting miRNAs: miR-375 (r = -0,49; p = 0,00001) in miR-148a-3p (r = -0,26; p = 0,0328) . Negativno korelacijo so opazili med BCL 2
in miR-375 (r = -0.32; p = 0.0116), medtem ko ni bilo ugotovljeno razmerje med BCL 2
in miR-148a-3p (r = -0,06; p = 0,6631) ali BCL 2
in miR-204-5p (r = -0,02; p = 0,8546)
. pylori free, medtem ko je v nizu replikacija, nekateri preiskovanci iz kontrolne skupine so imeli pozitivne serološke za to bakterijo. Znano je, da je miR-155-5p vključeni v vnetnih poti, vključno z H
. pylori
gastritis [46]; Zato, bi to lahko določeno pristranskost naših rezultatov. Naši rezultati so v skladu s predhodno študijo Link et al. (2015), kjer je razlika v izražanju miR-155 v biopsije iz GC primerjavi s kontrolno skupino ni dosegla statistične značilnosti [18]. V fazi replikacije naše raziskave miRNA profiliranje smo izbrali le šest miRNAs, ki so pokazali, najvišjo biološko ustreznost in statistične pomembnosti. Strinjamo se, da bi bilo koristno, da pogled na vse bistveno dereguliranih miRNAs in da bi lahko potencialni naloga v nadaljnji študij.
Znanstvenik dokazuje vlogo mikrobioma pri debelosti
Kako okrepiti imunski sistem za boj proti koronavirusu
Ali je verjetnost, da bodo ženske dolgo časa razvile COVID?
Antioksidanti v prehrani lahko povečajo tveganje za raka na črevesju,
Znanstveniki rešujejo skrivnostni primer sindroma avtomobilske pivovarne
Novi super aktivacijski makrofagni receptor bi lahko razložil hipervnetje pri hudem COVID-19
Probiotiki kot adjuvantno zdravljenje bolnikov s COVID-19
Leta 1892, Doderlein je najprej ugotovil koristno združbo mikroorganizmov v človeškem telesu. Zato v času pandemije COVID-19, koristno je oceniti vlogo mikroorganizmov v človeškem telesu in uporabo pr
Rastlinska hrana lahko na človeka prenaša odporne bakterije, odporne na antibiotike
Raziskovalci z Univerze v Južni Kaliforniji (USC) so na letnem srečanju Ameriškega združenja za mikrobiologijo odkrili, da lahko rastlinska hrana prenaša odpornost na antibiotike na črevesni mikrobiom
Perfectus Biomed bo razstavljal na konferenci IPS v Liverpoolu
Ekipa Perfectus Biomed bo ta mesec razstavljala na konferenci Društva za preprečevanje okužb (IPS) v Liverpoolu. Konferenca bo potekala v dvorani Arena in Convention Center v Liverpoolu od 22. do 24.