Background
Tällä hetkellä se on vakiintunut, että syöpä syntyy kroonisesti tulehtuneeseen kudokseen. Useita NOD-, kuten reseptorit (NLRs) muodossa inflammasomes, solunsisäinen Multiproteiinikompleksit kriittinen tuottaa kypsän pro-inflammatoristen sytokiinien (IL-1β: n ja IL-18). Koska krooninen tulehdus mahalaukun limakalvo on seurausta Helicobacter pylori Materiaalit ja menetelmät Viisikymmentäyksi geneettisten polymorfismien genotyypattiin 310 kiinalaisten (87 ei-cardia GC tapauksissa ja 223 säätimet toiminnallinen dyspepsia). Lisäksi geeni-ilmentymisen 84-molekyylien mukana NLR signalointireitin arvioitiin THP-1-solut altistettiin kaksi H. pylori s Tulokset CARD8 Johtopäätökset Novel assosiaatioita polymorfismien NLR signalointireitin ( CARD8 Citation: Castaño-Rodríguez N, Kaakoush NO, Goh KL, Fockin KM, Mitchell HM (2014) NOD-kaltainen reseptori merkinanto Pathway in helikobakteeri Toimittaja: David M. Ojcius, University of California Merced, Yhdysvallat vastaanotettu: 02 maaliskuu 2014; Hyväksytty: 08 toukokuu 2014; Julkaistu: 05 kesäkuu 2014 Copyright: © 2014 Castaño-Rodríguez et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään. Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain syövän neuvosto New South Wales, Australia (Grant No.66 /04). EI. Kaakoush tukee Early Career apurahan National Health ja Medical Research Council, Australia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole. yleinen esiintymistiheys mahasyövän (GC) vaihtelee suuresti eri maissa. Mukaan globaali syövän tilastoja, yhteensä 952000 uutta GC tapauksissa ja 723000 GC liittyvät kuolemat arvioidaan tapahtuneen vuonna 2012, mikä vastaa 6,8% kaikista syöpätapauksista ja 8,8% kaikista syöpään liittyvien kuolemien [1]. Yli 70% uusista tapauksista ja kuolemista tapahtuu kehitysmaissa, joissa on korkein ilmaantuvuus on raportoitu Itä-Aasiassa, Itä-Euroopassa sekä Keski- ja Etelä-Amerikka [2]. taudinaiheuttajabakteerin Helicobacter pylori Germ-line koodattu reseptorit tunnetaan kuvio tunnustamatta reseptorit (PRRS) ovat osa synnynnäisen immuunijärjestelmän ja ovat keskeinen havaitsemiseen muuttumattoman mikrobien motiivien tunnettu taudinaiheuttaja -associated molekyyli- kuviot (PAMPs). PRR on jaettu viiteen erillistä geneettistä ja toiminnallista tyyppejä: nukleotidi-sitova oligomerointi domeeni (NOD) kaltaisia reseptoreita (NLRs), Toll-like-reseptorien, C-tyypin lektiini-reseptoreihin, retinoiinihappo-geenin, (RIG) -I-like reseptoreihin ja poissa melanooman 2 (AIM2) kaltaisia reseptoreita [5] [6]. NLR perhe ei vain tunnista PAMPs mutta myös vahingoittaa liittyvä molekyyli kuviot (vaimentaa) sytoplasmassa, jotka ovat endogeenisten ligandien jälkeen valmistetuissa kudosvaurion tai solukuolema [7]. NLRs ominainen rakenne sisältää keskellä nukleotidin sitova ja oligomerointi (NACHT) domain, joka on läsnä kaikissa NLR perheenjäsenet, C-terminaalista leusiinirikkaita toistoja (LRR) sekä N-terminaalista kaspaasi rekrytointi (CARD) tai pyrin (PYD ) verkkotunnus. Perustuen fylogeneettistä analyysiin NACHT verkkotunnuksia, se määritettiin, että NLR perhe käsittää kolme subfamilies: 1) NOD perhe, johon kuuluu NOD1-2, NOD 3 /NLRC3, NOD4 /NLRC5, NOD5 /NLRX1 ja CIITA, 2) NLRPs lukien NLRP1-14 (tunnetaan myös nimellä NALPs), ja 3) IPAF alaperhe, joka koostuu IPAF (NLRC4) ja NAIP [7]. NLRP3 inflammasome, kaikkein täysin tunnettu inflammasome, koostuu NLRP3 telineen proteiinia, apoptoosin liittyvät pilkkuja kaltaisen proteiinin (ASC) ja kaspaasi-1. NLRP3 vuorovaikutuksessa ja rekrytoi sovittimen ASC kautta PYD-PYD vuorovaikutus [8]. Tämä vuorovaikutus johtaa rekrytointiin kaspaasi-1, solunsisäinen aspartaatti erityisiä kysteiiniproteaasiin, mikä myöhemmin johtaa kypsymisen ja vapauttaa proinflammatoristen sytokiinien, kuten IL-1β ja IL-18. H. pylori Siksi aiemmat tutkimukset osoittavat selvästi, että vastauksena H. pylori Materiaalit ja menetelmät genotyypin polymorfismit Osallisena NOD kaltainen Receptor merkinanto Pathway Ethics selvitys. Tutkimus oli hyväksymä Human eettisen komitean (HREC) ja University of New South Wales (UNSW) (HREC 08115 ja HREC 02144). Kirjallinen suostumus saatiin kunkin yksittäisen rekrytoitiin tutkimukseen. Oppiaineet olivat kiinalaisten henkilöille, joille tehtiin ruoansulatuskanavan yläosan tähystykseen Changi General Hospital (Singapore) ja University Hospital Malesian (Kuala Lumpur), tammikuusta 2004 huhtikuu 2007 Potilaita, joiden tiedetään saaneen ihmisen immuunikatovirus tai jolle olisi määrätty steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden, antimikrobiaineisiin tai happoa hillitsevien kahden kuukauden jakson aikana ennen rekrytointia jätettiin pois. kahdeksankymmentäseitsemän potilaille äskettäin diagnosoitu primaarinen cardia GC (International Classification of Diseases, 9 th tarkistamista, koodi 151), joka perustuu histologista vahvistusta kutsuttiin osallistumaan tutkimus. Vertailuryhmä koostui 223 yksilöiden diagnosoitu toiminnallisen dyspepsian (FD), joka määriteltiin jatkuva tai uusiutuva oireita (kipua tai epämukavuutta keskitetty ylävatsassa) puuttuessa orgaanisen sairauden (kuten yllä endoskopia) mukaisesti Rooma II luokitusjärjestelmän [14]. Helicobacter pylori H. pylori polymorfismit valinta. Sähköiset tietokannat (PubMed, Scopus, Science Direct, Ovid, Biosis Ennakot, Scirus tietokannat, CINAHL, IMBIOMED, Scielo ja syreenit) etsittiin helmikuuhun 2013 polymorfismien mukana NLR signalointireitin jotka olivat yhteydessä syöpään, tarttuva tauti tai olivat toiminnallisesti merkityksellisiä. Viisikymmentä yksi polymorfismien 6 geenejä, joita raportoitiin olevan vähäinen alleelifrekvensseiltään > 1% National Center for Biotechnology Information (NCBI) dbSNP, valittiin analyysin (taulukko S1 taulukoissa S1). genotyypitys 51 valitun polymorfismien NLR signalointireitin kunkin mukana tutkimuksessa, genominen DNA uutettiin perifeerisen kokoverinäytteistä käyttäen QIAamp veren DNA Mini Kit, kuten on kuvattu valmistajan (Qiagen, Chadstone, Australia). DNA rehydratoitiin steriiliin veteen ja normalisoitiin 10 ng /ul räätälöityjä SNP genotyypin soveltamalla matriisin laserdesorptio ionisaatio-lentoaika (MALDI-TOF) massaspektrometria, The Sequenom MassARRAY iPLEX? Määrityksessä (San Diego, CA , USA) [16], [17] Australian Genome Research Facility Ltd, St Lucia, University of Queensland, Australia. Yksi polymorfia, joita ei voitu sisällyttää Sequenom MassARRAY iPLEX määrityksessä, joka tunnetaan nimellä NLRP3- neljä polymorfismien ( CARD8 tilastollinen analyysi. paritonta Studentin t Nisäkässoluviljelmillä. ihmisen monosyyttileukemiasolulinja THP-1 (koodi: TIB-202) (American Type Culture Collection, Manassas, USA), kasvatettiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, Mulgravessa, Australia), 1 mM natriumpyruvaattia (Invitrogen), 2500 mg /ml natriumbikarbonaattia (Invitrogen ) ja 100 ug /ml penisilliini-streptomysiiniä liuos (Invitrogen). Soluja ylläpidettiin 25-cm 2 kudosviljelypulloon (Greiner-Bio-On; Frickenhausen, Saksa) 37 ° C: ssa 5% CO 2. H pylori Infektio määrityksessä. THP-1-solut ympättiin 6-kuoppaiselle viljelylevylle pitoisuutena 5 x 10 5 solua /ml, ja sen jälkeen erotellaan makrofagien forboli myrastate asetaattia (Sigma-Aldrich) 72 tuntia. [24] ennen bakteeri-infektio, nisäkkään soluja inkuboitiin antibiootti-väliaineessa. H. pylori jälkeen infektio, ei-haastoi ja H. pylori geeniekspression data analyysi, ΔΔ Ct-tekniikkaan perustuva menetelmä suhteellisen kvantifioinnin toteutettiin käyttäen Web-pohjainen RT 2 Profiler PCR Array Data Analysis versio 3.5 (http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). Ainakin kaksi-kertaiseksi muutoksia (≥2, ≤0.5) ja P THP -1-solut ympättiin, eriytettyä ja infektoitiin MOI-arvolla 1, kuten aiemmin on kuvattu. Proteiinit uutettiin käyttäen RIPA-puskuria, erotettiin 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi geelit, ja siirrettiin metanoli-käsitelty polyvinylideeni dimembraaneille käyttäen Trans-blot-solujen siirtojärjestelmän (Bio-Rad). Kalvot immunomerkatut kanin anti-ihmis-polyklonaalisia vasta-aineita vastaan NLRX1 (1:200) tai hiiren anti-humaani monoklonaalisia vasta-aineita β-aktiini (1:1000) (Santa Cruz). Vuohen anti-kani-anti-hiiri-IgG-vasta-aineita on kytketty HRP (1:2000; Bio-Rad) käytettiin sekundaarisia vasta-aineita, vastaavasti. Kalvot tutkittiin mukaisesti Pierce ECL Western blotting Alustan protokolla (Thermo Scientific; Scoresby, Australia). Kliininen Ominaisuudet kliininen ominaisuudet oppiaineista kuten sukupuoli, H. pylori polymorfismit geenit osallisena NOD kaltainen Receptor merkinanto Pathway liittyy mahasyövän etnisiä kiinalaisia Yksilöt viisikymmentäyksi polymorfismien geenien mukana NLR signalointireittiin olivat genotyyppi on 310 kiinalaisten yksilöitä (87 GC tapauksissa ja 223 FD valvonta). Puhelutaajuuden Kaikkien valittujen polymorfismit oli 97-100% tässä tutkimuksessa. Kaikki polymorfismien NLR signalointireitin havaittiin olevan HWE kontrolliryhmässä osoittaa ei-merkitsevä χ 2-arvot lukuun ottamatta CARD8 alleeli genotyyppi taajuuksia sekä syrjäisimmät alueet ja 95%: n luottamusväli jäljellä 27 polymorfismit on esitetty taulukossa 1 ja taulukossa S4 taulukoissa S1. CARD8 Haplotyyppifrekvenssianalyysi perustuvia analyyseja ovat tehokas lähestymistapa leikellä arkkitehtuurin monimutkaisia sairauksia. Nykyisessä tutkimuksessa EM-algoritmi tunnistettu 25 haplotypes taajuudella > 0,01 GC tapauksissa (taulukko S5 taulukoissa S1). Käyttämällä suuria haplotyyppi kontrolliryhmässä ohjearvon haplotyyppi, kaksi CARD8-NLRP12 polymorfismit Geenit Osallisena NOD kaltainen Receptor merkinanto Pathway liittyy Helicobacter pylori Koska H. pylori yhteinen vaikutus Helicobacter pylori lisäksi analyysit tehtiin sen arvioimiseksi paitsi läsnäolo tai puuttuminen valitun polymorfismien mutta myös H. pylori Helicobacter pylori edelleen karakterisoimiseksi vaikutuksen H. pylori Koska tulehdus on tunnusmerkki mahasyövän, me edelleen analysoineet ilmentymisen proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien altistuessaan kaksi H . pylori Helicobacter pylori Kolmetoista geenit koodaavat NLRs arvioitiin tässä tutkimuksessa jäsenet mukaan luettuina IPAF alaperheen (NAIP, NLRC4), NLRPs (NLRP1, NLRP3-6, NLRP9, NLRP12) ja nyökkää (NOD2, NLRC5, NLRX1 ja CIITA) (kuvio 1 B). Ilmentymisen viisi geeniä, jotka koodaavat NLRs merkittävästi säännelty H. pylori-altistettiin soluja (NLRC4, NLRC5, NLRP9, NLRP12 ja NLRX1) (taulukko 5). Näistä NLRP12 (taita sääntely: 0,03, p-arvo: 0,016298) ja NLRX1 (taita sääntely: 0,02, p-arvo: 0,01762) oli merkittävästi säädellä vähentävästi helikobakteeri GC026-haastoi soluissa. Koska validoivien lisäksi Western blot analyysit tutkimalla NLRX1 ilme, tehtiin. Johdonmukaisesti, vähentynyt NLRX1 tasot löytyivät THP-1-solujen altistettiin sekä helikobakteeri GC026 ja 26695 (tukeminen Information kuva S3). Koska NF-KB säätelee negatiivisesti NLRP12 ja NLRX1, me edelleen verrattuna ilmaus NFKB1 Helicobacter pylori Expression muiden molekyylien mukana ei vain NLR signalointireitin mutta myös karsinogeneesissä analysoitiin myös vertaamalla THP-1-solujen vasteita sekä H. pylori Keskustelu GC pidetään nyt monitekijäinen prosessi, jossa bakteeri-, ympäristö- ja isäntä genetiikan tekijät ovat mukana eri vaiheissa syövän patofysiologiassa. Tällä hetkellä se on vakiintunut, että syöpä syntyy kroonisesti tulehtunut kudos, ja tämä on erityisen merkittävä ruoansulatuskanavassa [4]. Koska krooninen tulehdus mahalaukun limakalvo on seurausta H. pylori Tietääksemme tämä on ensimmäinen saatujen todisteiden mukaan polymorfismit mukana NLR signalointireitin liittyy lisääntynyt riski GC, ihmisiin. Monimuuttuja tilastollinen analyysi osoitti, että CARD8 H. pylori
infektion, tutkimme rooli geneettisten polymorfismien ja geenien ilmentymistä mukana NLR signalointireitin on H. pylori
infektioiden ja niihin liittyvien mahasyövän (GC).
junia, GC026 (GC) ja 26695 (gastriitti).
-rs11672725, NLRP3
-rs10754558, NLRP3
-rs4612666, NLRP12
-rs199475867 ja NLRX1
-rs10790286 osoitti merkittäviä assosiaatioita GC. On Monimuuttuja-analyysissä, CARD8
-rs11672725 pysyi riskitekijä (OR: 4.80, 95% CI: 1,39-16,58). Edelleen, NLRP12-
rs2866112 lisäsi riskiä H. pylori
infektio (OR: 2,13, 95% CI: 1,22-3,71). Tilastolliset analyysit arvioidaan yhteisvaikutus H. pylori
infektio ja valitun polymorfismien paljasti vahvan assosiaatioita GC ( CARD8
, NLRP3
, CASP1
ja NLRP12
polymorfismit). Geenien ilmentyminen analysoidaan, viisi geeniä, jotka koodaavat NLRs merkittävästi säännelty H. pylori
-challenged solut ( NLRC4
, NLRC5
, NLRP9
, NLRP12
ja NLRX1
). Mielenkiintoista, jatkuva säätely ylöspäin NFKB1
samanaikaisesti alas-säätely NLRP12
ja NLRX1
havaittiin H. pylori
GC026-haastoi soluissa. Lisäksi NF-KB kohdegeenien koodaavat proinflammatoristen sytokiinien, kemokiinien ja molekyylit osallistuvat karsinogeneesissä olivat selvästi säädellään ylöspäin H. pylori
GC026-haastoi soluissa.
, NLRP3
, NLRP12
, NLRX1
, ja CASP1
) ja GC havaittiin Chinese yksilöitä. Meidän geneettisten polymorfismien ja geenien ilmentymisen tulokset korostavat merkitystä NLR signalointireitin vuonna mahasyövän ja sen tiiviissä vuorovaikutuksessa NF-KB.
Infektio ja Related mahasyövän A tapauskontrollitutkimuksessa ja Gene Expression analyysit. PLoS ONE 9 (6): e98899. doi: 10,1371 /journal.pone.0098899
Johdanto
on olennainen etiologisista tekijä GC (IARC, 1994), mutta aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että sen lisäksi, H. pylori
infektio ja ruokavaliotekijät, isäntä genetiikka edistää GC [3]. Geneettisten polymorfismien ovat viime vuosina määrittäjinä alttius sairauksille ja vakavuus, mikä pätee erityisesti ruoansulatuskanavan pahanlaatuisen [4]. Siksi polymorfismit sisällä liittyvät geenit synnynnäisen ja adaptiivisen immuniteetin saattaisi olla tärkeä rooli patogeneesissä H. pylori
infektio ja kehittäminen H. pylori
-aiheiset komplikaatioita, mukaan lukien GC.
infektio, ensimmäiset neljä fysikaalis-kemialliset esteet ovat Limakerroksen, mahalaukun epiteeli- solujen TLR ja NLRs. Muutamissa tutkimuksissa on arvioitu vuorovaikutusta NLR signalointireitin ja H. pylori
. Esimerkiksi, ensimmäinen tutkimus Basak et al. [9] osoitti, että ei vain H. pylori
lipopolysakkaridi (LPS) aktivoi kaspaasi-1, mutta että tämä kaspaasi-1 aktivaatio osallistuu LPS-indusoidun IL-1β kypsymistä. Myöhemmin, Hitzler et ai. [10] osoitti, että H. pylori
infektio aktivoi kaspaasi-1, joka johtaa IL-1β /IL-18-käsittely ja eritys, sekä viljellyissä dendriittisolut (DC) ja in vivo
. Johdonmukaisesti, kahteen tuoreeseen tutkimukseen, joissa käytetään ihmisen mahalaukun solulinjoja, vahvisti lisääntynyt ilmentyminen kaspaasin 1, IL-1β ja IL-18 H. pylori
infektoiduista soluista [11], [12]. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa Kim et al. [13] on osoittanut, että eritystä IL-1β by DC tartunnan H. pylori
vaatii TLR2, NOD2 ja NLRP3 inflammasome.
, inflammasome riippuva kaspaasi-1 aktivointi on kriittinen tuottaa kypsän proinflammatoristen sytokiinien jotka ovat keskeisiä Th1 vasteet liittyvät mahan immunopatologia. Ottaen huomioon, että tiedetään vähän rooli inflammasomes ja muiden molekyylien mukana NLR signalointireitin vastauksena H. pylori
infektio, ja että toiminnallisesti asiaankuuluvat polymorfismeilla geeneissä tämän varren immuunijärjestelmän on potentiaalia vaikuttaa suuruutta ja suuntaa isännän vasteen infektio, tutkimme rooli NLR signalointireitin, kuten inflammasome- liittyviä molekyylejä, vuonna H. pylori
-aiheiset GC kehitystä arvioimalla 51 geneettinen polymorfia kiinalaisten yksityishenkilöiden, tunnettu Riskipopulaatioon GC, ja käsitellään geenin ilmentymistä 84 molekyylien mukana NLR signaalireaktioteissä monosyyttisolulinjalla linja altistuessaan H . pylori
.
Tutkittavat.
havaitsemiseen.
IgG näissä kiinalaisten yksityishenkilöiden määritettiin käyttämällä in-house entsyymi-immunosorbenttimääritys [15] ja immunoblot (MPD helikobakteerin Blot 2,1, MP Biomedicals, Australia).
genotyypin määrittäminen tekniikoilla.
42 emäsparin-VNTR, oli genotyyppi kautta standardi-PCR. Alukkeet suunniteltiin Oligo Primer Analysis Software versio 6,71 (Molecular Biology Insights, Inc; Colorado Springs, USA). Kokeet suoritettiin käyttäen 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, USA). PCR-tuotteet alistettiin 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla ja visualisoitiin UV-läpivalaisulla käyttäen Gel Doc 2000 System (Bio-Rad, Hercules, USA). Alukesekvenssejä ja lämpökäsittelyyn ehdot genotyypityksen polymorfismi on kuvattu taulukossa S2 taulukoissa S1.
-rs2043211, CARD8
-rs6509368 CARD8
-rs12984929 ja NLRP3
-rs10754558) genotyyppi MALDI-TOF-massaspektrometrialla valittiin satunnaisesti vahvistusta tuloksista käyttäen reaaliaikaista PCR. Alukkeen sekvenssit ja lämpökäsittelyyn olosuhteissa esitetään taulukossa S2 taulukoissa S1. Koska menetelmän validointi täytäntöön genotyypin määritystä NLRP3-
42 emäsparin-VNTR, sekvensointi analyysit tehtiin 10% satunnaisesti valittua tutkittavat näytteet, klo Ramaciotti Centre, UNSW, Australia.
-testi käytettiin analysoimaan kliinisiä tekijöitä. Suora laskenta menetelmää käytettiin arvioitaessa genotyypin ja alleeli taajuuksilla. Poikkeaminen Hardy-Weinberg tasapaino (HWE) testattiin käyttäen chi-neliö hyvyys fit testi (χ 2). Määritys kytkentäepätasapainossa (LD) perustui uskottavuusosamäärä jossa merkitystä havaittu todennäköisyys suhde löytyy laskemalla null jakelu tämä suhde alle hypoteesi nostolaitteen tasapainossa, käyttämällä permutaatio menettelyä [18]. Haplotyypin inference suoritettiin avulla Odotus-maksimointi (EM) algoritmia monen lokuksen genotyypin data [19]. Kertoimet suhde (OR) ja 95% luottamusvälit (CI) laskettiin avulla Fisherin todennäköisyys testi (kaksisuuntainen p
-arvot). Korjaamiseksi varten häiritsevien tekijöiden binäärinen logistinen regressio (LR) säätää H. pylori
asema ja sukupuoli suoritettiin. P
-arvot < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Laatu suodattimet sulkeminen polymorfismien tilastolliseen analyysiin sisältyi soittaa hinnat alle 95% ja poikkeama HWE. Aineisto analysoitiin ohjelmien Arlequin versio 3.1 [20], GraphPad Prism versio 5.02 (GraphPad Software Inc, San Diego, USA) ja SPSS versio 19.0.0 (SPSS Inc., Chicago, USA).
Gene Expression molekyylien Osallisena NOD kaltainen Receptor merkinanto Pathway
bakteeriviljely.
kanta GC026 ( Caga
+, häkki
+, CAGL
+, CAGT
+ vaca
s1 m1 +, Baba
+, oipA
+, Dupa
+ ja Saba
+) eristettiin GC potilas yliopistollisessa sairaalassa Malesian Kuala Lumpur [21], [22]. H. pylori
kannan 26695 ( Caga
+ ja vaca
s1m1 +) eristettiin potilaalta, jolla gastriitti [23] (ATCC koodi 700392). Molemmat H. pylori
kantoja kasvatettiin kaksi päivää hevosen veriagarlevyille (veri agar Base No.2 täydennetty 6% steriiliä defibrinoidusta hevosen verta (Oxoid, Heidelberg West, Vic., Australia) 37 ° C: ssa anaerobiseen astiaan, joka sisälsi kaasungenerointijärjestelmän kit (Oxoid) tarjota mikroaerobisen ilmakehässä 6% O 2, 10% CO 2 ja 84% N 2.
-kannat GC026 ja 26695 lisättiin sitten alustassa infektiokertoimella 1, ja inkuboitiin 6 tuntia 37 ° C ja 5% CO 2. bakteerien pitoisuus lisätään määritettiin perustuen standardikäyrä ja optinen tiheys (OD) lukemat 595 nm käyttäen Bio-Rad mikrolevylukijalla malli 550 (Bio-Rad). Varsinainen pitoisuus lisätty vahvistettiin laskemalla pesäkkeen muodostavat yksiköt (CFU) viljeltiin hevosen veriagarlevyille jälkeen sarjalaimennokselle bakteerisuspensiota.
RNA: n uutto, cDNA valmistamiseksi ja PCR-taulukot.
-challenged THP-1-soluja käytettiin mRNA: n eristämiseksi käyttäen Qiagen RNeasy Mini Kit, kuten on kuvattu valmistajan (Qiagen). Analysointia varten geeni-ilmentymisen 84-molekyylien mukana NLR signalointireitillä, cDNA syntetisoitiin 0,8 ug kokonais-RNA: sta käyttäen RT 2 First Strand cDNA Kit (Qiagen) ja edelleen analysoitiin käyttäen Human Inflammasome RT 2 Profiler PCR array (PAH-097R) (Qiagen) suositusten mukaan valmistaja. Geeniekspressioprofiilien saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta on H. pylori
GC026-tartunnan, H. pylori
26695-tartunnan ja vastaavat ei-tartunnan (kontrolli) näytettä. Kokeet suoritettiin käyttämällä Roottorin Gene Q cycler (Corbett Life Sciences, Doncaster, Australia).
-arvot < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.
SDS-PAGE ja Western-blottaus
Tulokset
infektiotilanteesta ja mediaani-ikä on esitetty taulukossa S3 taulukoissa S1. Miessukupuoli havaittiin olevan enemmän hallitseva GC potilailla kuin FD valvonta, joka osoittaa positiivinen yhteys kehittämisen GC tässä kiinalaisten väestö (OR: 2,15, 95% CI: 1,29-3,58, P
-arvo: 0,0036). H. pylori
infektio havaittiin olevan läsnä 68,7% ihmisistä tässä tutkimuksessa (73/87 GC potilasta ja 140/223 FD valvonta). Vertailu esiintyvyys H. pylori
infektion GC potilaiden ja FD valvonta osoitti, että H. pylori
infektio oli riskitekijä kehittämiseen GC (OR: 2,38, 95% CI: 1,41-3,99, P
-arvo: < 0,0001). Vaikka aiheita tässä tutkimuksessa oli sovitettu mukaan 5-vuotiaat ikäryhmissä, mediaani-ikä GC potilaista (65,3 vuotta) oli merkittävästi suurempi kuin FD valvonta (54,3 v) ( P
-arvo: <0,0001).
-rs12984929 (χ 2: 35.98), CARD8-
rs4802445 (χ 2: 5,87) ja CARD8-
rs6509368 (χ 2: 5,43). Kaksikymmentä yksi polymorfismien NLRP3
(n = 5), NLRP12
(n = 3), NLRX1
(n = 3), ASC
(n = 4) ja CASP1
(n = 6) todettiin olevan ei-polymorfisen tässä kiinalaisten väestöstä (taulukko S1 taulukoissa S1).
-rs11672725 TT-genotyyppi oli vahva yhdessä GC vuonna bivariate tilastollisen analyysin (OR: 4.80, 95% CI: 1,39-16,58). Lisäksi CARD8
-rs11672725, toinen neljä polymorfismit osoitti raja tuloksia bivariate analyysissä ( NLRP3
-rs10754558, NLRP3
-rs4612666, NLRP12
-rs199475867 ja NLRX1
-rs10790286) (taulukko 1). Edelleen monimuuttuja tilastollisia analyysejä korjattuna H. pylori
infektio ja miessukupuoli, osoitti, että CARD8
-rs11672725 TT genotyyppi pysyi riskitekijä GC tässä kiinalaisten väestöstä (taulukko 2).
(HAP1 ja Hap8), yksi NLRP3
(Hap3) ja kolme NLRX1-CASP1
(Hap21, 23 ja 24) haplotypes havaittiin lisäävän GC tässä kiinalaisessa väestöstä. Mielenkiintoista, HAP1 suhtautuu CARD8
-rs11672725 T-alleelin, ja Hap21 ja Hap23 satama NLRX1
-rs10790286 C-alleelin, joka osoittaa yhdenmukaisuus saadut tulokset alleeli ja genotyyppi analyysejä.
Infektio kiinalaisessa Yksilöt
tiedetään olevan merkittävä riskitekijä liittyy GC edelleen analyysit suoritettiin arvioimaan yhdistyksen välillä geneettisten polymorfismien osallistuvien NLR signalointireitin ja H. pylori
infektio. Mielenkiintoista, meidän kiinalaisten tapauskontrollitutkimuksessa osoitti, että NLRX1
-rs10790286, NLRP12
-rs2866112, NLRP12
-rs4419163 ja ASC
-rs8056505 liittyi merkitsevästi suurentunut H. pylori
infektio näillä henkilöillä (taulukko S6 taulukoissa S1). Monimuuttuja tilastollinen analyysi vahvisti, että NLRP12
-rs2866112 liittyi suurentunut H. pylori
Kiinan yksilöt (OR: 2,13, 95% CI: 1,22-3,71).
Infektio ja geneettisten polymorfismien Merkittävästi lisää riskiä mahasyövän kiinalaisten Yksilöt
asemaa suhteessa riskin GC, joka yrittää määrittää olemassaolon biologisen vuorovaikutuksen muodossa synergiasta tai antagonismin. Silmiinpistävän, yksilöt kätkeminen kymmenen valitun polymorfismien ( CARD8
-rs10405717, NLRP3
-rs12079994, NLRP3
-rs3806265, NLRP3
-rs4612666, NLRP12
-rs2866112, NLRP12
-rs4419163, NLRX1
-rs10790286, CASP1
-rs2282659, CASP1
-rs530537 ja CASP1
-rs61751523) ja tartunnan H. pylori
havaittiin olevan suurin riski GC, suurin osa näistä syrjäisimpien on alueella 4,0-5,0 (taulukko 3). Sitä vastoin ilman H. pylori
infektio, CARD8
-rs2043211 merkittävästi vähensi GC (OR: 0,19, 95% CI: 0,06-0,63).
Vaikutteet Expression of useita molekyylejä Osallisena NOD kaltainen Receptor merkinanto Pathway
molekyylien mukana NLR signalointireitillä, arvioimme ilmentymistä 84 geeniä, jotka koodaavat NLRs, muut inflammasome komponentit, alipaineensäätöventtiileillä, pro-inflammatoristen sytokiinien, pro-inflammatoristen kaspaasien ja molekyylien mukana alavirran signalointia, THP-1- -johdannainen makrofagit altistuksen jälkeen kaksi erilaista H. pylori
kantoja (GC026 ja 26695). Vuonna H. pylori
GC026-haastoi THP1 soluja, 49-geenit ilmentyvät differentiaalisesti verrattuna kontrolliryhmään (taulukko S7 taulukoissa S1 ja kuvio S1 kuvissa S1). Näistä tilastollisesti merkitsevä ylössäätöä ja alas-säätely vähintään kaksinkertaiseksi löydettiin 17 ja 28 geenit, vastaavasti (taulukot 4 ja 5). Kolmekymmentä viisi geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä kontrolliryhmän ja ryhmä altistettiin H. pylori
26695 (taulukko S7 taulukoissa S1 ja kuvassa S2 kuvissa S1). Näistä tilastollisesti merkitsevä ylössäätöä ja alas-säätely vähintään kaksinkertaiseksi löydettiin 5 ja 23 geenit, vastaavasti (taulukot 4 ja 5).
Helicobacter pylori
Kannat Associated mahalaukun syöpä ja gastriitti johtavat eri ekspressiotasoja sytokiinit ja kemokiinit
kantoja. Ilmaisu yhdeksän geeniä, jotka koodaavat pro-inflammatoristen sytokiinien ( IFNB1
, IL1B
, IL12B
, IL6
, IL33
ja TNF
) ja kemokiinien ( CXCL1
, CXCL2, CCL5-
) olivat merkittävästi säädellään ylöspäin THP-1-solujen altistettiin sekä H. pylori
GC026 ja 26695 kantoja (taulukko 4). Lisäksi voimakas immuunivaste ( CXCL1
, CXCL2
, CCL5-
, IL6
, IL12B
, TNF
ja IFNB1
) vastaan aloitettiin H. pylori
GC026 (kuvio 1A). Mielenkiintoista on, useita geenejä, jotka koodaavat kemokiinien ( CCL2
ja CCL7
) ja sytokiinien ( IL18
, TNFSF11
ja CD40LG
) on säädellä vähentävästi H. pylori
-challenged THP-1-soluissa (taulukko 5).
Infektio Tulokset Up-regulation NFKB1
kanssa Samanaikainen merkitty alas-asetus NLRP12
ja NLRX1
ja RELA
välillä H. pylori
GC026- ja 26695-haastoi soluissa. Huomattavasti, vaikka RELA
osoittivat alentuneita tasoja THP-1-solut altistuvat sekä H. pylori
kantoja (fold sääntely: 0,49, p
-arvo: 0,044673 ja taita sääntely: 0,26, p
-arvo: 0,131017 varten H. pylori
GC026 ja 26695, vastaavasti), tilastollisesti merkitsevä säätely ylöspäin NFKB1
havaittiin vain H. pylori
GC026-haastoi soluja (fold sääntely: 2,50, p
-arvo: 0,006825) (kuvio 1 C).
Kasvattaa Expression of PTGS2
ja BIRC3
kantoja. Mielenkiintoista, PTGS2
oli merkitsevästi säädellään ylöspäin THP-1-soluissa altistettaessa sekä H. pylori
kantoja, H. pylori
GC026-haastoi soluja (fold sääntely: 54,03, p
-arvo: 0,0247) osoittaa huomattavasti suuremmat ekspressiotasoja verrattuna H. pylori
26695-haastoi soluja (fold sääntely: 19.56, p
-arvo: 0,016089) (kuvio 1 d). Edelleen, toinen geeni osallistuu Karsinogeneesin BIRC3
, oli yksinomaan säädellään ylöspäin H. pylori
GC026-haastoi soluja (fold sääntely: 12,28, p
-arvo: 0,001638) (kuvio 1 D).
infektio ja tämä bakteeri on aluksi kohdistettu PRRS tutkimme roolia molekyylien mukana NLR signalointireitin in H. pylori
infektioiden ja niihin liittyvien GC.
-rs11672725 TT-genotyyppi on johdonmukainen riskitekijä GC Kiinan yksilöitä. CARD8
, joka sijaitsee 19q13, koodaa kaspaasi rekrytointi domeenin proteiinia 8 (CARD8), joka tunnetaan myös nimellä TUCAN, jonka on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa NLRP3, tukahduttaa NF-KB: n aktivoimalla signaaleja ja on yli-ilmentynyt ihmisen syöpäkudoksissa mukaan lukien munasarja-, keuhko- ja rintasyövän kudosten [25] - [27]. Tähän mennessä vain yksi tutkimus, suoritettiin Saksan väestöstä, on arvioinut roolia tämän polymorfismin tautiin [28]. Nämä kirjoittajat osoitettu assosiaatiota CARD8
-rs11672725 ja peräsuolen syövän, mutta ei onnistunut osoittamaan mitään merkittäviä tuloksia (OR: 1,02, 95% CI: 0,86-1,21) [28]. Erot syöpätyypin ja tutkimuspopulaatiosta voisi selittää nämä ristiriitaiset tulokset.