gástrica mouse modelos de tumores gástricos com prostaglandina E
2 ativação da via mostram perfis de expressão genética semelhante à intestinal-tipo de câncer gástrico humano da arte abstracta
Fundo
cânceres gástrico são geralmente classificados em melhor diferenciada tumor do tipo intestinal e pouco diferenciado do tipo difuso de um acordo com a categorização histológico de Lauren. Embora a indução de prostaglandina E 2 pathway promove tumores gástricos em ratos, em cooperação com desregulados sinalizações Wnt ou BMP, manteve-se por resolver se os modelos gástricas rato tumor recapitular qualquer um tipo de câncer gástrico humano. Este estudo avaliou a similaridade no perfil de expressão entre os tumores gástricos de camundongos transgênicos e vários tecidos de cancros humanos para encontrar tumores humanos de melhor ajuste para os modelos de ratos transgênicos.
Resultados
perfil de expressão global inicialmente encontrados tumores gástricos da COX 2
/mPGES-1 | (C2mE) relacionados com camundongos transgênicos (K19-C2mE
, K19-Wnt1 /C2mE
e K19-Nog /C2mE
) se assemelhava câncer gástrico entre os vários tecidos de cancros humanos incluindo os do cólon, da mama, do pulmão e tumores gástricos. Em seguida, a classificação dos ratinhos transgénicos relacionados com C2mE por uma assinatura do gene para distinguir intestinal- e difusa do tipo tumores humanos mostrou ratinhos transgénicos relacionados-C2mE eram mais semelhantes ao do tipo intestinal, quando comparada com uma difusa. Nós finalmente revelado que a indução de Wnt via de cooperar com a prostaglandina E 2 percurso em ratinhos (K19-Wnt1 /C2mE
ratos) reproduzir ainda mais características de tumores do tipo intestinal gástrica humanos.
Conclusão
Nós demonstraram que camundongos transgênicos relacionadas com C2mE mostram semelhança significativa para intestinal do tipo de câncer gástrico, quando analisados por perfil de expressão global. Estes resultados sugerem que os ratinhos transgénicos relacionadas com C2mE, especialmente K19-Wnt1 /C2mE
ratos, servir como um modelo de melhor ajuste para estudar mecanismo molecular subjacente à tumorigênese dos cancros do tipo intestinal gástrica humanos.
Fundo
cancros gástricos são classicamente divididos em tipo intestinal e tipo difuso com base na classificação histológica de Lauren [1]. cancros gástricos do tipo intestinal são caracterizados por grupos de células mais diferenciadas, coesas e glandular-like. O tipo intestinal é progrediu através de várias etapas, começando com gastrite atrófica que é seguido por intestinal metaplasia, displasia e carcinoma [2, 3]. tipo difuso corresponde a pouco diferenciado, infiltrando-se e as células tumorais não coesivos. Embora tipo difuso não é caracterizado pelas múltiplas etapas procedimentais, isso mostra fenótipo mais metastático com pior prognóstico.
Várias alterações genéticas são observados mais frequentemente em qualquer subtipo de câncer gástrico. Superexpressão de ErbB2
é encontrado seletivamente nos tumores do tipo intestinal e pode servir como marcador de prognóstico para a invasão do tumor [4, 5]. ErbB2
nível de expressão foi relatado para correlacionar com nódulo linfático ou metástases hepáticas [6, 7]. diminuição significativa na expressão de E-caderina (CDH1
) também foi descrita em cancro gástrico preferencialmente do tipo difuso que varia entre 20% a 90% de frequência [8-10]. A expressão diminuída de CDH1
é causada por LOH ou hipermetilação. Curiosamente, hereditária de câncer gástrico difuso é causada por mutações germinativas do gene CDH1
[11, 12]. Além disso, a mutação em polipose adenomatosa coli (APC
) que activa a via Wnt /β-catenina é predominantemente encontrado no cancro gástrico do tipo intestinal [13]. A ciclo-oxigenase-2 (COX-2
) que é uma das enzimas cruciais para sintetizar prostaglandina E 2 é altamente regulados positivamente em cancros do tipo intestinal, quando comparada com aqueles do tipo difuso [14]. Estas alterações genéticas podem ser usados como uma característica de cada tipo de cancro gástrico, bem como as características histológicas.
Assinaturas de gene-abrangendo todo o genoma perfis de expressão de ARNm foram identificados para distinguir intestinal- e cancros gástricos-tipo difuso. Boussioutas et al
. [15] relataram que o gene assinatura distinta para o tipo intestinal exibe a super-regulação de marcadores de proliferação relacionados com a replicação de ADN, montagem do fuso e a segregação de cromossomas. genes regulados negativamente na assinatura está associada com a diferenciação epitelial. Jinawath et al
. [16] também desenvolveu outra assinatura gene que se expressa diferencialmente entre intestinal-tipo e difuso tipo cancros com amostras de tumores gástricos japoneses. A assinatura do tipo intestinal representada reforço da progressão do ciclo celular, enquanto que os genes associar com matriz extracelular (ECM) estão desreguladas na assinatura de tipo difuso. Estas assinaturas pode proporcionar oportunidades de desenvolvimento de biomarcadores para diagnosticar /distinguir os dois tipos em ambas as pesquisas clínicas e pré-clínicas.
Ratos transgénicos que desenvolveram tumores gástricos presentes modelos adequados para decifrar tumorigênese gástrica, e identificar novos alvos terapêuticos. Nós já desenvolvido vários ratinhos transgénicos em que a prostaglandina E via 2 de produção é altamente activada especificamente na mucosa gástrica. K19-C2mE
ratinhos que expressam a COX-2 e
microssomal prostaglandina E sintase-1 (mPGES-1 |) desenvolvem hiperplasia associada à inflamação [17]. Este foi mediado através do recrutamento de macrófagos mucosas. Ao cruzar a K19-C2mE
ratos com K19-Wnt1
ratos, efeito cooperativo de Wnt1 e PGE 2 na tumorigênese gástrica foi investigada. O K19-Wnt1 /C2mE
ratinhos levaram ao desenvolvimento de adenocarcinoma gástrico displásico significar a importância da activação da via Wnt para manter as células progenitoras indiferenciadas [18]. Para examinar o efeito adicional de a supressão da via de BMP no prostaglandina E activação 2, os compostos de murganhos K19-nog /C2mE
foram estabelecidos. O K19-Nog /C2mE
ratos causar o desenvolvimento de hamartomas gástrico que são morfologicamente semelhantes a polipose juvenil (JP) [19]. Embora a análise molecular histológica e hipótese baseada detalhada implicado o papel central da prostaglandina E 2, Wnt e Nog via respectivamente na tumorigênese gástrica, ele permanece indefinida se a seus ratos composto transgénicos K19-C2mE e mostrar semelhança com o tipo intestinal ou tipo difuso de cancros gástricos humanos quando analisados por perfil de expressão global de não-tendenciosa.
a fim de identificar quais tipos de tumores gástricos humanos (tipo intestinal ou difuso) os ratos relacionados com C2mE são mais semelhantes, comparamos o perfil de expressão os dois tipos de câncer gástrico humano com os de K19-C2mE
, K19-Wnt1 /C2mE
e ratinhos transgénicos K19-Nog /C2mE
.
Resultados perfis globais de expressão gênica de animais transgênicos
Nós desenvolvemos anteriormente vários tipos de ratinhos transgénicos em que a prostaglandina E 2 via é ativada. K19-C2mE
camundongos que expressam COX-2 Comprar e mPGES-1 | induzir tumores gástricos hiperplásicas. K19-Wnt1 /C2mE
ratos em que ambos Wnt e prostaglandina E 2 vias são ativadas tumores gástricos displásicas causa. K19-Nog /C2mE
camundongos que expressam noggin, bem como C2mE desenvolver hamartomas gástricas. Para fornecer uma visão sobre o mecanismo molecular de desenvolvimento de neoplasias gástricas, tecidos gástricos dos ratos ratos e do tipo selvagem transgênicas foram sujeitos a análise de microarray. Usando o sistema Affymetrix GeneChip, os níveis de expressão de mRNA foram medidos para 45,037 conjuntos de sondas, que representam genes Entrez e 21,066 5,324 outras sequências. Observou-se aumento da expressão de gene introduzido em cada camundongo transgênico conforme relatado anteriormente [17-19].
visão geral Genoma escala dos dados microarray revelou que as mudanças de expressão nos três modelos de tumor de K19-C2mE
, K19- Wnt1 /C2mE
e K19-nog /C2mE
foram muito semelhantes, ao passo que a sobre-expressão de Wnt1 única ou nog só levou a que as alterações de expressão de uma pequena porção de genes (Figura 1). Isto sugere a maioria das alterações Expressional nos três ratinhos transgénicos que foram causados pela activação da PGE 2 via. Hypergeometric teste para o enriquecimento do gene mostraram que os genes envolvidos na cicatrização de feridas e na resposta inflamatória foram significativamente condensado com o valor p de 1,5 × 10 -21 e 4,2 × 10 -13, respectivamente, no conjunto de genes mudou pela indução C2mE. Figura padrão de expressão 1 Genoma escala de camundongos transgênicos que mostram grandes mudanças são causadas por PGE2 indução. Agrupados em fileiras são 5,440 conjuntos de sondas seleccionadas por limiar de mudança de dobragem de 2 ou superior para a média de tipo selvagem e um valor de p proporção de 0,01 ou menos, e as colunas são mouse agrupadas gástrica amostras por genótipo. Os genótipos estão apresentados no topo do mapa de calor. A escala de cores vermelho-verde representa log10 relação à média das amostras de tipo selvagem, como mostrado em uma barra de cores na parte superior esquerda: A cor vermelha indica que o gene é regulado para cima na amostra, e verde indica regulada para baixo. WT:. Tipo selvagem
Classificação de modelos de tumor de rato sob uma gástrica subtipo de câncer
humanos, a fim de confirmar que os modelos de tumores gástricos rato são semelhantes ao câncer gástrico humano, os perfis de expressão foram comparadas com as de câncer humano amostras. Em primeiro lugar, os dados de mama humano, pulmão, cólon, e tumores gástricos de expressão de genes foram recolhidos a partir do domínio público. Para estimar semelhança entre os tumores gástricos do rato e os quatro tipos de cânceres humanos, classificação supervisionada de análise de componentes principais (PCA) foi realizado utilizando 1.925 genes que foram alterados mais de duas vezes em mais de 50 amostras de todas as amostras humanas. O PCA com os genes selecionados descobriram que as amostras gástricas rato de ratos relacionados com C2mE foram mais estreitamente agrupado a cancros gástricos humanos entre os quatro tecidos examinados, indicando as mudanças de expressão globais nos tumores gástricos da ratinhos transgénicos se assemelhava aqueles em cânceres gástrico humano ( Figura 2). Figura 2 mudanças de expressão geral em tumores gástricos de ratinhos transgénicos relacionados com C2mE são mais semelhantes às de cancros gástricos humanos. K19-C2mE
, K19-Wnt1 /C2mE
e K19-Nog /C2mE
tumores gástricos do mouse e gástrico humano (difusa, intestinal, e do tipo misto), cólon, mama e câncer de pulmão foram plotados por componentes principais 1 a 3 (PC1 a PC3) calculada utilizando 1.925 genes que foram alteradas por mais de duas vezes em mais de 50 amostras de todos. A contribuição cumulativa dos três componentes foi de 32%. Pontos mostrados em azul: cancros gástricos humanos; cyan: cancros do cólon humanos; vermelho: cancros do pulmão humanos; verde: cancros da mama humanos; Magenta:. rato tumores modelo
Em seguida, a fim de analisar qual subtipo do cancro gástrico mostra semelhança de espécies cruzadas, os tumores de ratinho foram comparadas com a do tipo intestinal gástrica humana e cancros do tipo difuso na base dos seus perfis de expressão. perfil de expressão Estudos anteriores de amostras de tumores gástricos humanos foram identificados assinaturas de gene que classificam os dois tipos. tipos intestinal e difuso são os dois principais tipos de cancro classificadas com base na morfologia microscópica [1]. Boussioutas et al
. [15] demonstraram que os genes de proliferação foram sobre-expressos em tumores do tipo intestinal do que em tumores do tipo difuso; Em contraste, os genes de proteínas de matriz extracelular foram regulados positivamente em difusa do tipo em comparação com tumores do tipo intestinal. A fim de determinar qual o tipo de cancro gástrico humano, os modelos de ratinho são mais semelhantes a, que normalizados os dados humanos [20] para a média de amostras normais, e seleccionado 122 genes que foram alterados no sentido oposto em tipo intestinal e do tipo difuso [ver arquivo adicionais 1], para classificar os tipos intestinal e difuso usando os dados normalizados. A taxa de detecção falsa foi estimada como sendo 2,4%. A precisão da previsão da classe usando este conjunto de genes foi estimada como sendo 85% por leave-one-out validação cruzada de amostras humanas. Nós também examinou se este conjunto de genes pode ser usado para classificar corretamente um outro conjunto de dados câncer gástrico [15]. O conjunto de dados de teste incluiu 22 intestinal-tipo, 35 difusa do tipo, e dez amostras normais, e foi normalizada para a média de todas as amostras normais. A taxa de erro foi de 25% no total, e 29% e 18% em cancros diffuse- e do tipo intestinal, respectivamente.
Para comparar os padrões dos genes assinatura no mouse tumores de expressão para aqueles em cancros gástricos humanos, agrupamento hierárquico análise foi realizada com dados gástricas do mouse e intestinal- humana e conjuntos de dados do tipo difuso. O padrão de expressão dos nossos genes assinatura modificados para distinguir os cancros gástricos intestinal- e difusa do tipo revelou que os tumores gástricos de camundongos transgênicos relacionadas com C2mE eram mais semelhantes aos intestinal do tipo cancros gástricos humanos do que para difundir tipo cancros gástricos humanos (Figura 3 ). Pela análise discriminante linear, todos os tumores gástricos relacionados com C2mE exceto uma amostra K19-Wnt1 /C2mE foram classificados como tumores do tipo intestinal. A Figura 3 perfis de expressão de tumores gástricos relacionados com C2mE estão agrupados ao câncer gástrico do tipo intestinal humana. Agrupados em linhas são 93 genes que se reuniu valor-p inferior a 0,001 e mudar de direção oposta entre cancros gástricos humanos do tipo intestinal e do tipo difuso, e agrupadas em colunas são tumores gástricos humanos e do rato. Como uma medida de distância, foi utilizada a correlação cosseno. método de ligação para o agrupamento era ligação média. Amostras mostrados em vermelho: câncer gástrico tipo intestinal humana; azul: tipo difuso humana; amarelo: K19-C2mE
ratos; magenta: K19-Wnt1 /C2mE
: ciano: K19-Nog /C2mE
. A escala de cores vermelho-verde representa log10 relação à média de tipo selvagem ou amostras normais, como mostrado em uma barra de cores na parte superior esquerda.
Padrão de expressão dos genes frequentemente desregulamentado no cancro gástrico humano de uma forma específica subtipo
sabe-se que a amplificação ou a sobre-expressão de alguns genes encontram-se de uma maneira específica do subtipo. mutações no gene E-caderina ou perda são especificamente encontrado em câncer gástrico tipo difuso [11, 12]. Em contraste, a amplificação do gene ErbB2
é observado apenas no tipo intestinal, e não relatado no tipo difuso [6, 7]. LOH de excluídos no carcinoma colorretal (DCC
) é predominantemente observada em cerca de metade do tipo intestinal [21, 22]. Os níveis de expressão dos três genes foram comparados entre os ratos e os tipos de cancro gástrico humano (Tabela 1). CDH1
expressão foi significativamente diminuída no tipo difuso humano, mas não no tipo intestinal como esperado. Nos três ratinhos transgénicos, o gene CDH1
não foi reduzida em qualquer de ratinhos transgénicos, em comparação com o tipo selvagem, inferir que uma das mudanças mais característicos de cancro gástrico humano tipo difuso não foi observado nos modelos de ratinho. -Regulação de ErbB2
foi observado em dados de microarranjos do tipo intestinal humano, e também em nossos dados de mouse. DCC
expressão foi reduzido em tipo intestinal humana, como esperado, enquanto que a redução do gene foi observado no modelo de ratos, especialmente em K19-Wnt1 /C2mE
ratinhos. As expressões dos três genes que definem o tipo de tecido do cancro gástrico humano também apoiam a ideia de que os modelos de ratos são mais semelhantes aos do tipo intestinal cancer.Table 1 alterações expressão humana de genes específicos do subtipo do mouse e tumores gástricos humanos.
mouse
Humano
|
C2mE
Wnt1/C2mE
Nog/C2mE
Diffuse
Intestinal
CDH1
1.13*
1.00
1.10
0.43*
1.09
ErbB2
1.37*
1.43*
1.25*
0.92
1.37*
DCC
0.91
0.85*
0.94
0.98
0.71*
Expressão valores são mostrados em proporções médias de log (base 10) para o tipo selvagem ou as amostras normais. O asterisco indica o teste t de p-valor < 0,05.
Diferença entre os modelos de rato activadas por via PGE2
tumores a partir de três modelos de rato com PGE 2 ativação da via mostram histologia diferente. K19-C2mE
desenvolve hiperplasia com infiltração de macrófagos, enquanto K19-Wnt1 /C2mE
desenvolve displasia [17, 18]. K19-Nog /C2mE
desenvolve hamartoma semelhante à polipose juvenil humana [19]. Nós próxima tentativa de identificar genes diferencialmente expressos entre os três modelos do rato que nos permitiu avaliar o modelo de melhor ajuste entre os três para estudar o câncer tipo intestinal gástrica. Com ANOVA limiar de p-valor de 0.001, foram selecionados 155 genes que foram diferencialmente reguladas entre os três grupos. Poucos destes genes mostrou alterações de expressão na mesma direção entre K19-Wnt1 /C2mE Comprar e K19-Nog /C2mE
(Figura 4). genes da via Wnt PORCN
, uma aciltransferase necessário para a secreção de proteínas Wnt, β-catenina (CTNNB1
) e Tcfe2a
(TCF3
em humanos) foram sobre-expressos em K19-Wnt1 /C2mE
ratos, mas não no K19-nog /C2mE
(Figura 4). genes da via /BMP TGF-beta Smad3 Comprar e TGFBR2
também foram up-regulada e Bmp2
foi regulada para baixo em K19-Wnt1 /C2mE
mas não em K19-Nog /C2mE
. genes reguladores Figura 4 Wnt /β-catenina são regulados positivamente em ratinhos Wnt1 /C2mE. Agrupados em linhas são 155 conjuntos de sondas que foram diferentemente reguladas entre os três genótipos, K19-C2mE
, K19-Wnt1 /C2mE
e K19-Nog /C2mE
, usando ANOVA limiar de valor-p 0,001. Colunas mostram amostra gástrica do rato agrupados por genótipo e os genótipos são mostrados no topo do mapa de calor. escala de cores é o mesmo como na Figura 1. Em
K19-nog /C2mE
ratinhos, alguns genes que promovem a tumorigénese eram cima ou regulada para baixo, embora não tenham sido reportados na jusante de BMP via. ROCKII
era especificamente sobre-regulada em K19-Nog /C2mE
, e sua sobre-expressão está associada com a progressão em vários tipos de cancros através de modulação organização do citoesqueleto de actina. Regulada genes incluem Ramp2 Comprar e PPARGC1A
, e sua inativação ou sub-expressão foi mostrado para contribuir para o cancro do pulmão e desenvolvimento hepatoma, respectivamente.
Desde a desregulamentação do Wnt via incluindo APC
ou CTNNB1
mutação têm sido mais freqüentemente observada em intestinal-tipo em comparação com o tipo difuso [23, 24], os resultados indicaram que K19-Wnt1 /C2mE
poderia oferecer um modelo que melhor se ajusta a tumores do tipo intestinal entre os três camundongos C2mE relacionadas com.
Discussão
O presente estudo indicou que os cancros gástricos do tipo intestinal humano exibiu semelhança significativa para ratos relacionados com C2mE, especialmente para K19-Wnt1 /C2mE
ratos por perfil de expressão global. A predição do tipo de tumor semelhante ao perfil de expressão global é consistente com o fenótipo dos ratinhos transgénicos. evidência acumulada indicou que o nível de inflamação que é causada pela sobre-regulada expressão /actividade de COX-2 e
mPGES-1
é mais grave no cancro gástrico do tipo intestinal em comparação com um tipo difuso, embora ambos os tipos de tumores estão relacionadas com Helicobacter pylori
que são conhecidos por induzir inflamação local infectado com o [14, 25-28]. Este conhecimento apoia a nossa observação de que tumores gástricos em ratos relacionados com C2mE em que PGE 2 via é ativada exibem semelhança com intestinal-tipo tumores gástricos. Além disso, ativar e inativar mutações em CTNNB1 Comprar e APC
são observados mais frequentemente em câncer do tipo intestinal. Nenhuma APC
LOH /mutação foram observados no cancro gástrico do tipo difuso, ao passo que 60% foram encontrados no intestino do tipo um [24, 29, 30]. Mutação no CTNNB1
foi predominantemente observada em intestinal-tipo de um [13]. Isso também é concordante com a nossa conclusão anterior de que K19-Wnt1 /C2mE
ratos que só desenvolver adenocarcinoma entre os três ratos relacionados com C2mE ativar baixo genes de transmissão da via Wnt /β-catenina.
Normalmente, vários tipos de transgênicos ratinhos para um tipo de tumor são necessários para examinar semelhança na expressão global de perfilar entre modelos de murganhos de tumor e humanas, uma vez que os genes que eram para cima ou para baixo-regulado em cada modelo de ratinhos foram extraídos em comparação com a média de todas as amostras de tumor examinados. Com esta abordagem, Lee et al
. [31] analisaram dados de expressão de genes de sete carcinomas do mouse hepatocelular (HCC), incluindo cinco gemas com HCC humanos para identificar modelos que recapitulam câncer humano ou de um tipo de câncer humano, e descobriu que algumas subclasses de HCC humana modelos ratos imitar no padrão de expressão. Hershkowitz et al
. [32] também usou o mesmo método de normalização, e descobriu que os padrões de expressão característicos observados em tumores de mama humanos foram conservados em modelos de tumores de mama 13 de rato. Uma vez que os dados de perfil de expressão disponíveis para tumores gástricos mouse são limitados a nossa K19-C2mE
e seus ratos compostos, tomamos estratégia diferente para apreciar a semelhança entre tumores gástricos entre as duas espécies. Em vez da utilização da média de todas as amostras no conjunto de dados de referência para calcular os rácios de expressão, que os dados normalizados gástrico do rato a média de amostras de tipo selvagem. Para comparar os perfis de expressão com aqueles ratinhos de cancros gástricos humanos, o gene assinatura para classificar intestinal- humana e cancros gástricos-tipo difuso também foi modificada a partir de um original de normalizar os dados de expressão para a média das amostras gástricas normais. Isto permitiu-nos para revelar que camundongos transgênicos relacionadas com C2mE assemelham tumores gástricos do tipo intestinal humana no perfil de expressão.
Comparação de expressões de genes entre modelos de ratos mostrou que a indução simultânea de Wnt1 e PGE 2 desregulados não só a expressão do gene de CTNNB1 Comprar e PORCN
na sinalização Wnt, mas também Smad3 Comprar e TGFBR2
em TGF-β de sinalização /BMP. Dada a diafonia entre o TGF-p /BMP e Wnt vias tem sido reportada em vários estudos anteriores, a expressão desregulada de genes nas vias de sinalização adicionais poderia ser explicado por feedback positivo e negativo para as vias de sinalização Wnt-regulado. Por exemplo, a sinalização de BMP é conhecida por suprimir a actividade β-catenina em células estaminais intestinal [33]. sinalização BMP pode ser reprimida em K19-Wnt1 /C2mE
, porque Bmp2
expressão foi significativamente regulada para baixo. Aumento da Smad3 Comprar e TGFBR2
pode ser resultado do feedback negativo por BMP supressão de sinalização, como demonstrado em um estudo sobre TGF-β fibrose induzida [34]. Em contraste com ratos transgénicos K19-Wnt1 /C2mE
, as alterações dos genes via Wnt expressão não foram observados em K19-C2mE Comprar e K19-Nog /C2mE
ratos. Seria de grande interesse para analisar ainda mais o crosstalk de vias de sinalização nos ratinhos transgénicos compostos.
Conclusões
camundongo geneticamente modificado (GEM) modelos fornecem ferramentas úteis para estudar mecanismo de desenvolvimento de neoplasias, para validar um novo alvo para drogas desenvolvimento e para encontrar biomarcadores. Avanços na engenharia genética permitiram-nos desenvolver uma variedade de modelos transgênicos ou knockout de doenças humanas. A principal questão sobre o uso de pedras preciosas como modelos de doenças é se o modelo recapitula a doença humana. Nós já desenvolveu vários camundongos transgênicos tumor gástrico em que a prostaglandina E 2 via é activado. Embora realizamos análise histológica detalhada com os ratinhos transgénicos, ele permaneceu uma incógnita se as mudanças moleculares globais nos ratinhos transgénicos reproduzir características dos tumores gástricos humanos ou não. Este relatório forneceu evidência inicial de que K19-C2mE Comprar e seus ratos compostos, K19-Nog /C2mE
, K19-Wnt1 /C2mE
, mostra semelhança com câncer gástrico humano, especialmente para intestinal do tipo um por a análise do perfil de expressão de ARNm. Entre outros, extração de genes para cima ou para baixo-regulados especificamente em K19-Wnt1 /C2mE
ou K19-Nog /C2mE
respectivamente inferir que K19-Wnt1 /C2mE
camundongos iria fornecer modelo de melhor ajuste do mouse para os tumores gástricos do tipo intestinal. Estes achados seria potencialmente fornecer vários benefícios em nossos futuros estudos, incluindo esquema de desenvolvimento de neoplasias gástricas e ótima identificação do alvo terapêutico.
Métodos
amostras de tecido de estômago
Construção de ratinhos transgénicos foram descritos em nossos estudos anteriores [17-19 ]. Resumidamente, o K19-Nog
estirpes K19-Wnt1 Comprar e sobre-expressar Wnt1 Comprar e Nog
genes, respectivamente, especificamente no estômago. K19-C2mE
sobre-expressa o gene
mPGES-1 e COX-2
genes simultaneamente e especificamente no estômago. K19-Wnt1 /C2mE Comprar e K19-Nog /C2mE Quais são ratinhos transgénicos composto com K19-Wnt1 Comprar e K19-Nog
, respectivamente; tanto linhagens de camundongos têm K19-C2mE
. Para a expressão profiling, três do tipo selvagem C57BL /6, cinco K19-Wnt1
, três K19-C2mE
, cinco K19-Wnt1 /C2mE
, dois K19-Nog
, e três K19- foram utilizados Nog /C2mE
ratos. Todos os animais utilizados neste estudo foram ratos do sexo feminino com idades entre 18-65 semanas. O estômago glandular de cada ratinho foi cortado para análise de micro-arranjo. Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com as boas práticas de animais, tal como definido pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC).
Microarrays
GeneChip mouse Genome 430 2.0 Arrays (Affymetrix, Inc.) foram usados para monitorar o perfis de expressão das amostras gástricas. O ARN total foi preparado utilizando o RNeasy Mini Kit (QIAGEN) após o tratamento com Trizol (Invitrogen Corp.), e marcadas com cRNA foi preparado utilizando os protocolos Affymetrix padrão. As intensidades dos sinais dos conjuntos de sondas foram normalizados pelo método Ferramentas RMA Affymetrix potência implementado em software resolvedor (Rosetta Biosoftware), e log dos valores da relação à média das amostras de tipo selvagem foram calculados para cada amostra usando o resolvedor. Todos os dados de microarranjos foram depositados em Gene Expression Omnibus (GEO), sob a adesão conjunto de dados não. GSE16902 [35].
Dados de microarranjos humanos Públicas
Cancro humano gástrica [20] e do cancro da mama [36] dados de microarranjos foram recuperados do suplemento on-line no banco de dados Stanford Microarray [37]. Os dados câncer gástrico inclui 68 do câncer do tipo intestinal, 13 do tipo difuso câncer, e 15 amostras gástricas normais. Os dados de câncer de mama incluem 115 tumor de mama e sete amostras de tecidos normais. Os dados em humanos com cancro do cólon [38], incluindo 100 câncer colorretal e cinco amostras de tecidos normais, foram recuperados do NCBI GEO sob GSE5206 adesão. O tumor de pulmão dataset Ann Arbor [39] incluindo 86 adenocarcinomas do pulmão e 10 amostras de pulmão não-neoplásicas foi obtida no site da United States National Cancer Institute [40]. valores de expressão foram transformados para log10 (relação às médias geométricas de amostras normais), a fim de comparar com os dados do mouse.
intestinal vs. genes tipo de assinatura difusas
dados de tumor gástrico humano de Chen et al
. [20] foram utilizados para desenvolver um intestinal vs. tipo difuso classificador. Foram selecionados genes que preencheram os seguintes critérios: (1) teste t valor p < 0.001 entre os dois grupos, (2) alterações opostas na expressão média de genes assinatura em tumores do tipo intestinal e que a assinatura genes em tumores do tipo difuso. A taxa de detecção falsa foi estimada pelo método de Hochberg Benjamini e [41]. As classes de tumores de rato e humanos amostras foram previstos por análise discriminante linear utilizando a pontuação assinatura definida pela seguinte fórmula: Assinatura
pontuação = (razão de log médio de genes regulados positivamente em tumores do tipo intestinal e regulada para baixo em difusa -tipo tumores) - (rácio de log médio de genes regulados negativamente em tumores do tipo intestinal e sobre-regulada em tumores do tipo difuso)
Combinando mouse e dados de expressão de genes humanos
a fim de combinar dados do mouse com humanos dados de microarranjos de câncer gástrico, rato e dados humanos foram re-ratioed à média geométrica de wild-tipo e normais amostras, respectivamente. Quando não havia mais de uma sonda marcada para um gene de uma micromatriz, as proporções médias de expressão foram usadas para o gene. Em seguida, usando apenas os genes homólogos que são representados em ambas as matrizes, incorporamos o mouse e conjuntos de dados humanos em um único conjunto de dados. O microarray rato 45,037 contém conjuntos de sondas, que correspondem a genes Entrez 21,066, e o microarray humano contém 6,688 sondas, que correspondem a genes Entrez 4.463. Quando eles foram fundidos, foram identificados 4.094 genes homólogos.
Análise estatística
O teste hypergeometric para o enriquecimento Gene Ontology foi realizada utilizando o Gene Set Annotator desenvolvido pela Rosetta Inpharmatics [42]. Para as demais análises estatísticas neste estudo, foi utilizado o software MATLAB (MathWorks Inc.).
Declarações
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Tsutomu Kobayashi por sua ajuda na experiência microarray, e Dr. Shinji Mizuarai para sua discussão e comentários sobre o manuscrito material suplementar eletrônico
12864_2009_2499_MOESM1_ESM.XLS de arquivo adicionais. 1: Uma lista de tipo intestinal vs. genes assinatura de tipo difuso. adesão sequência, símbolo do gene, e a média de log10 proporções em intestinal-tipo e no tipo difuso, respectivamente, são mostrados para cada um dos 122 cDNAs. (XLS 28 KB) Autores 'arquivos enviados originais para imagens
Abaixo estão os links para os autores' arquivos originais apresentados para imagens. 'arquivo original para a figura 1 12864_2009_2499_MOESM3_ESM.pdf Autores' 12864_2009_2499_MOESM2_ESM.pdf Autores arquivo original para a figura 2 'arquivo original para a figura 3 12864_2009_2499_MOESM5_ESM.pdf Autores' 12864_2009_2499_MOESM4_ESM.pdf Autores arquivo original para a figura 4
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