Дизайн исследования
<р> Для того, чтобы исследовать конкретные механизмы, с помощью которых Гольджи фосфопротеином 3 (GOLPH3) влияет на прогрессирование рака желудка и исследовать его клиническую значимость.
Выводы
<р> уровень экспрессии GOPLH3 сильно коррелирует с сигнализацией Akt /MTOR в образцах рака желудка человека. GOLPH3 в сочетании с сигнализацией активации Akt /MTOR может играть важную роль в развитии, дифференцировке, инвазии и метастазирования рака желудка
<р> Цитирование:. Пэн J, Fang Y, Y Тао Ли K, T Су, Нонг Y, и др. (2014) Механизмы GOLPH3, связанных с прогрессированием рака желудка: предварительное исследование. PLoS ONE 9 (10): e107362. DOI: 10.1371 /journal.pone.0107362
<р> Редактор: Юань-Сун Хо, Тайбэй медицинский университет, Тайвань
<р> Поступило: 13 июня 2014 года; Принято: 7 августа, 2014 года; Опубликовано: 6 октября +2014
<р> Copyright: © 2014 Пэн и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник приписывают наличие
<р> Data:. авторы подтверждают, что все данные, лежащие в основе выводы полностью доступны без ограничений. Все данные доступны из рукописи и фигур
<р> Финансирование:. Это исследование было поддержано исследовательским фондом Гуанси здравоохранения соответствующей технологии и проекта развития (номер гранта: S201415-01). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> Хотя глобальные статистические данные показывают, что рак желудка (GC) является четвертой наиболее распространенной формой рака у мужчин и пятое место среди самых распространенных видов рака у женщин, смертность от рака желудка занимает второе место только к раку легких [1]. Глобальная заболеваемость раком желудка снижается со времен Второй мировой войны [2]. Тем не менее, в развивающихся странах, включая Китай, заболеваемость и смертность от рака желудка остается высоким. Желудочный лечение рака улучшилось в последние годы, но большинство пациентов все еще диагностирована с раком желудка, часто включая вторжение и отдаленными метастазами, что приводит к неудовлетворительной скорости эффекта лечения. Поскольку рак желудка представляет собой серьезную угрозу для здоровья и жизни человека, крайне важно понять патогенез рака желудка в процессе онкогенеза, инвазию и метастазирование вести раннюю диагностику и лечение.
<Р> Принято считать, что образование опухоли включает в себя misregulation многочисленных онкогенов, генов-супрессоров опухолей и генов с метастазированием, связанных с Гольджи фосфопротеинкиназы 3 (GOLPH3), который также известен как GPP34, GMx33 или MIDAS, представляет собой мембранный белок 34 кДа, который первоначально был идентифицирован в мыши Гольджи с помощью протеомики анализа [3]. GOLPH3 принадлежит к семейству белков Гольджи матрицы, который высоко законсервирован от дрожжей до человека [4]. После того, как GOLPH3 был поступательно изменен, она динамически связана с отрицательной матрицей Гольджи, быстро транспортируется через транс-Гольджи сеть (TGN) в цитоплазму, и распределяется в плазматические мембраны везикулы и эндокринных клеток [4]. Несколько исследований показали, что GOLPH3 участвует в Антероградный и ретроградной торговли Гольджи, рециркуляции рецептора, и гликозилирование от Гольджи к плазматической мембране; GOLPH3 также играет определенную роль в цитоскелета взаимодействия и поддержания структуры Гольджи [4] - [7]. Скотт и др. первым определил онкогенного роль GOLPH3, раскрывая ее важную роль в дифференциации клеток опухоли и пролиферации и его присутствие во многих солидных раков [8]. Интересно, что некоторые исследования предполагают, что GOLPH3 регулирует раковые клетки путем усиления мишени рапамицина у млекопитающих (МРМ) деятельности. МРМ представляет собой серин /треонин протеинкиназы, и ключевой интегратор фосфатидилхолина-инозитол-3-киназы (PI3K РТК-пути), как известно, регулирует рост клеток, пролиферации и выживаемости в раковых клетках человека [9] - [10]. Многие исследования в настоящее время изучают взаимосвязь между GOLPH3 и несколько солидных раков Однако нет достаточных доказательств, подтверждающих гипотезу, что экспрессия GOLPH3 связана с прогрессированием рака желудка человека и прогнозирования, и механистической основе, с помощью которого GOLPH3 влияет на онкогенеза, вторжение и метастазирование рака желудка остается неясным. В данном исследовании мы исследовали клинические значимостей GOLPH3 и АКТ /МРМ сигнализации при раке желудка. В то же время, мы обнаружили соотношение GOPLPH3 и /Akt сигнализации MTOR при раке желудка, чтобы выявить потенциальную роль GOLPH3 в регуляции МРМ-опосредованной рака желудка онкогенеза, инвазию и метастазирование.
Этические утверждение
<р> Все процедуры исследования были рассмотрены и одобрены Советом по рассмотрению этики институциональной первой филиал больницы Гуанси медицинского университета и проводится в соответствии с принципами, выраженными в Хельсинкской декларации. Информированное согласие был освобожден от платы за счет свежих образцов были обработаны и анонимной в соответствии с этическими и правовыми нормами.
Immunohistochemistry
<р> Парафиновые образцы разрезали на 3-мкм срезы толщиной от раковыми, карцинома соседнему и парных образцах нормальной ткани и установлены на стеклах. Срезы сначала обжигают при температуре 65 ° С в течение 2 ч. Затем срезы были депарафинировали в 100% ксилола и регидратации в серии нисходящая этанола (100%, 90%, 80%, и 70% этанола) и дистиллированной воды в соответствии со стандартными протоколами. После этого срезы вымачивали в цитратном буфере антигенной поиска информации, нагревают в автоклаве, после чего давали остыть до комнатной температуры. После того, как срезы промывали в PBS три раза в течение пяти минут, 3% перекиси водорода был добавлен, чтобы блокировать эндогенную активность пероксидазы и неспецифическое связывание антигена при комнатной температуре в течение 20 мин. После повторной промывки PBS, срезы инкубировали с специфическими антителами во влажной камере в течение ночи при температуре 4 ° С. Были использованы следующие первичные антитела: GOLPH3 антитела на 1:100, п-МРМ-антитело в 1:200, п-Akt-антитело в 1:200, п-p70S6 антитела в 1:100, и п-4Е-ВР1 антитела на 1 :200. Для отрицательного контроля, первичное антитело было заменено PBS, а остальные этапы были выполнены, как описано выше. Затем образцы промывали PBS, а агент полимер усиливающий был добавлен в секциях при комнатной температуре в течение 20 мин. После промывки срезы ткани обрабатывали с HRP-меченый козы к антителам кролика IgG, биотинилированным анти-кроличьим иммуноглобулином, а также сложного реагента стрептавидина с пероксидазой в течение 30 мин. Срезы затем визуализируется в свежем растворе 3-3 'диаминобензидина, гематоксилин контрастирующая и 0,1% соляной кислоты (для облегчения разделения цветов). И, наконец, слайды были установлены в нейтральной камеди и анализировали с помощью светлого поля микроскопа
. <Р> Степень иммунным каждого участка ткани оценивали независимо друг от друга двумя опытными патологоанатомов, которые были слепы к клиническим данным пациентов. Уровни экспрессии белка оценивали с помощью полуколичественной балльной системы, основанной на общий процент положительно окрашенных клеток опухоли и интенсивности окрашивания. Процент положительно окрашенных клеток оценивали в соответствии со следующими критериями: 0 (≤5% положительных опухолевых клеток окрашиваются), 1 (6-25% положительных опухолевых клеток окрашиваются), 2 (26-50% позитивные опухолевые клетки окрашивали), 3 (≥51% положительных опухолевых клеток окрашивали). Интенсивность окрашивания оценивали, используя шкалу от 0 до 3, как не следует: 0 (без окрашивания), 1 (слабое окрашивание = светло-желтый), 2 (умеренное окрашивание = желто-коричневый), 3 (сильное окрашивание = коричневый). Для анализа, итоговая сумма очков и 4; ЛТ были определены как низкую экспрессию, и множество ≥4 были определены как высокий уровень экспрессии
ПЦР с обратной транскрипцией
<р> Суммарную РНК экстрагировали из тканей с использованием свежих. TRIzol реагента (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Праймеры ОТ-ПЦР, используемые в исследовании, были разработаны и синтезированы Шанхай Sangon биологической инженерии Technology &Amp; Услуги ООО β-актина, использовали в качестве внутреннего эталона. Информация о последовательности праймеров, используемых в исследовании показано в Таблице 4. ОТ-ПЦР проводили с использованием двухстадийного способа. Один микрограмм тотальной РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК при 37 ° С в течение 60 мин и 85 ° С в течение 5 с. ПЦР Затем проводили в соответствии со следующими условиями: нагрев до 95 ° С в течение 5 мин; 40 циклов денатурации в течение 30 сек при 95 ° С, отжиг при 60 ° С в течение 30 с, а также расширение в течение 30 с при 72 ° С; и окончательное удлинение при 72 ° С в течение 7 мин, после чего реакционную смесь хранили при 4 ° С. Семь микрограммов конечного продукта ПЦР были загружены на 2% -ном агарозном геле для электрофореза и анализа изображений в ультрафиолетовом свете. Количество Одна программа (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) использовали для измерения полос и бета-актина серую ценность продуктов ПЦР.
Статистический анализ
<р> Все статистические анализы проводились с использованием статистического пакета для социальных наук, версия 17.0 (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). RT-PCR и вестерн-блоттинга результаты представлены как среднее ± SE. Одностороннее ANOVA с последующим LSD тестов множественного диапазона был использован для анализа различий между группами. Отношения между GOLPH3 и п-МРМ, п-Akt, п-4E-BP, и уровни экспрессии р-p70S6 оценивались с использованием коэффициента корреляции Пирсона. Ассоциации между экспрессии белка и клинико-патологическими переменными были проанализированы с помощью теста хи-квадрат. P &л; 0,05 (двусторонний) был использован в качестве уровня статистической значимости
Результаты
Отношения между клинико-патологическими переменных и уровней экспрессии белка с помощью иммуногистохимии протеин выражение GOLPH3 и MTOR сигнализации, связанных белков Подготовка в Вестерн-блоттинга корреляция между выражением GOLPH3 и сигнализации сигнального пути, связанных с белками Обсуждение
<р> Иммуногистохимическое обнаружение. показали, что GOLPH3, п-Akt и п-4Е-ВР1 были наиболее распространены в цитоплазме, и фосфорилированный м-ТОР (п-МРМ) также присутствует в ядре на низком уровне. Тем не менее, р-p70S6 окрашивание наблюдалось только в цитоплазме. GOLPH3 и фосфорилированные /МРМ проводящих путей белки Akt были более высоким уровнем экспрессии в желудочном группе рака, чем в ткани пара-карцинома и парными нормальных групп слизистая оболочка (рис 1, таблица 5). Кроме того, отношения между выражением клинико-патологических переменных и белка были исследованы и обобщены в таблице 1, Таблица 2 и Таблица 3. Статистический анализ показал, что положительная скорость экспрессии GOLPH3 в желудочном группе рака сильно коррелирует с гистологической степени ( р
= 0,011), глубина инвазии ( р
= 0,007), отдаленных метастазов ( р
= 0,002), а также вовлечение лимфатических узлов ( р
&л; 0,004), в то время как он существенно не коррелируют с возрастом или полом ( р
= 0,801 и 0,833, соответственно). Интересно, что наблюдалось в соответствие с высоким уровнем экспрессии GOLPH3 высокие уровни экспрессии р-Akt, п-МРМ, п-4Е-ВР1 и п-p70S6.
экспрессия мРНК GOLPH3 и MTOR сигнального пути, связанной с генов путем RT-PCR
<р> извлекали РНК из рака желудка, пара-карциномы ткани и подобранных образцов нормальных тканей от восьмидесяти пациентов с раком желудка. Уровни экспрессии GOLPH3 и MTOR сигнального пути, связанных генов, включая Akt, МРМ, эукариотической трансляции фактор инициации 4Е связывающий белок 1 (4Е-BP1) и p70 рибосомальной белка S6 киназы (p70S6), были оценены в трех группах по РТ -PCR. Уровни экспрессии этих генов в карциноме желудка были выше, чем в карциномы прилегающих тканей, и значительно выше, чем в спаренных нормальных тканях желудка. Средняя плотность и распределение экспрессии GOPLH3, МРМ, Akt, 4Е-ВР1 и p70S6 показаны на рисунке 2. Статистический анализ показал, что уровни экспрессии GOLPH3 и MTOR сигнальных генов пути, связанные с существенно отличались в различных тканях желудка ( р
&л;. 0,05)
<р> Вестерн-блоттинг анализ показал, что GOLPH3, п-МРМ, п-Akt1 , были также высказаны п-4EB-P1 и п-p70S6 в рак желудка, рак соседнему, и в паре нормальные желудка группы слизистую оболочку. Интересно отметить, что постепенное увеличение наблюдалось в средних значений вышеупомянутых уровней экспрессии белка из парного нормальной слизистой оболочки желудка группы к желудочному группе рака (рисунок 3), и существует значительная разница между группами ( р <бр> &л;. 0,05)
<р> корреляционный анализ Пирсона показал сильную корреляцию между экспрессией GOLPH3 и что сигнального пути (таблица 6). Статистический анализ показал, что продукт моментов коэффициенты корреляции Пирсона были положительными в желудочном группе рака. Интересно, что экспрессия GOLPH3 была тесно связана с п-МРМ, п-4Е-ВР1 и п-p70S6 ( г
= 0,410, 0,203 и 0,128, соответственно, р
&л; 0,05) выражение , а также положительная корреляция между GOLPH3 и п-Akt был почти значимым ( р
= 0,054). В то же время, наблюдались сильные корреляции между экспрессией р-4E-BP1 и упомянутых выше белков, за исключением п-МРМ. Фосфорилированные выражение MTOR также положительно коррелирует с п-Akt выражения ( г
= 0,521, р
= 0,027). Выражение фосфорилированные p70S6 также коррелируют с выражением р-Akt ( г
= 0,274, р
&л; 0,001) и п-МРМ ( г
= 0,451, р
= 0,007).
<р> Хотя заболеваемость раком желудка снизилась в последние годы [2], он по-прежнему представляет серьезную угрозу для здоровья человека. Большинство больных раком желудка диагностируется на поздних стадиях, и, как правило, представляют с опухолевой инвазии и метастазированию. За последнее десятилетие, никаких больших улучшений не было достигнуто в отношении ранней диагностики и лечения рака желудка. Понимание молекулярной биологии основного рака желудка до сих пор отсутствует. С 2009 года GOLPH3 получила значительное внимание как онкоген. Этот белок локализуется на цитоплазматической поверхности транс-Гольджи и тесно связан с туморогенности [3], [8]. Крупные исследования показали, что избыточная экспрессия GOLPH3 происходит в нескольких злокачественных опухолей человека, в том числе эпителиального рака яичников, почечно-клеточной карциномы, глиобластомы, пищевода плоскоклеточный рак и рак полости рта язык [12] - [16]. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что GOLPH3 участвует в онкогенеза и коррелирует с плохим прогнозом. Кроме того, в одном исследовании сообщалось, что GOLPH3 избыточная экспрессия связана с плохим клиническим исходом рака желудка [17]. Тем не менее, точные механизмы, лежащие в основе этого отношения остаются неясными, и точный молекулярный механизм, с помощью которого GOLPH3 участвует в онкогенеза желудка рак, инвазию и метастазирование мало изучен. Для того, чтобы исследовать потенциальный молекулярный механизм, с помощью которого GOLPH3 участвует в раке желудка, мы впервые использовали иммуногистохимии, чтобы найти выражение GOLPH3 в различных тканях желудка. Мы обнаружили, что GOLPH3 в основном локализованы в цитоплазме, и оно было выражено в рак желудка, пара-карциномой и парными нормальных желудочных тканей. Интересно отметить, что темпы экспрессии высокого GOLPH3 в желудочном раковых тканей были 75,00% (60 из 80), 43,75% (35 из 80) в карциноме-прилегающих тканей и 12,50% (10 из 80) в нормальных тканях, соответственно ( Таблица 5). Кроме того, GOLPH3 избыточная экспрессия наблюдалась в желудочной ткани рака и была тесно связана с повышением желудочной инвазии и метастазирования рака. Наши результаты свидетельствуют о том, что экспрессия высокой GOLPH3 была в значительной степени связано с гистологической класса ( р
= 0,015), глубина инвазии ( р
&л; 0,001), метастазов в лимфатических узлах ( р
&л; 0,001), а также отдаленных метастазов ( р
= 0,006) в желудочном раковых тканей (Таблица 1). Кроме того, вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР проводили для оценки экспрессии GOLPH3 на белка и уровней мРНК. Интересно отметить, что результаты были аналогичны тем, которые наблюдаются при анализе иммуногистохимии. Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что повышенная экспрессия GOLPH3 тесно связана с частотой развития рака желудка, и GOLPH3 могут быть вовлечены в желудочном инвазии и метастазирования рака.
<Р> В последнее время все большее число путей передачи сигнала, как сообщается, участвовать в опухолевой инвазии и метастазировании. Млекопитающим мишень рапамицина (МРМ), которая представляет собой серин /треонин киназа вниз по течению фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) /Akt путь передачи сигналов и включает в себя mTORC1 (МРМ /Раптор) и mTORC2 (МРМ /Rictor), регулирует синтез белка, что клетки пролиферацию, клеточный метаболизм и дифференцировки [18], [19]. Активированный mTORC1 последовательно непосредственно активирует нижестоящих мишеней, в том числе p70S6 киназы (S6K) и фактор эукариотической инициации 4E-связывающий белок 1 (4Е-BP1) и mTORC2 было показано, играет критическую роль в Akt фосфорилирования по Ser473, что приводит к полной активации АКТ [20], [21]. Хотя Akt непосредственно активирует MTOR /Raptor, он может также прямо или косвенно активировать p70S6 киназа /4EBP1 Тропинка этот путь путем фосфорилирования опухолевого супрессора TSC2 [22]. /МРМ путь Akt было показано, что часто происходит в различных злокачественных опухолей, включая рак молочной железы, рак мочевых путей, рак яичника, опухолях поджелудочной железы нейроэндокринных, человеческий медуллобластоме, меланому, рак эндометрия и гепатоцеллюлярной карциномы; Таким образом, этот путь представляет собой возможный терапевтическую мишень во многих видов рака [23] - [30]. В нашем исследовании, ОТ-ПЦР и Вестерн-блоттинга показал, что уровни мРНК и экспрессии белка, п-Akt, п-МРМ, п-4E-BP1 и п-p70S6 в желудочном группе рака были значительно выше, чем в пара-карциномы ткани и спаренные нормальные группы желудочные ткани (Рисунок 2, Рисунок 3). Для того, чтобы определить, являются ли уровни экспрессии р-Akt, п-МРМ, п-4Е-ВР1 и п-p70S6 были связаны с критическими характеристиками клинико-патологическими, мы провели дальнейшие анализы. В этом исследовании, 81,25% из 80 больных раком желудка имели высокую экспрессию р-МРМ, 77,50% имели высокую экспрессию р-4E-BP, 76,25% имели высокую экспрессию р-p70S6, и только 75.00% имели высокую р-Akt выражение (Таблица 5). Удивительно, но Иммуногистохимическое анализ показал, что уровни экспрессии этих белков выражений были связаны с глубиной инвазии, лимфатических узлов и отдаленных метастазов, а также гистологического класса, но не были связаны с полом или возрастом (таблица 1, таблица 2 и таблица 3) , Эти результаты свидетельствуют о том, что /МРМ путь Akt активируется при раке желудка и может играть важную роль в желудочном онкогенеза рака, инвазию и метастазирование.
<Р> В последнее время, Скотт и др. показали, что GOLPH3 может способствовать трансформации клеток и рост опухоли путем конститутивной активации сигнального пути МРМ в клетках меланомы и что GOLPH3 стимулирует сигнальный путь МРМ через mTORC1 и mTORC2 комплексов, тем самым способствуя росту опухолевых клеток и пролиферацию [8]. Тем не менее, остается неясным, является ли также это явление происходит в желудочном раковых тканей. Насколько нам известно, наше исследование является первым, чтобы исследовать патогенез GOLPH3 способствовали онкогенеза, инвазию и метастазирование рака желудка. Наши данные показывают значительные позитивные отношения между выражением GOLPH3 и п-МРМ, п-4Е-ВР1 и п-p70S6 ( г
= 0,410, 0,203 и 0,128, соответственно, р <бр> &л; 0,05). Однако корреляция между экспрессией GOLPH3 и п-Akt не было статистически значимым ( г
= 0,258, р
> 0,05) (таблица 6). В частности, значительно выше выражение GOLPH3 сопровождалось высокой экспрессии р-МРМ, п-4E-BP1 и п-p70S6 в желудочном раковых тканей, и это соотношение было значительно связано с глубиной инвазии, гистологического класса, и лимфатический узел и отдаленных метастазов. Наши результаты показали различные отношения между GOLPH3 и Akt /MTOR сигнальных белков, а также положительной связи между GOLPH3 и п-Akt был почти значительным. Конкретные причины этого отношения между GOLPH3 и п-Akt остаются неясными и должны провести дальнейшее расследование. Мы полагаем, что размер выборки может быть слишком мал. Кроме того, GOLPH3 может в первую очередь активировать Akt /MTOR сигнальный путь через активированный mTORC1 комплекса, а не mTORC2 комплекса, что приводит к p70S6 и 4E-BP1 фосфорилирования, влияя тем самым на рак желудка. Эти результаты указывают на то, что GOLPH3 могут быть вовлечены в желудочном онкогенеза рака, инвазию и метастазирование через ненормальной активации Akt /МРМ сигнального пути.
<Р> В заключение, данное исследование обнаружены высокие уровни экспрессии GOLPH3, п-Akt, п-МРМ, п-4Е-ВР1 и п-p70S6 в желудочном группе рака сильно коррелирующие с гистологическим класса, глубина вторжения, отдаленных метастазов и поражения лимфатических узлов с помощью анализа клинико-патологическими переменных и иммуногистохимии. Кроме того, экспрессия GOPLH3 сильно коррелирует с активацией Akt /МРМ сигнального пути в желудочном образцах рака человека. На основании этих результатов, мы полагаем, что GOLPH3 может зависеть прогрессирование и метастазирование рака желудка путем активации Akt /МРМ сигнального пути. Более того, мы полагаем, что ингибирование экспрессии генов в пути передачи сигналов GOLPH3 и МРМ может представлять собой новую мишень для терапии рака желудка. И, наконец, вторжение и миграционные механизмы GOLPH3 при раке желудка до сих пор нуждаются в дальнейшем исследовании.
Пересадка вагинальной жидкости может помочь в лечении рецидивирующего бактериального вагиноза
Лейкоциты и их роль в головном мозге
Новый суперактивирующий рецептор макрофагов может объяснить гипервоспаление при тяжелой форме COVID-19
Дырявый кишечник и микробный дисбактериоз могут способствовать цитокиновому шторму в тяжелых случаях COVID-19
Микробы могут предсказать летальный исход у пациентов с COVID-19 на ИВЛ
Дети имеют иммунитет к SARS-CoV-2
Математическая модель выявляет риск заражения SARS-CoV-2 после трансплантации фекальной микробиоты
В их новой статье, доступной на bioRxiv * сервер препринтов, Американские исследователи из некоммерческой организации OpenBiome использовали математическую модель для моделирования полезности различ
Новое исследование может помочь предотвратить смертельные инфекции у младенцев
Недоношенные дети, рожденные до 28-30 недель жизни, подвержены высокому риску многих осложнений, среди которых очень велики шансы умереть от инфекции, начинающейся в кишечнике. Новое исследование, опу
Растительная пища может передавать человеку устойчивые к антибиотикам супербактерии
Исследователи из Университета Южной Калифорнии (USC) на ежегодном собрании Американского общества микробиологов обнаружили, что растительная пища может передавать микробиому кишечника устойчивость к а