Plos ONE: microRNA-9 Zavira širjenju, invazijo in metastaze želodca raka celic skozi ciljanje ciklin D1 in Ets1

Povzetek

Novi dokazi kažejo, da je spremenjen microRNA-9 (miR-9) izraz vpleteni v napredovanje raka želodca. Vendar natančne vloge in temeljne mehanizme miR-9 v jedrskega orožja, invazijo in metastaze raka želodca še vedno ni znan. V tej študiji je bila miR-9 ugotovljeno, da so navzdol regulirano in obratno povezana z izražanjem ciklina D1 in virusom proti-ETS erythroblastosis E26 onkogena homolog 1 (Ets1) v želodcu tkivih rakom in celičnih linij. Bioinformatika analiza je pokazala domnevnega miR-9 veznih mest v 3'-neprevedenih regije (3'-UTR) od ciklina D1 in Ets1 mRNA. Zunajmaternična izraz ali rasklapanje miR-9 povzročilo responsively spremenjeno izražanje ciklin D1, Ets1 in njihovih prodajnih ciljev fosforilirajo retinoblastom in matrix metaloproteinaznih 9 v kultiviranih želodčnih raka celičnih linijah SGC-7901 in AGS. V luciferazno sistemu novinar, miR-9 neposredno usmerjene na 3'-UTR za ciklin D1 in Ets1, in ti učinki so bile odpravljene z mutacijo MIR-9 vezavna mesta. Prekomerno izražanje miR-9 zatreti proliferacije, invazijo in metastaze SGC-7901 in AGS celice in vitro
in in vivo
. Obnova miR-9-posredovano navzdol ureditev ciklin D1 in Ets1 prehodna transfekciji rešil rakavih celic zmanjšanje jedrskega orožja, migracije in invazije. Poleg tega, anti-miR-9 inhibitor spodbuja proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih rakavih celic, medtem ko podreti na ciklin D1 ali Ets1 delno phenocopied učinke pokoj-9 nad ekspresijo. Ti podatki kažejo, da miR-9 zavira izražanje ciklina D1 in Ets1 preko vezavnih mest v svojem 3'-UTR, tako inhibicijo proliferacije, invazijo in metastaze raka želodca

Navedba. Zheng L, Qi T Yang D Qi M Li D Xiang X, et al. (2013) microRNA-9 Zavira za neširjenje orožja, invazijo in metastaze želodca raka celic skozi ciljanje ciklin D1 in Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719

Urednik: Alejandro H. Corvalan, Katoliška univerza Catolica de Chile, Čile

Prejeto: 14. september 2012; Sprejeto: 29. december 2012; Objavljeno: 31. januar 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. S podporo National Natural Science Foundation of China (št 30600278, št 30772359, št 81071997, št 81072073, št 81272779), Program za New Century odlične talente na univerzi (NCET-06-0641), Znanstvenoraziskovalni Foundation za vrnjeno čezmorske kitajske Štipendisti (2008-889), in temeljnih raziskovalnih sredstev za osrednje univerze (2012QN224). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je četrti najpogostejši rak na svetu [1]. Kljub izboljšanju kirurške in multimodalnega zdravljenja, prognoza napredovalega raka želodca še vedno slaba zaradi ponovitve, invaziji in metastaze, s hitrostjo 5-letno preživetje pod 30% [1]. Boljše poznavanje mehanizmov osnovnih napredovanje tumorja je potrebna za odkrivanje nove paradigme za diagnosticiranje in zdravljenje raka želodca [2]. MicroRNAs (miRNAs), ki je nedavno ugotovili kategorijo majhnih in zelo ohranjenih nekodirano RNA, lahko sodelujejo v post-transkripcijske uredbe genske ekspresije z delno dopolnjujejo vezavo s neprevedenih regijami 3 '(3' UTRs) s ciljnim mRNA, kar je povzročilo translacijskih represija ali mRNA razgradnja [3]. Emerging dokazi kažejo, da so miRNAs sodelujejo v bioloških procesih, povezanih z apoptozo, proliferacijo, diferenciacijo, invaziji in metastaz, medtem ko je deregulacija, ki je ključnega pomena za nastanek in napredovanje raka [3]. Trenutno je nujno raziskati vlogo miRNAs in njihovih ciljnih genov v napredovanja tumorja, ki ga poskusnih modelih.

V človeškega raka želodca, so poročali, da je odklonsko prekomerno izražen ali navzdol urejeno v nekaj miRNAs napredovanje raka želodca, vključno z miR-21 [4], mIR-15b [5], miR-16 [5], in miR-101 [6]. Te miRNAs igrajo onkogeni ali tumorsko omejevalno vlogo v regulaciji celične rasti, migracije in invazije, ki zatira svoje ciljne gene. Na primer, onkogeni miR-21 je odklonsko prekomerno izražen v raka želodca in povečuje širjenju in invazivnosti želodčnih rakavih celic z usmerjanjem-povratka indukcijo cistein bogate protein z Kazal motivi [4]. Medtem, miR-15b in miR-16 so se znižali za regulirane pri raku želodca, ter prispevajo k odpornosti proti več želodčnih rakavih celic z modulacijo apoptoze preko ciljanje B-celic levkemije /limfoma 2 [5]. miR-101 je zelo regulirana v želodčni rak tkiva in celičnih linij, medtem ko zunajmaternične izraz miR-101 močno zavira proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih rakavih celic z usmerjanjem ojačevalec zeste homolog 2, citokrom c oksidaza podenote II, in mieloidnih celična levkemija sekvenca 1 [6]. Zato je bil poudarek na nadaljnje raziskovanje izražanje in funkcijo miRNA v tumorsko biologijo raka želodca.

MicroRNA-9 (miR-9), ki je najprej opredeljen kot eden izmed ključnih regulatorjev za razvoj , fiziologija in patologija živčnega sistema v številnih organizmov, vključno s Drosophila
, cebric in sesalcev [7] - [9]. Niz kasnejše študije so pokazale, da je spremenjen miR-9 izraz povezana z razvojem in napredovanjem raka [10] - [14]. Prejšnje študije kažejo, da je miR-9 občutno navzdol urejeno pri raku želodca, zaradi česar njene morebitne vloge v napredovanja tumorja [15] - [18]. Prav tako je navedeno, da se lahko miR-9 uravnavajo proliferacijo želodčnih rakavih celic z osredotočanjem na repna tipa homeobox 2 (CDX2) [19] in NF-kappa B (NF-κB) [16]. Vendar natančna funkcija in temeljne mehanizme miR-9 v napredovanje raka želodca še vedno upravičujejo nadaljnje preiskave. V tej študiji smo dokazati, prvič, da miR-9 neposredno namenjen ciklina D1 in proti-ETS virus erythroblastosis E26 onkogensko homolog 1 (Ets1), in zavira proliferacijo, invazijo in metastaze želodčnih rakavih celic pri vitro
in in vivo
.

Rezultati

miR-9 se je znižal regulirane in obratno povezana z izražanjem ciklin D1 in Ets1 v želodcu tkivih z rakom in celične linije

Da bi raziskali so bili zbrani iz 86 osnovnih primerov izraz miR-9 na raka želodca, želodčnih rakavih tkiv in sosednjih non-neoplastične sluznice. Realnem času kvantitativno reverzno transkripcijo PCR (RT-PCR) je pokazala, da je bila miR-9 down-urejeno v želodčnih tumorskih tkivih, kot da je v sosednjem non-neoplastične sluznice ( P
= 0.001, sl. 1A). Izraz miR-9 je bila bistveno nižja v primerov raka želodca z globljim želodčne stene invazije ( P
< 0,001), bezgavko metastaze ( P
< 0,001), oddaljenih metastaz ( P
= 0,022), in napredne faza TNM ( P
= 0,01) (tabela S1). V nasprotju s tem so bile ugotovljene večje ciklin D1 in ravni prepisovali Ets1 v želodčnih tkivih raka ( P
< 0,0001 in P
. ≪. 0,0001, oziroma, slika 1B in slika 1C). Prišlo je inverzna korelacija med miR-9 izražanja in ciklin ravni prepis D1 v želodčnih tkivih raka ( P
. ≪ 0,001, slika 1D). Poleg tega je bila inverzna korelacija med miR-9 izražanja in ravni prepis Ets1 omeniti tudi v teh rakavih tkivih ( P
. ≪ 0,001, slika 1E). Spodnja miR-9 izražanja in višje ravni prepisa ciklin D1 in Ets1 v vrsticah želodčnih rakavih celic od tistih v običajnih želodčnih epitelijskih GES-1 celic so opazili [20] (sl. 1F). Imunohistokemijsko smo izvedli za opazovanje izražanje ciklina D1 in Ets1 teh rakom osebkov (sl. S1). Jedrska ciklin D1 so opazili pri 26/86 (30,2%) primerih pa so ugotovili jedrskih in citoplazmo obarvanje Ets1 pri 58/86 (67,4%) primerih (tabela S1). Radioinkorporacijo za ciklin D1 in Ets1 je bila bistveno višja primerov raka želodca z globljim želodčne stene invazije ( P
< 0,001 in P
= 0,001), na bezgavkah metastaze ( P
< 0,001 in P
< 0,001), oddaljenih metastaz ( P
< 0,001 in P
< 0,001), in napredne faza TNM ( P
< 0,001 in P
= 0,004) (tabela S1). Spodnja miR-9 izraz so opazili pri želodčnih tkivih z rakom višjo imunskim barvanjem ciklina D1 ( P
< 0,0001, slika 1G.) Ali Ets1 ( P
. ≪ 0,0001, slika 1 H ). Ti rezultati so pokazali, da je bila miR-9 navzdol regulirano in obratno povezana z izražanjem ciklin D1 in Ets1 v želodcu tkiv rakom in celičnih linij.

miR-9 navzdol regulirano izraz ciklin D1 in Ets1 po pošti -transcriptional represija

da bi raziskali hipotezo, da lahko miR-9 vpliva na izražanje ciklin D1 in Ets1 raka želodca, je računsko napoved izvaja podatkovnih baz miRNA. Morebitni obvezujoči mesta Mir-9 z visoko dopolnjevanja so zabeležili pri osnovah 2974-2995 od ciklina D1 3'-UTR in 2648-2670 je zaradi tega Ets1 3'-UTR (sl. 2A). Da bi raziskali neposredne učinke miR-9 na izražanje ciklin D1 in Ets1 v želodčnih rakavih celic, smo izvedli Mirne preko ekspresijo poskuse. Stabilna transfekcija miR-9 predhodnik v SGC-7901 in AGS celic za posledico povečanje vrednosti miR-9 (sl. S2). Western blot, RT-PCR v realnem času kvantitativne RT-PCR je pokazala, da prekomerno ekspresijo miR-9 je povzročilo zmanjšano beljakovin in transkripcijske ravni ciklin D1 in Ets1 v rakavih celicah želodca od tistih, transfektirana z negativno kontrolno vektor (mock) ( sl. 2B, sl. 2C in fig. 2D). Poleg tega je raven fosforiliranega retinoblastom (PRB, efektor na nižji stopnji od ciklin D1) [21] in MMP 9 (MMP-9, gen dolvodno od Ets1) [22] v pokoj-9 so bili manjši kot izražajo rakavih celic (sl. 2B, sl. 2C, in sl. 2D). Da bi še dodatno preučiti vlogo omejevalno Mir-9 pri izražanju ciklin D1 in Ets1, smo izvedli miR-9 rasklapanje poskuse, ki jih transfekcijo zaviralci negativna kontrola (anti-NC) anti-pokoj-9 ali v GES-1, SGC -7901 in AGS celice. Transfekcija anti-miR-9 inhibitor očitno zmanjšala endogenega miR-9 izražanja (sl. S3A) in molekul ravni proteinskih ciklina D1, PRB, Ets1 in MMP-9, ki niso transficirane z anti-NC (sl. 2E in fig. S4A). Realnem času kvantitativne RT-PCR analize so pokazale povečane nivoje transkriptov za ciklin D1, Ets1 in MMP-9 v kultiviranih celic, transfektiranih z anti-miR-9 inhibitor, v primerjavi s tistimi, transfektirana z anti-NC (sl. 2F in Sl. S4B). Na splošno so ti rezultati pokazali, da MIR-9 znatno inhibira ekspresijo ciklin D1 in Ets1 s post-transkripcijski represije.

miR-9 neposredno usmerjene ciklin D1 in Ets1 v želodčnih rakavih celic

ugotoviti, ali bi miR-9 zatreti izražanje ciklina D1 in Ets1 z usmerjanjem svojih veznih mest v 3 'UTR, so bile vstavljene PCR produkti, ki vsebujejo nedotaknjenega ciljna mesta ali mutacijo miR-9 sekvenc priznanje semen (sl. 3A) v luciferazni reporter vektor. Plazmidi transficiramo v rakavih celicah želodca stabilno transfekciji z negativno kontrolno vektor (navidezno) ali miR-9 predhodnik. Renilla
luciferazne aktivnosti normirane tistim firefly so bistveno zmanjša v SGC-7901 in AGS celic stabilno transfekciji z miR-9 predhodnika (sl. 3B), in ti učinki so bile odpravljene z mutacijo domnevni MIR-9 vezavnih mest znotraj 3'-UTR od ciklina D1 in Ets1 (sl. 3B). Poleg tega rasklapanje miR-9 z anti-miR 9-zaviralca povečala luciferazni aktivnosti GES-1 SGC-7901 in AGS celice (sl. 3C in sl. S4C), medtem ko je mutacija miR-9 prepoznavnim mestom odpravijo te učinke (sl. 3C in sl. S4C). Ti rezultati so pokazali, da miR-9 neposredno in posebej v interakciji s ciljnimi mest v 3'-UTR za ciklin D1 in Ets1.

miR-9 zatrl vitro
širjenje raka želodca celice s pomočjo ciljnih ciklin D1

od zgoraj dokazi pokazali, da miR-9 zaviral D1 izraz na ciklin in združuje dejstva, da ciklin D1 igra ključno vlogo pri napredovanju v celičnega cikla in širjenja rakavih celic [21], nadalje smo preučevali učinke pokoj-9 prekomerno ekspresijo in ciljno genske obnovo na kultiviranih želodca rakavih celic. Western blot in v realnem času kvantitativne RT-PCR je pokazala, da transfekcija ciklin D1, vendar ne Ets1 rešili MIR-9-inducirano navzdol uravnavanje ciklin D1 (sl. 4A in sl. 4B). V kolonij tvorjenje testu, miR-9 prekomerno ekspresijo oslabljen rast SGC-7901 in AGS celic, če jih primerjamo s tistimi, transfektirana z negativno kontrolo vektorja (navidezno) (sl. 4C). Citometrija je pokazala, da miR-9 prekomerno ekspresijo inducirane prijetje celični cikel v G _{0 /G 1 faza SGC-7901 in AGS celic (sl. 4D). Poleg tega transfekcija ciklin D1, ne pa tudi za Ets1, v SGC-7901 in AGS celicami obnovili inhibicije orožja in celičnega ciklusa aretaciji pogojeno prekomerno izražanje pokoj-9 (sl. 4 ° C in Sl. 4D). Po drugi strani pa smo preučili učinke miR-9 rasklapanje na GES-1, SGC-7901 in AGS celic. Uvedba anti-pokoj-9 zaviralca v teh celic za posledico izboljšanih sposobnosti pri širjenju (sl. S3B) in napredovanju celičnega ciklusa (sl. S3C). Ti rezultati so pokazali, da MIR-9 izredno zatreti in vitro
orožja in napredovanje celičnega ciklusa želodčnih rakavih celic s ciljanjem ciklin D1.}

miR-9 oslabljen in vitro
migracije in invazije želodčnih rakavih celic s ciljanjem Ets1

od prejšnje študije kažejo pomembne vloge Ets1 v invaziji in metastaze rakavih celic [23], [24], smo nadalje preučevali učinke miR- 9 prekomerno ekspresijo in ciljno gena obnovo na migracije in invazije raka želodca SGC-7901 in AGS celic. Western blot in v realnem času kvantitativne RT-PCR pokazala, da transfekcijo Ets1, vendar ne ciklin D1 rešili MIR-9-inducirano navzdol regulacijo Ets1 (sl. 5A in sl. 5B). V transwell migracij testu, želodčne rakave celice stabilno transfekciji s miR-9 predhodnik predstavila migracije zmogljivosti oslabljeno od tistih transfekciji s negativna kontrola vektorja (navidezno) (sl. 5C). V poskus vdora v Matrigel, miR-9 prekomerno ekspresijo oslabljen invazivnosti SGC-7901 in AGS celic (sl. 5d). Poleg tega transfekcija Ets1, ne pa ciklin D1, v SGC-7901 in celične linije AGS obnovljena MIR-9-meditaed zaviranje na migracije in invazije (sl. 5c in slika. 5D). Poleg tega smo preučevali učinke miR-9 rasklapanje na GES-1, SGC-7901 in AGS celic. Transfekciji anti-miR-9 inhibitor za posledico povečano migracijo in invazije teh celic (sl. S3D in slika. S3E). Ti rezultati so pokazali, da MIR-9 izredno oslabljen in vitro
migracije in invazije želodčnih rakavih celic skozi ciljanje Ets1.

miR-9 oslabila rast in metastaze želodčnih rakavih celic in vivo

Naslednja raziskovali učinkovitost miR-9 proti rast tumorja in metastaz in vivo
. Stabilna transfekcija miR-9 predhodnik v SGC-7901 ali AGS celic za posledico zmanjšano rast in težo podkožnih ksenograftov tumorjev gole miši, v primerjavi s tistimi, stabilno transficirane z negativno kontrolo vektorja (navidezno) (sl. 6A in sl. 6B ). Poleg tega je izražanje ciklina D1, Ets1 in nadaljnji MMP-9 zniža za stabilno transfekcijo miR-9 predhodnik (Sl. 6C). srednja gostota posoda CD31 pozitivni smo reducirali v tumorjih, narejenih z injekcijo rakave celice stabilno transficirane z miR-9 prekurzor (sl. 6D). V eksperimentalnih študij metastaze, SGC-7901 ali AGS celice stabilno transfekciji s miR-9 predhodnikov sedežem statistično manj pljučnih metastatskih kolonij kot modelno skupino (slika. 6E). Ti rezultati kažejo, da miR-9 inhibira rast in metastaze želodčnih rakavih celic vivo
.

rasklapanje od ciklina D1 in Ets1 phenocopied miR-9 prekomerno ekspresijo-zavrtje na proliferacijo , migracije in invazije želodčnih rakavih celic in vitro

Ker nad Rezultati so pokazali negativno regulacijo ciklin D1 in Ets1 izražanja miR-9, smo predpostavili, da je rasklapanje za ciklin D1 in Ets1 morda izvajajo podobne učinke na kultiviranih želodčnih rakavih celic. Majhne moteče RNA (siRNAs), ki so namenjeni za kodiranje regijo ciklin D1 in Ets1, SI-CCND1 in SI-Ets1, so bili zasnovani in transfektirali v SGC-7901 in AGS celic. Transfekcija Si-CCND1 in SI-Ets1 povzročila zmanjšano izražanje ciklina D1, PRB, Ets1 in MMP-9 v želodčnih rakavih celicah, v tem zaporedju, v primerjavi s tistimi transfektiramo s žoga siRNA (SI-SCB) (sl. 7A, sl . 7D in sl. S5). Rasklapanje za ciklin D1 zavre proliferacijo in inducira aretaciji celičnega cikla v G _{0 /G 1 faze v SGC-7901 in AGS celic (sl. 7B in sl. 7c). Poleg tega je rasklapanje od Ets1 v SGC-7901 in AGS celice povzročile zmanjšanje zmogljivosti migracije in invazije (sl. 7E in Sl. 7F). Ti rezultati kažejo, da rasklapanje za ciklin D1 in Ets1 phenocopied (imela podobne fenotipi k) miR-9 prekomerno ekspresijo pri zaviranju proliferacije, migracije in invazijo želodčnih rakavih celic vitro
.}

Pogovor

To je bilo tudi ugotovljeno, da je miR-9 izraz profil raka zanaša na razdeljevanje tkiv. V osnovnih možganskih tumorjev, miR-9 povišano in deluje kot bistveni faktor v živčne rakotvornost [10]. miR-9 je tudi prekomerno izražen v raka materničnega vratu [11], kar kaže na njeno tumor promotor vlogo pri razvoju in napredovanje tumorjev. Vendar miR-9 se down-urejeno v več oblikah raka, vključno z rakom trebušne slinavke [12], rak jajčnikov [13] in kolorektalnega raka [14], in je povezana z malignim napredovanje raka dojke [25] in kolorektalnega raka ( 14). Luo et al.
Opozoriti navzdol ureditev miR-9 na 24 želodca vzorcih raka [15], ki je bil nato potrjen v 9. [16], 72 [17] in 13 [18] rak želodca primeri. Vendar Inoue et al.
Poročali uravnavanjem miR-9 v 5 želodčnih bolnikih z rakom, ki jih miRNA nizi osnovi PCR v realnem času [26], in to drugačne ugotovitve v miR-9 izraz profila je lahko posledica heterogenosti omejenih osebkov. V tej raziskavi smo dokazati, da je miR-9 občutno navzdol urejeno v 86 osnovnih želodčnih osebkov rakom kot v sosednjih ne-neoplastične tkiva, kar je v skladu s predhodnimi ugotovitvami [15] - [18]. Pomembno je, da smo tudi potrdili, da je miR-9 izraz obratno povezana s kliničnimi fazah, invazije, in metastaze raka želodca. Pri ljudeh, je zrel miR-9 kodirana s tremi neodvisnimi genov, MIR-9-1, MIR-9-2 in MIR-9-3, lociranje na kromosomih 1, 5 in 15, oziroma [27]. Prejšnje študije kažejo, da je navzdol regulirano miR-9 izražanje v raka želodca zaradi odklonskega hypermethylation v promotorski regiji miR-9 kodirnih genov [17]. Podobno poročajo tudi zmotna hypermethylation miR-9 družini genov v nekaterih primarnih tumorjev z bezgavkah metastaze, kot je rak debelega črevesa, pljučnim rakom, rakom dojke in melanomov [14], [28]. Pomembno je, da trenutna študija poroča inverzno povezavo med ravnmi miR-9 in izražanje ciklin D1 in Ets1 v želodcu tkivih raka, kar pomeni, da se ciklin D1 in Ets1 lahko negativno ureja miR-9.

Funkcija in ciljne geni mir-9 so tumor specifični in odvisni od mobilnega kontekstu. miR-9 je sposoben zatreti E-kadherina izražanja z rakom dojke [29], kar jedrsko translokacijo beta-catenin in vezavo pri transkripciji faktorjev, T-celičnega faktorja /limfoidnega ojačevalec faktorja 1 ter naknadno navzgor regulirano transkripcijo geni, ki omogočajo celično proliferacijo in angiogenezo [29]. Prisilna miR-9 izraz v celičnih linijah raka dojke za posledico tudi večje spremembe izražanjem več genov v zvezi-p53 apoptotske poti [30]. Preko neposrednega ciljanja NF-κB, zunajmaternične izražanja miR-9 zavira in vitro
in in vivo
rast jajčnikov rakavih celic [31] ter rast in metastaz melanoma [32] . V neuroblatoma, prekomerno izražanje miR-9 zavira invazijo, metastaz in angiogenezo tumorskih celic s ciljanjem matriko metalo-14 [33]. Wan et al.
Poročali, da prekomerno ekspresijo miR-9 zaviral in vitro
in in vivo
rast adenokarcinomom želodca celične linije MGC803 skozi zatiranje NF-κB na ravni post-transkripcijski [16]. Vendar pa je v nedavni študiji, Rotkrua et al.
Je pokazala, da bi se miR-9 vključeni v želodcu kancerogenosti z navzdol regulacijo CDX2 in rasklapanje miR-9 zmanjšal in vitro
širjenje raka želodca MKN-45 celic [19], medtem ko je treba njihove ugotovitve še dodatno okrepiti s pokoj-9 več-izražanja, ciljno genov reševanje, in in vivo
študij. Poleg tega je trenutno sporno ali CDX2 igra onkogenega ali zaviralnih vlogo v želodcu karcinogenezo [34], [35]. Poleg tega so možne vloge miR-9 pri invaziji in metastaz raka želodca niso bile doslej pojasnjen. Tako, funkcijske in neposredne tarče miR-9 v želodčni rak, upravičujejo nadaljnje preiskave.

V tej študiji smo dokazali, da prekomerno ekspresijo miR-9 oslabila proliferacijo, migracijo in invazijo želodčnih rakavih celic, ki je bil podoben tistemu ciklin D1 ali Ets1 rasklapanje, kar kaže na morebitno uporabo miR-9 kot tarčo za terapij raka želodca. Poleg tega so naši podatki potrjujejo, da miR-9 neposredno usmerjene ciklin D1 in Ets1 v želodčnih rakavih celic skozi 3'-UTR luciferaza reporterskega testa. Ker nedavni dokazi kažejo, da lahko nekatere miRNAs alternativno uravnavajo izražanje genov, ki v stiku z nosilci [36] - [38], morebitne vloge miR-9 na regulacijo transkripcije ciklin D1 in Ets1 skozi interakcijo z nosilci še vedno nejasna in jamči naš nadaljnji preiskava. Ciklin D1 je proto-onkogena, ki spada v družino G _{1 ciklini, in ima pomembno vlogo pri celični cikel G 1 do S prehodom z vezavo svoje partnerje ciklinsko odvisno kinazo 4 in 6 fosforilacije ter onesposobijo RB protein [21]. Prekomerno izražanje ciklina D1 je zgodnji dogodek v karcinogenosti v človeških debelega črevesa, požiralnika in žolčnika raka [39], in je prognostični kazalec povezan s slabim preživetje v požiralniku, dojke in raka sečnega [39]. Ciklin D1 prekomerno izražanje v človeških rakavih obolenj je pojasnjen na več načinov, vključno z genomskih sprememb, post-transkripcijske regulacije, in stabilizacijo post-translacijskih proteinov [39]. Novi dokazi kažejo, da miR-16-1 zatira ciklin D1 izraz na post-transkripcijski ravni z vezavo svoje 3'-UTR v plaščnem limfomom [40]. V sedanji raziskavi, naše ugotovitve so pokazale, da miR-9-zavrtje na celičnega cikla napredovanja in celično proliferacijo je bila rešena z obnavljanjem ciklin D1 izražanja v želodčnih rakavih celic, kar kaže, da je identifikacija ciklin D1 kot ciljni gen miR-9, lahko pojasni, vsaj delno, zakaj prekomerno ekspresijo miR-9 zatreti širjenja želodčnih rakavih celic.}

Ets1, član družine ETS transkripcijskih faktorjev, ki se veže na specifične sekvence DNA, ki vsebujejo GGAA /T core motiv [22], ter sodeluje v tumorske invazije in metastaz preko transkripcijske regulacije več genov, ki so odgovorni za zunajcelične matrike preoblikovanja, migracije in invazije, kot MMP in urokinaznega aktivatorja plazminogena [22]. Do danes je vedno več kliničnih študij pokazala pomembne vloge Ets1 za razvoj in napredovanje tumorjev različnih solidnih tumorjev [23], [24]. Prejšnje študije kažejo, da je Ets1 izraz, povezan z clinicopathological značilnosti raka želodca, vključno infiltracije tumorja in bezgavk ali distalnem metastaz, kar kaže na njegovo ključno vlogo pri invaziji in metastaz raka želodca [41]. Vendar pa mehanizmi, na katerih temelji Ets1 preveč izražanja v rakom želodca, še vedno v veliki meri neznan. Nedavne študije kažejo, post-transkripcijski uredbi o Ets1 s pokoj-125b v celice raka dojke [42], in pokoj-200B v endotelijskih celic [43]. V tej študiji smo dokazali, da kot neposredni cilj miR-9, Ets1 je up-urejena v raka želodca in prispevala k migraciji in invazijo rakavih celic. Rasklapanje od Ets1 delno phenocopied učinke miR-9 prekomerno ekspresijo v želodcu raka celičnih linijah, medtem ko obnova Ets1 izražanja rešil rakave celice iz miR-9-posredovano zaviranje migracije in invazije, ki razkrivajo nov post-transkripcijski mehanizem regulacije od Ets1 ga miR-9 in njenih kliničnih potencialov pri bolnikih z rakom želodca.

Če povzamemo, smo dokazali, prvič, da miR-9 zatira izražanje ciklin D1 in Ets1 skozi neposredno usmeriti v svoje 3 ' -UTR, s čimer inhibicijo proliferacije, invazijo in metastaze želodčnih rakavih celic. Ta študija podaljšuje naše znanje o ureditvi ciklin D1 in Ets1 na post-transkripcijski ravni miRNA, in predlaga, da se lahko miR-9 potencialnih vrednot, kot nove terapevtske tarče za raka želodca.

Materiali in metode

bolnikovih vzorcev tkiva

Odobritev za izvedbo te študije je bila pridobljena iz Review Board institucionalne od Tongji Medical College (številka odobritve: 2010-S003). Parafin, vgrajeni in sveže vzorce 86 primarnih primerov raka želodca so bili pridobljeni na oddelku za kirurgijo, Bolnišnica unije Tongji medicinske fakultete. Njihova patološka diagnoza je bila dokazana z vsaj dvema patologi. Demografski in clinicopathological podatkov vseh bolnikov so povzeti v preglednici S1. Mejijo želodčne sluznice, ki ni vseboval makroskopske tumor je bila pridobljena tudi, in ne-neoplastične področja so naknadno preverili mikroskopskem histologijo. Sveže tumorske osebki in v bližini ne-neoplastične sluznica smo zbrali in shranili pri -80 ° C do uporabe.

Imunohistokemija

Imunohistokemijsko je bila izvedena kot je opisano prej [44], s protiteles, specifičnih za ciklin D1, Ets1, MMP-9 in CD31 (Abcam Inc, Cambridge, MA, 1: 200 razredčitve). Negativne kontrole vključeni vzporednih odsekov zdravljene s opustitvijo primarnega protitelesa, poleg sosednjem odseku istem bloku, v kateri je primarni protitelo nadomesti z kunčje poliklonalno IgG (Abcam Inc.) kot kontroli izotipna. Reaktivnost stopnja je bila ocenjena z najmanj dvema patologi brez poznavanja clinicopathological značilnosti tumorjev. Stopnja pozitivnosti je bila prvotno razvrščena glede na odstotek pozitivnih rakavih celic so naslednje: (-) < 5% celicah pozitiven, (1+) 6-25% celicah pozitiven, (2+) 26-50% celic pozitivno in (3+) > 50% celic pozitivna. Diapozitivi z zmerno pozitivno (2+) ali močna pozitivna (3+) reaktivnosti je bil klasificiran kot "visoke izraz", medtem ko diapozitive z negativnim (-) ali šibko pozitivni (1+) reaktivnost so razvrščene kot z "nizko izraz" .

Western blot

Cellular protein smo ekstrahirali z 1 x mobilni liznega pufra (Promega, Madison, WI). Beljakovine (50 mikrogramov) iz vsakega vzorca je bil izpostavljen 4-20% pre-cast poliakrilamidni gel (Bio-Rad, Hercules, CA), elektroforeza in prenesli na nitrocelulozne membrane (Bio-Rad). Za ciklin D1, Ets1, MMP-9, PRB in β-aktin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) odkrivanje, sta bila primarna razredčitve protiteles 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 in 1: 1000, oziroma, čemur sledi 1:3000 razredčitvijo kozje anti-kunčje hrenovo peroksidazo-označenega protitelesa (Bio-Rad). Okrepljeno kemiluminescenca substrat kit (Amersham, Piscataway, NJ), je bila uporabljena za odkrivanje chemiluminscent signalov z avtoradiografija filma (Amersham).

RT-PCR v realnem času kvantitativne RT-PCR

Skupaj RNA smo izolirali s RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Za povratne prepisu reakcije so bile opravljene z Transcriptor prve Strand cDNA zbirnem Kit (Roche, Indianapolis, IN). V PCR za ciklin D1, Ets1, MMP-9 in ß-aktina je oblikoval Premier Primer 5.0 programske opreme (tabela S2). RT-PCR smo izvedli kot je opisano predhodno [44]. Realnem času kvantitativne RT-PCR z SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA), je bila izvedena z ABI Prism 7700 Sequence detektor (Applied Biosystems). Fluorescentne signali so bili zbrani v podaljšani fazi, so bili izračunani vrednosti Ct vzorcev, in ravni prepisa ciklin D1, Ets1 in MMP-9 so bili normalizirani tistim beta-aktina za 2 ^{-ΔΔCt metodo.}

Količinska miR-9 izražanja

ravni zrelega miR-9 v primarni tkiva in celične linije, ki se izračuna z uporabo izboklino-Loop ™ miRNAs qPCR Primer Set (RiboBio Co Ltd, Guangzhou, Kitajska). Potem ko je bila cDNA sintetiziramo z miRNA specifično steblo-zanka sesalno smo kvantitativno PCR izvedemo s posebnimi primerji (tabela S2). Ravni miR-9 so bili normalizirani tistim U6 snRNA.

miRNA ciljna napoved

Mirna cilji so bili napovedali uporabo algoritmov Miranda, miRDB, RNA22 in Targetscan [45]. Identificirati gene s štirimi različnimi algoritmi pogosto napovedane, so bili rezultati napovedanih ciljev seka uporabo miRWalk [46].

celične kulture in transfekciji

linije človekovih želodčni rak celic (SGC-7901 in MKN-74) in SV40-preoblikovala, normalno in brez tumorogen želodca epitelijskih GES-1 celice [20] so bili pridobljeni iz Type Culture Collection kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska). Človeškega želodčnega raka celična linija AGS (CRL-1739) smo kupili oblika American Type Culture Collection (Rockville, MD). Celice smo gojili v mediju RPMI1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (Life Technologies, Inc.), penicilin (100 U /ml) in streptomicin (100 ug /ml). Celice smo vzdrževali pri 37 ° C v navlaženi atmosferi 5% CO _2.

• Plos ONE: Zveza med Zmanjšanje Plasma adiponektina nivojev in tveganja za bakterijske okužbe po želodca raka kirurgijo
• Plos ONE: Izražanje AFP in stat3 je vpleten v arzenov trioksid, inducirane apoptoze in zaviranje proliferacije pri AFP-produkcijo Rak želodca Cells