PLoS ONE: microRNA-9 Undertrykker spredning, invasion og metastase af Gastric Cancer Cells gennem Målretning cyclin D1 og Ets1

Abstrakt

De seneste tal viser, at ændrede microRNA-9 (miR-9) udtryk er impliceret i udviklingen af ​​mavekræft. Men de nøjagtige roller og underliggende mekanismer i miR-9 i spredning, invasion og metastase af mavekræft stadig ukendt. I denne undersøgelse blev MIR-9 sig at være nedreguleret og omvendt korreleret med ekspressionen af ​​cyclin D1 og v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog 1 (Ets1) i gastrisk cancer væv og cellelinier. Bioinformatik analyse afslørede de formodede MIR-9 bindingssteder i de 3'-utranslaterede regioner (3'-UTR) af cyclin D1 og Ets1 mRNA. Ektopisk udtryk eller knockdown af miR-9 resulterede i responsivt ændret udtryk for cyklin D1, Ets1 og deres downstream mål phosphoryleret retinoblastom og matrixmetalloproteinase 9 i dyrkede gastrisk cancer cellelinjer SGC-7901 og AGS. I det luciferase reporter systemet, miR-9 direkte målrettet 3'-UTR af cyklin D1 og Ets1, og disse effekter blev afskaffet ved at mutere MIR-9 bindingssteder. Over-ekspressionen af ​​miR-9 undertrykt spredning, invasion, og metastase af SGC-7901 og AGS celler in vitro
og in vivo
. Genoprettelse af MIR-9-medieret nedregulering af cyclin D1 og Ets1 ved transient transfektion, reddede cancercellerne fra fald i proliferation, migration og invasion. Endvidere anti-MIR-9 inhibitor fremmet proliferation, migration og invasion af gastriske cancerceller, mens vælte af cyclin D1 eller Ets1 delvist phenocopied virkningerne af MIR-9 overekspression. Disse data indikerer, at MIR-9 undertrykker ekspressionen af ​​cyclin D1 og Ets1 via bindingssteder i deres 3'-UTR, således inhibere proliferation, invasion og metastase af mavekræft

Henvisning:. Zheng L, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) microRNA-9 Undertrykker spredning, invasion og metastase af Gastric Cancer Cells gennem Målretning cyclin D1 og Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719

Redaktør: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chile

Modtaget: 14. september 2012; Accepteret: December 29, 2012; Udgivet: 31 januar 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.600.278, No. 30.772.359, No. 81.071.997, No. 81.072.073, No. 81.272.779), Program for New Century Excellent Talenter i University (NCET-06-0641), Videnskabelig Forskning Institut til returneret Overseas Chinese Lærde (2008-889), og grundlæggende forskningsmidler for de centralasiatiske universiteter (2012QN224). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform i verden [1]. På trods af den forbedrede kirurgiske og multimodal terapi, prognosen for fremskreden mavekræft stadig dårlig på grund af gentagelse, invasion og metastase, med en 5-års overlevelse under 30% [1]. Et bedre kendskab til mekanismerne bag tumor progression er berettiget til at opdage nye paradigmer for diagnosticering og behandling af gastrisk kræft [2]. MikroRNA'er (miRNA), en nylig identificeret kategori af små og højt konserverede ikke-kodende RNA'er, kan deltage i den post-transkriptionel regulering af genekspression gennem delvis komplementær binding med 3 'utranslaterede regioner (3'-UTR'er) af mål-mRNA, hvilket resulterer i translationel undertrykkelse eller mRNA nedbrydning [3]. Ny dokumentation viser, at miRNA er involveret i de biologiske processer relateret til apoptose, proliferation, differentiering, invasion og metastase, mens deregulering af som er afgørende for kræft initiering og progression [3]. Det er i øjeblikket presserende at undersøge rollerne for miRNA og deres målgener i tumorprogression ved forsøgsmodeller.

I human gastrisk cancer, en række miRNA er blevet rapporteret at være aberrant overudtrykt eller nedreguleret under progression af gastrisk cancer, herunder mIR-21 [4], mIR-15b [5], mIR-16 [5], og mIR-101 [6]. Disse miRNA spille onkogene eller tumor-undertrykkende roller i reguleringen af ​​cellevækst, migration og invasion ved at undertrykke deres målgener. For eksempel onkogen MIR-21 er aberrant overudtrykt i gastrisk cancer, og forbedrer proliferation og invasivitet af gastriske cancerceller ved målretning af reversion-inducerende cystein-rige protein med Kazal-motiver [4]. I mellemtiden MIR-15b og MIR-16 er nedreguleret i gastrisk cancer, og bidrage til multiresistens af gastriske cancerceller ved modulering af apoptose via målretning B-celle leukæmi /lymfom 2 [5]. MIR-101 er nedreguleret i gastrisk cancer væv og cellelinier, mens ektopisk ekspression af MIR-101 signifikant inhiberer proliferation, migration og invasion af gastriske cancerceller ved målretning forstærker af Zeste homolog 2, cytochrom c-oxidase subunit II, og myeloid celle-leukæmi sekvens 1 [6]. Derfor har det været fokus til yderligere at udforske udtryk og funktion af miRNA i tumor biologi mavekræft.

MicroRNA-9 (miR-9) er først identificeret som en af ​​de afgørende regulatorer til udvikling , fysiologi og patologi nervesystem i flere organismer, herunder Drosophila
, zebrafisk, og pattedyr [7] - [9]. En række efterfølgende undersøgelser har vist, at ændret MIR-9-ekspression er associeret med udviklingen og progressionen af ​​cancere [10] - [14]. Tidligere undersøgelser viser, at MIR-9 er betydeligt nedreguleret i gastrisk cancer, hvilket indebærer dets potentielle roller i tumorudvikling [15] - [18]. Det er også angivet, at MIR-9 kan modulere proliferationen af ​​gastriske cancerceller via målretning den kaudale typen homeobox 2 (CDX2) [19] og NF-kappa B (NF-KB) [16]. Men den nøjagtige funktion og underliggende mekanismer af miR-9 i udviklingen af ​​mavekræft stadig berettige til yderligere undersøgelser. I denne undersøgelse, viser vi, for første gang, at miR-9 direkte henvender cyklin D1 og v-ets erythroblastosis virus E26 onkogen homolog 1 (Ets1), og undertrykker proliferation, invasion og metastase af gastriske kræftceller i vitro
in vivo
.

Resultater

miR-9 var nedreguleret og omvendt korreleret med ekspressionen af ​​cyklin D1 og Ets1 i mavekræft væv og cellelinjer

for at undersøge miR-9 udtryk i gastrisk kræft, gastrisk kræft væv og tilstødende ikke-neoplastisk slimhinde blev indsamlet fra 86 primære tilfælde. Real-time kvantitativ revers transkription-PCR (RT-PCR) afslørede, at MIR-9 blev nedreguleret i gastrisk cancer væv end i tilstødende ikke-neoplastisk mucosa ( P
= 0,001, Fig. 1A). MIR-9 udtryk var signifikant lavere i gastrisk kræfttilfælde med dybere gastrisk væg invasion ( P
< 0,001), lymfeknude metastaser ( P
< 0,001), fjernmetastaser ( P
= 0,022), og avancerede TNM stadie ( P
= 0,01) (tabel S1). I modsætning hertil blev højere cyklin D1 og Ets1 transkriptniveauer påvist i mavekræft væv ( P
< 0,0001 og P
. ≪. 0,0001 henholdsvis figur 1B og figur 1C). Der var en omvendt korrelation mellem miR-9-ekspression og cyclin D1 transkriptniveauer i mavekræft væv ( P
. ≪ 0,001, figur 1D). Desuden blev en omvendt korrelation mellem miR-9-ekspression og Ets1 transkriptniveauer også bemærket i disse kræft væv ( P
<. 0,001, figur 1E). Lower MIR-9-ekspression og højere transkriptniveauer af cyclin D1 og Ets1 blev observeret i gastriske cancercellelinier end i normale gastriske epitel GES-1-celler [20] (fig. 1F). Immunhistokemisk farvning blev udført for at observere ekspression af cyclin D1 og Ets1 i disse cancerpatienter prøver (fig. S1). Nuklear cyklin D1 blev bemærket i 26/86 (30,2%) tilfælde, mens der blev observeret nukleare og cytoplasma farvning af Ets1 i 58/86 (67,4%) tilfælde (tabel S1). Immunoreaktiviteten af ​​cyklin D1 og Ets1 var signifikant højere i gastrisk kræfttilfælde med dybere gastrisk væg invasion ( P
< 0,001 og P
= 0,001), lymfeknude metastaser ( P
< 0,001 og P
< 0,001), fjernmetastaser ( P
< 0,001 og P
< 0,001), og avancerede TNM stadie ( P
< 0,001 og P
= 0,004) (tabel S1). Lavere miR-9-ekspression blev observeret i mavekræft væv med højere immunfarvning af cyclin D1 ( P
< 0,0001, figur 1G.) Eller Ets1 ( P
. ≪ 0,0001, Fig 1H ). Disse resultater indikerede, at MIR-9 blev nedreguleret og omvendt korreleret med ekspression af cyclin D1 og Ets1 i gastrisk cancer væv og cellelinier.

MIR-9 nedregulerede ekspressionen af ​​cyclin D1 og Ets1 gennem posten -transcriptional undertrykkelse

for at undersøge den hypotese, at miR-9 kan påvirke ekspressionen af ​​cyklin D1 og Ets1 i gastrisk kræft, var beregningsmæssige forudsigelse udført af miRNA-databaser. Potentielle bindingssteder af MIR-9 med høj komplementaritet blev bemærket ved baser 2974-2995 af cyclin D1 3'-UTR og 2648-2670 af Ets1 3'-UTR (fig. 2A). For at undersøge de direkte virkninger af miR-9 på ekspressionen af ​​cyklin D1 og Ets1 i gastriske kræftceller, vi udførte miRNA overekspression eksperimenter. Stabil transfektion af miR-9 forløber i SGC-7901 og AGS celler resulterede i stigning i miR-9 niveauer (fig. S2). Western blot, RT-PCR og real-time kvantitativ RT-PCR viste, at overekspression af MIR-9 resulterede i nedsat protein og transkriptionelle niveauer af cyclin D1 og Ets1 i gastriske cancerceller end dem transficeret med negativ kontrolvektor (mock) ( fig. 2B, fig. 2C og fig. 2D). Desuden niveauerne af phosphoryleret retinoblastoma (pRB, en nedstrøms effektor af cyclin D1) [21] og matrixmetalloproteinase 9 (MMP-9, en nedstrøms gen af ​​Ets1) [22] var nedsat i MIR-9 over-udtrykkende cancerceller (fig. 2B, fig. 2C og fig. 2D). For yderligere at undersøge undertrykkende rolle miR-9 i ekspressionen af ​​cyklin D1 og Ets1, vi udførte miR-9 Knockdown eksperimenter ved transfektion af anti-miR-9 eller inhibitorer negativ kontrol (anti-NC) i GES-1, SGC -7901 og AGS celler. Transfektion af anti-MIR-9 inhibitor naturligvis faldt det endogene MIR-9-ekspression (fig. S3A), og opreguleret protein niveauer af cyclin D1, pRb, Ets1 og MMP-9 end dem transficeret med anti-NC (fig. 2E og fig. S4A). Real-time kvantitativ RT-PCR-analyserne viste de forbedrede transkriptniveauer af cyclin D1, Ets1 og MMP-9 i dyrkede celler transficeret med anti-MIR-9 inhibitor, når der sammenlignes med dem, transficeret med anti-NC (fig. 2F og fig. s4b). Samlet viste disse resultater, at miR-9 betydeligt hæmmet udtryk for cyklin D1 og Ets1 gennem post-transkriptionel repression.

miR-9 direkte målrettet cyclin D1 og Ets1 i gastriske kræftceller

Til bestemme, om mIR-9 kunne undertrykke ekspressionen af ​​cyclin D1 og Ets1 ved at målrette sine bindingssteder i 3'-UTR blev PCR produkter, der indeholder intakte målsteder eller mutation af mIR-9 frø genkendelsessekvenser (fig. 3A) indsat i luciferase reporter vektor. Plasmiderne blev transficeret i gastriske cancerceller stabilt transficeret med negativ kontrolvektor (mock) eller MIR-9 precursor. Renilla
luciferaseaktiviteter normaliseret til de af ildflue blev væsentligt reduceret i SGC-7901 og AGS celler stabilt transficeret med miR-9 forløber (fig. 3B), og disse effekter blev afskaffet ved at mutere den formodede miR-9 bindingssteder i 3'-UTR af cyclin D1 og Ets1 (fig. 3B). Endvidere knockdown af MIR-9 med anti-MIR-9 inhibitor øgede luciferaseaktiviteterne i GES-1, SGC-7901 og AGS celler (fig. 3C og Fig. S4C), mens mutation af MIR-9 genkendelsessted afskaffet disse virkninger (fig. 3C og fig. S4C). Disse resultater viste, at miR-9 direkte og specifikt interageret med målet sites i 3'-UTR af cyklin D1 og Ets1.

miR-9 undertrykte in vitro
spredning af mavekræft celler gennem målrettet cyclin D1

Da ovenstående beviser viste, at miR-9 hæmmede cyklin D1 udtryk, og kombinere de kendsgerninger, cyklin D1 spiller en kritisk rolle i cellecyklusprogression og spredning af kræftceller [21], vi yderligere undersøgt virkningerne af mIR-9 overekspression og målgen restaurering på dyrkede gastriske kræftceller. Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR viste, at transfektion af cyclin D1, men ikke af Ets1, reddede MIR-9-induceret nedregulering af cyclin D1 (fig. 4A og fig. 4B). I kolonidannelse assayet, MIR-9 overekspression svækket væksten af ​​SGC-7901 og AGS celler, sammenlignet med dem, transficeret med negativ kontrolvektor (mock) (fig. 4C). Flowcytometri viste, at miR-9 overekspression induceret cellecyklusstop på G _{0 /G 1 fase i SGC-7901 og AGS-celler (Fig. 4D). Desuden transfektion af cyclin D1, men ikke af Ets1, i SGC-7901 og AGS celler gendannet spredning hæmning og cellecyklusstandsning induceret af overekspression af MIR-9 (fig. 4C og fig. 4D). På den anden side, vi undersøgt virkningerne af miR-9 knockdown på GES-1, SGC-7901 og AGS celler. Indførelse af anti-miR-9-hæmmer ind i disse celler resulterede i forbedrede evner i proliferation (Fig. S3B) og cellecyklusprogression (fig. S3C). Disse resultater viste, at miR-9 bemærkelsesværdigt undertrykt in vitro
spredning og cellecyklusprogression af gastriske kræftceller gennem målrettet cyclin D1.}

miR-9 svækket in vitro
migration og invasion af gastriske kræftceller ved at målrette Ets1

Da tidligere undersøgelser indikerer vigtige roller Ets1 i invasionen og metastase af cancerceller [23], [24], vi yderligere undersøgte virkningerne af miR- 9 overekspression og målgen restaurering på migration og invasion af mavekræft SGC-7901 og AGS celler. Western blot og real-time kvantitativ RT-PCR viste, at transfektion af Ets1, men ikke af cyclin D1, reddede MIR-9-induceret nedregulering af Ets1 (fig. 5A og fig. 5B). I Transwell migration assay gastriske cancerceller stabilt transficeret med MIR-9 precursor præsenteret en forringet kapacitet migration end dem transficeret med negativ kontrolvektor (mock) (fig. 5C). I matrigel invasion assay, miR-9 overekspression svækket invasiviteten af ​​SGC-7901 og AGS-celler (Fig. 5D). Desuden transfektion af Ets1, men ikke af cyclin D1, ind SGC-7901 og AGS cellelinier genoprettede MIR-9-meditaed inhibering på migration og invasion (fig. 5C og fig. 5D). Desuden har vi undersøgt virkningerne af miR-9 knockdown på GES-1, SGC-7901 og AGS celler. Transfektion af anti-MIR-9-inhibitor resulterede i øget migration og invasion af disse celler (fig. S3D og fig. S3E). Disse resultater viste, at miR-9 bemærkelsesværdigt svækket in vitro
migration og invasion af gastriske kræftceller gennem målretning Ets1.

miR-9 svækket vækst og metastase af gastriske kræftceller in vivo

Vi næste undersøgt effekten af ​​miR-9 mod tumorvækst og metastase in vivo
. Stabil transfektion af MIR-9 precursor i SGC-7901 eller AGS celler resulterede i nedsat vækst og vægt af subkutane xenotransplantattumorer i athymiske nøgne mus, sammenlignet med dem, stabilt transficeret med negativ kontrolvektor (mock) (fig. 6A og Fig. 6B ). Endvidere blev ekspressionen af ​​cyclin D1, Ets1 og nedstrøms MMP-9 reduceres ved stabil transfektion af MIR-9 precursor (Fig. 6C). Den CD31-positive gennemsnitlig kardensitet blev reduceret inden tumorer dannet ved injektion af cancerceller stabilt transficeret med MIR-9 precursor (Fig. 6D). I de eksperimentelle metastase undersøgelser, SGC-7901 eller AGS celler stabilt transficeret med MIR-9 precursor etableret statistisk færre lung metastatiske kolonier end mock gruppe (fig. 6E). Disse resultater antydede, at miR-9 hæmmede væksten og metastasering af gastriske kræftceller in vivo
.

Knockdown af cyklin D1 og Ets1 phenocopied miR-9 overekspression-medieret hæmning af spredning , migration og invasion af gastriske kræftceller in vitro

Da ovenstående resultater viste den negative regulering af cyklin D1 og Ets1 udtryk af miR-9, vi hypotese, at knockdown af cyklin D1 og Ets1 måske udøve lignende virkninger på dyrkede gastriske kræftceller. De små interfererende RNA (siRNA'er) rettet mod kodning region cyklin D1 og Ets1, si-CCND1 og si-Ets1, designet og transficeret ind SGC-7901 og AGS celler. Transfektion af si-CCND1 og si-Ets1 resulterede i nedsat ekspression af cyclin D1, pRB, Ets1 og MMP-9 i gastriske cancerceller, når det blev sammenlignet med dem transfekteret med scramble siRNA (si-SCB) (fig. 7A, Fig . 7D og fig. S5). Knockdown af cyklin D1 undertrykte spredning og induceret cellecyklusstop på G _{0 /G 1 fase i SGC-7901 og AGS celler (Fig. 7B og fig. 7C). Desuden knockdown af Ets1 i SGC-7901 og AGS celler resulterede i nedsat kapaciteter af migration og invasion (fig. 7E og fig. 7F). Disse resultater antydede, at knockdown af cyklin D1 og Ets1 phenocopied (besad de fænotyper svarende til) miR-9 overekspression hæmme proliferation, migration og invasion af gastriske kræftceller in vitro
.}

Discussion

det er blevet veletableret, at miR-9 udtryk profil i kræft afhængig vævsdistribution. I primære hjernetumorer, er miR-9 forhøjet, og fungerer som en væsentlig faktor for neurale carcinogenese [10]. MIR-9 er også overudtrykt i livmoderhalskræft [11], tyder på tumorpromotoren rolle i tumorudvikling og progression. Men MIR-9 nedreguleres i flere humane cancere, herunder pancreascancer [12], ovariecancer [13] og kolorektal cancer [14], og er forbundet med den maligne progression af brystcancer [25] og kolorektal cancer ( 14). Luo et al.
Bemærkede nedregulering af miR-9 i 24 mavekræft prøver [15], som efterfølgende blev bekræftet i 9 [16], 72 [17], og 13 [18] mavekræft tilfælde. Men Inoue et al.
Rapporterede opregulering af miR-9 i 5 mavecancerpatienter ved real-time PCR-baserede miRNA arrays [26], og denne anden vurdering i miR-9 udtryk profil kan skyldes til heterogenitet begrænsede eksemplarer. I denne undersøgelse viser vi, at MIR-9 er betydeligt nedreguleret i 86 primære gastrisk cancer prøver end i tilstødende ikke neoplastiske væv, hvilket er konsistent med tidligere resultater [15] - [18]. Vigtigt er det, vi også bekræfte, at miR-9 udtryk omvendt er forbundet med de kliniske faser, invasion og metastase af mavekræft. Hos mennesker er det modne MIR-9 kodes af tre uafhængige gener, MIR-9-1, MIR-9-2 og MIR-9-3, lokalisering på kromosomerne 1, 5 og 15, henholdsvis [27]. Tidligere undersøgelser viser, at nedreguleret MIR-9 ekspression i gastrisk cancer skyldes afvigende hypermethylering af promotorregionen af ​​MIR-9 kodende gener [17]. Tilsvarende er afvigende hypermethylering af MIR-9 familiemedlemmer gener også rapporteret i nogle primære tumorer med lymfeknudemetastaser, såsom coloncancer, lungecancer, brystcancer og melanom [14], [28]. Vigtigt er det, den nuværende undersøgelse rapporteret den inverse korrelation mellem MIR-9 niveauer og ekspressionen af ​​cyclin D1 og Ets1 i gastrisk cancer væv, hvilket indebærer, at cyclin D1 og Ets1 kan blive negativt reguleret af MIR-9.

Funktionen og målgener af mIR-9 er tumor-specifikke og afhængige af cellulær sammenhæng. MIR-9 er i stand til at undertrykke E-cadherin ekspression ved brystcancer [29], hvilket resulterer i den nukleare translokation af β-catenin og dens binding med transkriptionsfaktorer T-celle faktor /lymfoid enhancer faktor 1, og efterfølgende opreguleret transkription af gener, der letter celleproliferation og angiogenese [29]. Tvungen MIR-9 ekspression i brystcancercellelinier resulterer også i væsentlige ekspressionssystemer ændringer af multiple gener i p53-relaterede apoptosecyklus [30]. Gennem direkte rettet mod NF-KB, ektopisk udtryk for miR-9 hæmmer in vitro
in vivo
væksten af ​​kræft i æggestokkene celler [31] samt vækst og metastaser af melanom [32] . I neuroblatoma, overekspression af MIR-9 inhiberer invasion, metastase, og angiogenese af tumorceller ved at målrette matrixmetalloproteinase 14 [33]. Wan et al.
Rapporterede, at overekspression af miR-9 hæmmede in vitro
in vivo
vækst af gastrisk adenocarcinom cellelinje MGC803 gennem undertrykke NF-KB på post-transkriptionelle niveau [16]. Men i en nylig undersøgelse, Rotkrua et al.
Indikerede, at miR-9 kan være involveret i gastrisk carcinogenese gennem nedregulere CDX2, og knockdown af miR-9 faldt, in vitro
spredning af gastrisk kræft MKN-45 celler [19], mens deres resultater behøver at blive yderligere styrket med miR-9 over-udtryk, målgen redning, og in vivo
undersøgelser. Desuden, i øjeblikket er kontroversiel, om CDX2 spiller en onkogen eller tumor-suppressor rolle i gastrisk carcinogenese [34], [35]. Desuden er de potentielle roller MIR-9 i invasionen og metastase af mavekræft ikke klarlagt indtil videre. , Funktionen og direkte mål for miR-9 i mavekræft garanterer yderligere undersøgelse.

I denne undersøgelse viste vi, at overekspression af miR-9 svækkede proliferation, migration og invasion af gastrisk kræftceller, som var ligner cyklin D1 eller Ets1 knockdown, hvilket tyder på den potentielle anvendelse af miR-9 som mål for de terapeutiske af mavekræft. Derudover vores data bekræftede, at MIR-9 direkte målrettet cyclin D1 og Ets1 i gastriske cancerceller gennem 3'-UTR luciferase reporter assay. Siden seneste beviser for, at visse miRNA alternativt kan modulere genekspression ved at interagere med initiativtagerne [36] - [38], de potentielle roller miR-9 i regulering af transskription af cyklin D1 og Ets1 gennem interaktion med initiativtagere fortsat uklare og garanterer vores videre undersøgelse. Cyclin D1 er et proto-onkogen, der hører til familien af ​​G _{1 cykliner, og spiller en vigtig rolle i cellecyklus G 1 til S overgang ved at binde dets partnere cyclin-afhængig kinase 4 og 6 til at phosphorylere og inaktivere RB protein [21]. Over-ekspressionen af ​​cyklin D1 er en tidlig begivenhed i carcinogenese i humane kolorektale, esophageal og galdeblære kræft [39], og er en prognostisk indikator forbundet med dårlig overlevelse i esophageal, bryst, og urinveje kræft [39]. Cyclin D1 overekspression i humane kræftformer belyses af flere mekanismer, herunder genomiske forandringer, post-transkriptionel regulering og protein stabilisering posttranslationel [39]. De seneste tal viser, at miR-16-1 undertrykker cyklin D1 udtryk ved post-transkriptionel niveau via binding sin 3'-UTR i mantlecellelymfom [40]. I den aktuelle undersøgelse, viste vores resultater, at MIR-9-medieret inhibering på cellecyklusprogression og celleproliferation blev reddet ved restaurering af cyclin D1-ekspression i gastriske cancerceller, hvilket antyder, at identifikationen af ​​cyclin D1 som MIR-9 målgen, kan forklare, i det mindste delvis, hvorfor overekspression af mIR-9 undertrykte proliferationen af ​​gastriske cancerceller.}

Ets1, et medlem af ETS-familien af ​​transkriptionsfaktorer, binder til specifikke DNA-sekvenser indeholdende en GGAA /T core motiv [22], og deltager i tumorinvasion og metastase gennem transkriptionel regulering af adskillige gener, der er ansvarlige for ekstracellulær matrix remodellering, migration og invasion, såsom matrixmetalloproteinase og urokinaseplasminogenaktivator [22]. Til dato har et stigende antal kliniske undersøgelser vist de vigtige roller Ets1 i tumor udvikling og progression af forskellige solide tumorer [23], [24]. Tidligere undersøgelser viser, at Ets1 ekspression er relateret til de klinisk-patologiske træk ved gastrisk cancer, herunder tumor infiltration og lymfeknuder eller distal metastase, hvilket antyder dets kritiske rolle i invasionen og metastase af gastrisk cancer [41]. Men mekanismerne bag Ets1 overekspression i mavekræft stadig stort set ukendt. Nylige undersøgelser afslører post-transkriptionel regulering af Ets1 af miR-125b i brystkræftceller [42], og ved miR-200b i endotelceller [43]. I denne undersøgelse, vi viste, at som et direkte mål for miR-9, Ets1 blev opreguleret i gastrisk kræft og bidrog til migration og invasion af kræftceller. Knockdown af Ets1 delvist phenocopied virkningerne af miR-9 overekspression i gastrisk cancer cellelinjer, mens restaurering af Ets1 udtryk reddet kræftcellerne fra miR-9-medieret hæmning af migration og invasion, afslører en ny reguleringsmekanisme posttransskriptionel af Ets1 af mIR-9 og dens kliniske muligheder i gastrisk cancer.

sammenfattende har vi vist, for første gang, at mIR-9 undertrykker ekspressionen af ​​cyclin D1 og Ets1 gennem direkte målretning deres 3' -UTR, hvilket forhindrer spredning, invasion og metastase af gastriske cancerceller. Denne undersøgelse udvider vores viden om reguleringen af ​​cyklin D1 og Ets1 på post-transkriptionel niveau ved miRNA, og foreslår, at miR-9 kan være potentielle værdier som en ny terapeutisk mål for mavekræft.

Materialer og Metoder

Patient vævsprøver

godkendelse til at foretage denne undersøgelse blev opnået fra Institutional Review Board of Tongji Medical College (godkendelsesnummer: 2010-S003). Paraffin-indlejrede og friske eksemplarer af 86 primære sager mavekræft blev opnået fra Institut for Kirurgi, Union Hospital i Tongji Medical College. Deres patologisk diagnose blev bevist ved mindst to patologer. De demografiske og klinisk-patologiske data fra alle patienter blev opsummeret i tabel S1. Tilstødende maveslimhinden, der indeholdt ingen makroskopisk tumor blev også opnået, og de ikke-neoplastiske områder blev efterfølgende verificeret ved mikroskopisk histologi. Friske tumorprøver og tilstødende ikke-neoplastisk mucosa blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

Immunhistokemi

Immunhistokemisk farvning blev udført som tidligere beskrevet [44], med antistoffer specifikke for cyclin D1, Ets1, MMP-9 og CD31 (Abcam Inc., Cambridge, MA, 1: 200 fortyndinger). De negative kontroller inkluderet parallelle snit behandlet med udeladelse af det primære antistof, ud over en tilstødende sektion af den samme blok, hvor det primære antistof blev erstattet af kanin-polyklonalt IgG (Abcam Inc.) som en isotypekontrol. Reaktiviteten grad blev vurderet ved mindst to patologer uden kendskab til de klinisk-patologiske træk ved tumorer. Graden af ​​positivitet blev oprindeligt klassificeret i henhold til den procentdel af positive kræftceller som følgende: (-) < 5% celler positiv, (1+) 6-25% celler positive, (2 +) 26-50% celler positiv og (3+) > 50% celler positiv. Slides med moderat positive (2+) eller stærk positiv (3+) reaktivitet blev klassificeret som havende en "høj ekspression", mens lysbilleder med negative (-) eller svag positiv (1+) reaktivitet blev klassificeret som havende en "lav udtrykket" .

Western blot-

cellulært protein blev ekstraheret med 1 × cellelyse-buffer (Promega, Madison, WI). Protein (50 ug) fra hver prøve blev underkastet 4-20% pre-cast polyacrylamidgel (Bio-Rad, Hercules, CA) elektroforese og overført til nitrocellulosemembraner (Bio-Rad). For cyclin D1, Ets1, MMP-9, pRB og β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) afsløring, det primære antistof fortyndinger var 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 og 1: 1000, henholdsvis, efterfulgt af 1:3000 fortynding af gede anti-kanin peberrodsperoxidase-mærket antistof (Bio-Rad). Forøget kemiluminescens-substrat (Amersham, Piscataway, NJ) blev anvendt til chemiluminscent detektion af signaler med autoradiografi film (Amersham).

RT-PCR og real-time kvantitativ RT-PCR

I alt RNA blev isoleret med RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Revers transkription-reaktioner blev udført med Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). PCR-primerne for cyclin D1, Ets1, MMP-9 og β-actin blev designet af Premier Primer 5.0 software (tabel S2). RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [44]. Real-time kvantitativ RT-PCR med SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) blev udført under anvendelse af ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). De fluorescerende signaler blev indsamlet under udvidelse fase blev Ct-værdier af prøverne beregnes, og Transcript niveauer af cyklin D1, Ets1 og MMP-9 blev normaliseret til de af β-actin med 2 ^{-ΔΔCt metode.}

Kvantificering af miR-9 udtryk

niveauerne af modent miR-9 i primære væv og cellelinjer blev bestemt ved hjælp af Bulge-Loop ™ miRNA qPCR Primer Set (RiboBio Co. Ltd, Guangzhou, Kina). Efter cDNA blev syntetiseret med en miRNA-specifik hårnåle-primer, blev den kvantitative PCR udført med de specifikke primere (Tabel S2). MIR-9 niveauer blev normaliseret til de af U6 snRNA.

miRNA target forudsigelse

miRNA mål blev forudsagt ved hjælp af algoritmer Miranda, miRDB, RNA22, og Targetscan [45]. For at identificere de gener, der almindeligvis forudsagt af fire forskellige algoritmer, blev resultaterne af forudsagte mål gennemskåret hjælp miRWalk [46].

Cell kultur og transfektion

Humane gastriske cancer cellelinjer (SGC-7901 og MKN-74) og SV40-transformeret, normale og ikke-tumorigene gastriske epitel GES-1 celler [20] blev opnået fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Human gastrisk cancercellelinie AGS (CRL-1739) blev købt formular American Type Culture Collection (Rockville, MD). Celler blev dyrket i RPMI1640-medium (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Life Technologies, Inc.), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml). Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO _2.

• PLoS ONE: associering mellem Reduktion af Plasma adiponectin niveauer og risiko for bakteriel infektion efter gastrisk cancer kirurgi
• PLoS ONE: Expression af AFP og STAT3 er involveret i arsentrioxid-induceret apoptose og hæmning af spredning i AFP-producerende Gastric Cancer Cells