PLOS ONE: microRNA-9 supprime la prolifération, l'invasion et la métastase des cellules de cancer gastrique par ciblage cycline D1 et Ets1

Résumé

Des données récentes montrent que microRNA-9 (miR-9) expression modifiée est impliquée dans la progression du cancer gastrique. Cependant, le rôle exact et les mécanismes sous-jacents de miR-9 dans la prolifération, l'invasion et les métastases du cancer gastrique reste encore inconnue. Dans cette étude, miR-9 a été trouvée être régulée à la baisse et inversement corrélée à l'expression de la cycline D1 et le virus de l'érythroblastose v-ets E26 homologue d'un oncogene 1 (Ets1) dans les tissus du cancer de l'estomac et des lignées cellulaires. l'analyse bioinformatique a révélé les miR-9 sites putatifs de liaison dans les régions non traduites en 3 (3 'UTR) de la cycline D1 et Ets1 ARNm. L'expression ectopique ou knock-down de miR-9 ont donné lieu à l'expression altérée en réponse de la cycline D1, Ets1 et leurs cibles en aval du rétinoblastome phosphorylée et la métalloprotéinase matricielle 9 dans l'estomac lignées de culture de cellules cancéreuses SGC-7901 et AGS. Dans le système de rapporteur de la luciférase, miR-9 directement ciblé l'extrémité 3 'UTR de la cycline D1 et Ets1, et ces effets ont été abolis par mutation des sites de liaison miR-9. Surexpression de miR-9 supprimé la prolifération, l'invasion et la métastase des SGC-7901 et les cellules AGS in vitro
et in vivo
. Restauration de miR-9 médiée par la régulation négative de la cycline D1 et Ets1 par transfection transitoire, a sauvé les cellules cancéreuses de diminution de la prolifération, la migration et l'invasion. En outre, anti-miR-9 inhibiteur a favorisé la prolifération, la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique, tout en rabattant de cycline D1 ou Ets1 partiellement phenocopied les effets de miR-9 sur-expression. Ces données indiquent que miR-9 supprime l'expression de la cycline D1 et Ets1 via les sites de liaison dans leur extrémité 3 'UTR, inhibant ainsi la prolifération, l'invasion et les métastases du cancer gastrique

. Référence: L Zheng, Qi T, Yang D, Qi M, Li D, Xiang X, et al. (2013) microRNA-9 Empêche la prolifération, l'invasion et la métastase des cellules de cancer gastrique par ciblage cycline D1 et Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10.1371 /journal.pone.0055719

Editeur: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Chili

Reçu le 14 Septembre 2012; Accepté le 29 Décembre 2012; Publié le 31 Janvier, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Zheng et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Soutenu par la national Natural science Foundation de Chine (n ° 30600278, n ° 30772359, n ° 81071997, n ° 81072073, n ° 81272779), Programme de New Century excellents talents à l'Université (NCET-06-0641), Fondation de recherche scientifique pour la retourné outre-mer universitaires chinois (2008-889), et les fonds de la recherche fondamentale pour les universités centrales (2012QN224). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus répandu dans le monde [1]. En dépit de l'amélioration dans le traitement chirurgical et multimodal, le pronostic du cancer gastrique avancé reste médiocre en raison de la récurrence, l'invasion et les métastases, avec un taux de survie à 5 ans inférieure à 30% [1]. Une meilleure connaissance des mécanismes sous-jacents de la progression tumorale est justifiée pour découvrir de nouveaux paradigmes pour le diagnostic et le traitement du cancer gastrique [2]. Les microARN (miARN), une catégorie récemment identifié des petites et hautement conservées ARNs non codants, peuvent participer à la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique par la liaison avec les régions non traduites 3 '(3' UTR) de l'ARNm cible, résultant en complémentarité partielle translationnelle répression ou ARNm dégradation [3]. De nouvelles preuves montrent que les miARN sont impliqués dans les processus biologiques liés à l'apoptose, la prolifération, la différenciation, l'invasion et les métastases, alors que la déréglementation de ce qui est essentiel à l'initiation du cancer et de la progression [3]. Il est actuellement urgent d'enquêter sur le rôle des miARN et leurs gènes cibles dans la progression tumorale par des modèles expérimentaux.

Dans le cancer gastrique humain, un certain nombre de miARN ont été signalés comme aberrantly surexprimé ou régulé à la baisse au cours la progression du cancer de l'estomac, notamment miR-21 [4], miR-15b, [5], miR-16 [5], et miR-101 [6]. Ces miARN jouent des rôles oncogènes ou tumeur suppressive dans la régulation de la croissance cellulaire, la migration et l'invasion en refoulant leurs gènes cibles. Par exemple, oncogénique miR-21 est surexprimé de manière aberrante dans le cancer gastrique et augmente la prolifération et l'invasivité de cellules de cancer gastrique en ciblant une protéine riche en cystéine induisant une réversion de motifs Kazal [4]. Pendant ce temps, miR-15b et miR-16 sont régulés à la baisse dans le cancer gastrique, et contribuent à la multirésistance des cellules de cancer gastrique par modulation de l'apoptose via le ciblage des cellules B de la leucémie /lymphome 2 [5]. miR-101 est régulé à la baisse dans l'estomac des tissus cancéreux et les lignées cellulaires, tandis que l'expression ectopique de miR-101 inhibe de manière significative la prolifération, la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques en ciblant exhausteur de homolog zeste 2, le cytochrome c oxydase sous-unité II et myéloïdes séquence de leucémie à 1 [6]. Par conséquent, il a été au centre d'explorer davantage l'expression et la fonction des miARN dans la biologie de la tumeur du cancer gastrique.

microARN-9 (miR-9) est d'abord identifiée comme l'un des régulateurs cruciaux pour le développement , la physiologie et la pathologie du système nerveux dans plusieurs organismes, y compris Drosophila
, zebrafish et mammifères [7] - [9]. Une série d'études ultérieures ont montré que l'altération de l'expression de miR-9 est associée au développement et à la progression des cancers [10] - [14]. Des études antérieures indiquent que miR-9 est significativement régulée à la baisse dans le cancer gastrique, ce qui implique ses rôles potentiels dans la progression tumorale [15] - [18]. Il est également indiqué que miR-9 peut moduler la prolifération de cellules de cancer gastrique via le ciblage du type homéoboîte 2 caudale (CDX2) [19] et NF-kappa B (NF-kB) [16]. Cependant, la fonction exacte et les mécanismes sous-jacents de miR-9 dans la progression du cancer gastrique justifient encore une enquête plus approfondie. Dans cette étude, nous démontrons, pour la première fois, que miR-9 vise directement la cycline D1 et v-ets virus de l'érythroblastose E26 homologue oncogène 1 (Ets1), et supprime la prolifération, l'invasion et la métastase des cellules de cancer gastrique vitro
et in vivo
.

Résultats

miR-9 était régulée à la baisse et inversement corrélée avec l'expression de la cycline D1 et Ets1 dans les tissus de cancer gastrique et lignées cellulaires

Pour étudier l'expression de miR-9 dans le cancer gastrique, les tissus de cancer gastrique et la muqueuse non néoplasique adjacente ont été collectées à partir de 86 cas primaires. En temps réel quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR) a montré que miR-9 a été régulée à la baisse dans les tissus du cancer gastrique que celle dans la muqueuse non néoplasique adjacente ( P
= 0,001, Fig. 1A). L'expression de miR-9 était significativement plus faible dans les cas de cancer gastrique avec plus profonde invasion de la paroi gastrique ( P
< 0,001), métastase ganglionnaire ( P
< 0,001), métastases à distance ( P
= 0,022), et stade avancé TNM ( P
= 0,01) (tableau S1). En revanche, plus cycline D1 et les niveaux de transcription ETS1 ont été détectés dans les tissus de cancer gastrique ( P
< 0,0001 et P
<.. 0,0001, respectivement, la figure 1B et la figure 1C). Il y avait une corrélation inverse entre miR-9 expression et cycline D1 niveaux de transcription dans les tissus de cancer gastrique ( P
. ≪ 0,001, figure 1D). En outre, une corrélation inverse entre miR-9 expression et les niveaux de transcription ETS1 a également été noté dans ces tissus cancéreux ( P
< 0,001., Figure 1E). Inférieur miR-9 expression et les niveaux de transcription élevés de cycline D1 et Ets1 ont été observés dans des lignées cellulaires de cancer gastrique que ceux GES-1 des cellules épithéliales gastriques normaux [20] (Fig. 1F). La coloration immunohistochimique a été réalisée pour observer l'expression de la cycline D1 et Ets1 dans ces spécimens de cancer (Fig. S1). cycline D1 nucléaire a été notée dans 26/86 (30,2%) des cas, tandis que la coloration nucléaire et le cytoplasme des Ets1 a été observée chez 58/86 (67,4%) des cas (tableau S1). L'immunoréactivité de la cycline D1 et Ets1 était significativement plus élevée dans les cas de cancer gastrique avec plus profonde invasion gastrique mur ( P
< 0,001 et P
= 0,001), métastase ganglionnaire ( P
< 0,001 et P
< 0,001), métastases à distance ( P
< 0,001 et P
< 0,001) et stade avancé TNM ( P
< 0,001 et P
= 0,004) (tableau S1). Lower miR-9 expression a été observée dans les tissus de cancer gastrique avec immunomarquage supérieur de la cycline D1 ( P
< 0,0001, la figure 1G.) Ou Ets1 ( P
<. 0,0001, figure 1H ). Ces résultats indiquent que miR-9 a été régulée à la baisse et inversement corrélée avec l'expression de la cycline D1 et Ets1 dans les tissus de cancer gastrique et des lignées cellulaires.

miR-9 régulé à la baisse l'expression de la cycline D1 et Ets1 par la poste répression -transcriptional

Pour étudier l'hypothèse que miR-9 peut influencer l'expression de la cycline D1 et Ets1 dans le cancer gastrique, la prédiction de calcul a été effectué par des bases de données miARN. Les sites de liaison potentiels de miR-9 avec une forte complémentarité ont été notées dans les bases 2974-2995 de la cycline D1 3'-UTR et 2648-2670 de l'Ets1 de-UTR (Fig. 2A). Pour étudier les effets directs de miR-9 sur l'expression de la cycline D1 et Ets1 dans les cellules de cancer gastrique, nous avons effectué les miARN sur-expression des expériences. transfection stable de miR-9 précurseur en SGC-7901 et les cellules AGS a donné lieu à augmentation de miR-9 niveaux (Fig. S2). Western blot, RT-PCR en temps réel et RT-PCR quantitative a démontré que la surexpression de miR-9 a entraîné une diminution des protéines et des niveaux de transcription de la cycline D1 et Ets1 dans les cellules cancéreuses gastriques que celles transfectées avec le vecteur de contrôle négatif (maquette) ( Fig. 2B, fig. 2C, et la Fig. 2D). En outre, les niveaux de rétinoblastome phosphorylée (pRB, d'un effecteur en aval de la cycline D1) [21] et une métalloprotéinase de matrice 9 (MMP-9, un gène en aval de Ets1) [22] Les cellules ont diminué dans miR-9 sur-exprimant le cancer (Fig. 2B Fig. 2C, et la Fig. 2D). Pour examiner davantage le rôle de suppresseur de miR-9 dans l'expression de la cycline D1 et Ets1, nous avons effectué les miR-9 expériences de knockdown par transfection de contrôle négatif (anti-NC) inhibiteurs anti-miR-9 ou en GES-1, SGC -7901 et AGS cellules. La transfection de-miR-9 anti- inhibiteur évidemment une diminution endogène miR-9 expression (Fig. S3A) et une régulation positive des niveaux de protéine de cycline D1, pRB, ETS1 et MMP-9 que celles transfectées avec des anticorps anti-NC (Fig. 2E et Fig. S4A). En temps réel RT-PCR quantitative analyses ont montré des niveaux de transcription accrus de la cycline D1, Ets1 et MMP-9 dans des cellules cultivées transfectées avec miR-9 anti- inhibiteur, par rapport à celles transfectées avec des anticorps anti-NC (Fig. 2F et la Fig. S4B). Dans l'ensemble, ces résultats ont démontré que miR-9 considérablement inhibé l'expression de la cycline D1 et Ets1 par la répression post-transcriptionnelle.

miR-9 cycline directement ciblé D1 et Ets1 dans les cellules cancéreuses gastriques

Pour déterminer si miR-9 peut réprimer l'expression de la cycline D1 et Ets1 en ciblant ses sites de liaison à l'extrémité 3 'UTR, les produits de PCR contenant des sites cibles intactes ou des mutations de miR-9 séquences de reconnaissance de semences (Fig. 3A) ont été insérés dans le vecteur rapporteur de la luciférase. Les plasmides ont été transfectés dans des cellules de cancer gastrique transfectées de manière stable avec le vecteur témoin négatif (maquette), ou miR-9 précurseur. Le Les activités de luciférase de Renilla normalisées à celles de luciole ont été significativement réduits dans les cellules SGC-7901 et AGS transfectées de façon stable avec miR-9 précurseur (Fig. 3B), et ces effets ont été abolis par mutation de l'putative miR-9 sites dans l'extrémité 3 'UTR de la cycline D1 et Ets1 (Fig. 3B) de liaison. En outre, knockdown de miR-9 avec anti-miR-9 inhibiteur accru les activités luciférase dans GES-1, SGC-7901 et les cellules AGS (Fig. 3C et Fig. S4C), tandis que la mutation de miR-9 site de reconnaissance abolies ces effets (Fig. 3C et Fig. S4C). Ces résultats indiquent que miR-9 directement et spécifiquement interagi avec les sites cibles dans l'extrémité 3 'UTR de la cycline D1 et Ets1.

miR-9 supprimé la in vitro la prolifération
du cancer gastrique cellules par ciblage de la cycline D1

Comme preuve ci-dessus montre que miR-9 a inhibé la D1 expression de la cycline, et la combinaison des faits que la cycline D1 joue un rôle critique dans la progression du cycle cellulaire et la prolifération des cellules cancéreuses [21], nous avons en outre étudié les effets de miR-9 sur-expression et de la restauration du gène cible sur les cellules cancéreuses gastriques cultivées. Western blot et en temps réel, RT-PCR quantitative a indiqué que la transfection de la cycline D1, mais pas de Ets1, sauvé le miR-9 induit une régulation négative de la cycline D1 (fig. 4A et la Fig. 4B). Dans dosage de formation de colonies, miR-9 sur-expression atténuée de la croissance du SGC-7901 et les cellules AGS, par rapport à celles transfectées avec le vecteur de contrôle négatif (mock) (Fig. 4C). Cytométrie de flux indiqué que miR-9 surexpression induite par l'arrêt du cycle cellulaire en G _{0 /G 1 phase SGC-7901 et les cellules AGS (Fig. 4D). En outre, la transfection de la cycline D1, mais pas de Ets1, dans SGC-7901 et les cellules AGS rétablit l'inhibition de la prolifération et arrêt du cycle cellulaire induit par la surexpression de miR-9 (Fig. 4C et la Fig. 4D). D'autre part, nous avons examiné les effets de miR-9 knockdown sur GES-1, SGC-7901 et les cellules AGS. L'introduction d'anti-inhibiteur de miR-9 dans ces cellules a entraîné la prolifération des capacités améliorées (Fig. S3B) et la progression du cycle cellulaire (Fig. S3C). Ces résultats indiquent que miR-9 remarquablement supprimé in vitro
prolifération et la progression du cycle cellulaire des cellules de cancer gastrique en ciblant la cycline D1.}

miR-9 a atténué la in vitro
la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique en ciblant Ets1

Depuis les études précédentes indiquent les rôles importants de Ets1 dans l'invasion et la métastase des cellules cancéreuses [23], [24], nous avons encore étudié les effets de Mir- 9 sur-expression et de la restauration du gène cible sur la migration et l'invasion du cancer gastrique SGC-7901 et les cellules AGS. Western blot et en temps réel RT-PCR quantitative a indiqué que la transfection de Ets1, mais pas de la cycline D1, a sauvé le miR-9 induite par la régulation des Ets1 (Fig. 5A et Fig. 5B). Dans Transwell test de migration, les cellules cancéreuses gastriques transfectées de façon stable avec miR-9 précurseur présenté une capacité de migration avec facultés affaiblies que celles transfectées avec le vecteur de contrôle négatif (maquette) (Fig. 5C). Dans test d'invasion matrigel, miR-9 sur-expression atténuée l'invasivité des SGC-7901 et les cellules AGS (Fig. 5D). En outre, la transfection de Ets1, mais non de la cycline D1 dans SGC-7901 et des lignées de cellules AGS restauré l'inhibition de miR-9-meditaed sur la migration et l'invasion (Fig. 5C et la Fig. 5D). En outre, nous avons examiné les effets de miR-9 knockdown sur GES-1, SGC-7901 et les cellules AGS. Transfection de-miR-9 contre l'inhibiteur a entraîné la migration accrue et l'invasion de ces cellules (Fig. S3D et Fig. S3E). Ces résultats indiquent que miR-9 remarquablement atténuées in vitro
migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques par ciblage Ets1.

miR-9 a atténué la croissance et la métastase des cellules de cancer gastrique in vivo

Nous avons ensuite étudié l'efficacité de miR-9 contre la croissance tumorale et les métastases in vivo
. transfection stable de miR-9 précurseur dans les cellules SGC-7901 ou AGS a entraîné une diminution de croissance et le poids des tumeurs xénogreffes sous-cutanées chez des souris nues athymiques, en comparaison à celles transfectées de façon stable avec le vecteur de contrôle négatif (mock) (Fig. 6A et Fig. 6B ). En outre, l'expression de la cycline D1, et en aval Ets1 MMP-9 a été réduite par transfection stable de miR-9 précurseur (Fig. 6C). La densité moyenne des vaisseaux CD31-positives a été réduite dans les tumeurs formées par l'injection des cellules cancéreuses transfectées de façon stable avec miR-9 précurseur (fig. 6d). Dans les études de métastases expérimentales, SGC-7901 ou les cellules AGS transfectées de façon stable avec miR-9 précurseurs établis statistiquement moins pulmonaires colonies métastatiques que le groupe fictif (Fig. 6E). Ces résultats suggèrent que miR-9 a inhibé la croissance et les métastases des cellules cancéreuses gastriques in vivo.

Renversement de la cycline D1 et Ets1 phenocopied miR-9 inhibition de la surexpression à médiation sur la prolifération , la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique in vitro

Comme les résultats ci-dessus indiquent la régulation négative de la cycline D1 et de l'expression Ets1 par miR-9, nous avons supposé que knockdown de la cycline D1 et Ets1 pourrait exercent des effets similaires sur les cellules cancéreuses gastriques cultivées. Les petits ARN interférents (siRNA) ciblant la région codant pour la cycline D1 et Ets1, si-si-CCND1 et Ets1, ont été conçus et transfectés dans SGC-7901 et les cellules AGS. Transfection de si-CCND1 et si-Ets1 entraîné une diminution de l'expression de la cycline D1, pRB, Ets1 et MMP-9 dans des cellules de cancer gastrique, respectivement, par rapport à celles transfectées avec bousculade siRNA (si-Scb) (Fig. 7A Fig . 7D et Fig. S5). Knockdown de la cycline D1 a supprimé la prolifération et induit un arrêt du cycle cellulaire en G _{0 /G 1 phase CGS-7901 et les cellules AGS (Fig. 7B et la Fig. 7C). En outre, knockdown de Ets1 dans les cellules SGC-7901 et AGS a donné lieu à une diminution des capacités de migration et l'invasion (Fig. 7E et Fig. 7F). Ces résultats suggèrent que knockdown de la cycline D1 et Ets1 phenocopied (possédait les phénotypes similaires à) miR-9 sur-expression dans l'inhibition de la prolifération, la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique in vitro
.}

Discussion

Il a été bien établi que le profil d'expression de miR-9 dans le cancer repose sur la distribution tissulaire. Dans les tumeurs cérébrales primaires, miR-9 est élevée et fonctionne comme un facteur essentiel dans la carcinogenèse neuronal [10]. miR-9 est également surexprimé dans le cancer du col [11], ce qui suggère son rôle de promoteur de la tumeur dans le développement et la progression tumorale. Cependant, miR-9 est régulée à la baisse dans de nombreux cancers humains, y compris le cancer du pancréas [12], le cancer de l'ovaire [13] et le cancer colorectal [14], et est associée à la progression maligne de cancer du sein [25] et le cancer colorectal ( 14). Luo et al.
Noté la régulation négative de miR-9 dans 24 échantillons de cancer gastrique [15], qui a ensuite été confirmé dans 9 [16], 72 [17], et 13 [18] cancer gastrique les cas. Cependant, Inoue et al.
A rapporté l'surexpression de miR-9 chez 5 patients atteints de cancer gastrique par des réseaux basés sur la PCR en temps réel miRNA [26], et cette conclusion différente dans miR-9 profil d'expression peut être due à l'hétérogénéité des échantillons limités. Dans cette étude, nous démontrons que miR-9 est significativement régulée à la baisse dans 86 spécimens de cancer gastrique primaire que dans les tissus non néoplasiques adjacents, ce qui est cohérent avec les résultats précédents [15] - [18]. Surtout, nous confirmons également que miR-9 expression est inversement associée aux stades cliniques, l'invasion et les métastases du cancer gastrique. Chez l'homme, la maturité miR-9 est codée par trois gènes indépendants, miR-9-1, miR-9-2 et miR-9-3, la localisation au chromosomes 1, 5 et 15, respectivement [27]. Des études précédentes indiquent que le miR-9 expression régulée à la baisse dans le cancer gastrique est due à une hyperméthylation aberrante de la région promotrice de miR-9 gènes codant [17]. De même, une hyperméthylation aberrante de gènes de la famille miR-9 est également rapportée dans certaines tumeurs primaires avec des métastases des ganglions lymphatiques, tels que le cancer du côlon, le cancer du poumon, le cancer du sein et le mélanome [14], [28]. Fait important, l'étude a signalé la corrélation inverse entre miR-9 niveaux et l'expression de la cycline D1 et Ets1 dans les tissus de cancer gastrique, ce qui implique que la cycline D1 et Ets1 peuvent être réglementées négativement par miR-9.

La fonction et les gènes cibles de miR-9 sont une tumeur spécifique et dépendent du contexte cellulaire. miR-9 est capable de supprimer l'expression E-cadhérine dans le cancer du sein [29], ce qui entraîne la translocation nucléaire de β-caténine et sa liaison avec les facteurs de transcription facteur de cellules T /lymphoïde facteur activateur 1, et après la transcription régulée à la hausse des les gènes qui facilitent la prolifération cellulaire et l'angiogenèse [29]. Forcé miR-9 expression dans des lignées cellulaires de cancer du sein se traduit également par des changements d'expression de plusieurs gènes importants dans la voie de l'apoptose liée à p53 [30]. En ciblant directement NF-kB, l'expression ectopique de miR-9 inhibe la in vitro
et in vivo
croissance des cellules ovariennes cancéreuses [31] et la croissance et les métastases du mélanome [32] . Dans neuroblatoma, la surexpression de miR-9 inhibe l'invasion, la métastase et l'angiogenèse des cellules tumorales par le ciblage métalloprotéinase de matrice 14 [33]. Wan et al.
A rapporté que la surexpression de miR-9 a inhibé la in vitro
et la croissance in vivo
adénocarcinome gastrique lignée cellulaire MGC803 par la répression NF-kB au niveau post-transcriptionnel [16]. Cependant, dans une étude récente, Rotkrua et al.
A indiqué que miR-9 pourrait être impliqué dans la carcinogenèse gastrique par CDX2 de régulation à la baisse, et knockdown de miR-9 a diminué le in vitro
prolifération de cancer gastrique MKN-45 cellules [19], tandis que leurs résultats doivent être encore renforcés avec miR-9 sur-expression, le sauvetage d'un gène cible, et in vivo
études. En outre, il est actuellement controversé si CDX2 joue un rôle de suppresseur de tumeur ou oncogènes dans la carcinogenèse gastrique [34], [35]. De plus, les rôles potentiels de miR-9 dans l'invasion et les métastases du cancer gastrique n'a pas été élucidé à ce jour. Ainsi, la fonction et directs cibles de miR-9 dans l'estomac mandat de cancer complément d'enquête.

Dans cette étude, nous avons démontré que la surexpression de miR-9 atténué la prolifération, la migration et l'invasion des cellules de cancer gastrique, qui était similaire à celle de la cycline D1 ou Ets1 effet de choc, ce qui suggère l'application potentielle de miR-9 comme cible pour la thérapeutique du cancer de l'estomac. En outre, nos données ont confirmé que miR-9 directement visé cycline D1 et Ets1 dans des cellules de cancer gastrique à travers 3 'UTR dosage rapporteur luciférase. Puisque la preuve récente montre que certains miARN peuvent également moduler l'expression des gènes en interagissant avec les promoteurs [36] - [38], les rôles potentiels de miR-9 dans la régulation de la transcription de la cycline D1 et Ets1 à travers l'interaction avec les promoteurs restent peu clairs et justifient la poursuite de notre enquête. Cycline D1 est un proto-oncogène qui appartient à la famille de G _{1 cyclines et joue un rôle important dans le cycle cellulaire G 1 S transition en se liant à ses partenaires kinase cycline-dépendante 4 et 6 à phosphoryler et inactivent la protéine RB [21]. La surexpression de la cycline D1 est un événement précoce dans la carcinogenèse en colorectaux, de l'œsophage et de la vésicule biliaire cancers humains [39], et est un indicateur pronostique associé à une mauvaise survie dans l'œsophage, du sein et les cancers urinaires [39]. Cycline D1 surexpression dans les cancers humains est élucidée par des mécanismes multiples, y compris les altérations génomiques, régulation post-transcriptionnelle, et la stabilisation des protéines post-traductionnelle [39]. Des données récentes montrent que miR-16-1 refoule cycline D1 expression au niveau post-transcriptionnel par liaison son extrémité 3 'UTR dans le lymphome à cellules du manteau [40]. Dans l'étude actuelle, nos résultats montrent que l'inhibition sur la progression du cycle cellulaire et la prolifération cellulaire miR-9 médiée a été sauvé par la restauration de la cycline expression D1 dans les cellules de cancer de l'estomac, ce qui suggère que l'identification de la cycline D1 en tant que gène cible miR-9, peut expliquer, au moins en partie, pourquoi la surexpression de miR-9 supprimé la prolifération des cellules de cancer gastrique.}

Ets1, un membre de la famille ETS de facteurs de transcription, se lie à des séquences d'ADN spécifiques contenant un GGAA /core motif T [22], et participe à l'invasion tumorale et les métastases à travers la régulation transcriptionnelle de plusieurs gènes responsables de extracellulaire remodelage de la matrice, la migration et l'invasion, comme la matrice métalloprotéinase et urokinase activateur du plasminogène [22]. À ce jour, un nombre croissant d'études cliniques ont montré le rôle important des Ets1 dans le développement et la progression tumorale de diverses tumeurs solides [23], [24]. Des études précédentes indiquent que l'expression Ets1 est liée aux caractéristiques clinico-pathologiques du cancer de l'estomac, y compris l'infiltration de la tumeur et des ganglions lymphatiques ou des métastases distale, ce qui suggère son rôle critique dans l'invasion et les métastases du cancer gastrique [41]. Cependant, les mécanismes sous-jacents du Ets1 surexpression dans le cancer gastrique reste encore largement inconnu. Des études récentes révèlent la régulation post-transcriptionnelle de Ets1 par miR-125b dans les cellules du cancer du sein [42], ainsi que par miR-200b dans les cellules endothéliales [43]. Dans cette étude, nous avons démontré que comme une cible directe de miR-9, Ets1 a été régulée à la hausse dans le cancer gastrique et contribué à la migration et l'invasion des cellules cancéreuses. Knockdown de Ets1 partiellement phenocopied les effets de miR-9 sur-expression dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, tandis que la restauration de l'expression de Ets1 sauvé les cellules cancéreuses à partir de l'inhibition de miR-9 médiation de la migration et de l'invasion, en révélant un mécanisme de régulation post-transcriptionnelle roman de Ets1 par miR-9 et ses potentialités cliniques dans le cancer gastrique.

en résumé, nous avons démontré, pour la première fois, que miR-9 réprime l'expression de la cycline D1 et Ets1 en ciblant directement leur 3 ' -UTR, inhibant ainsi la prolifération, l'invasion et les métastases des cellules cancéreuses gastriques. Cette étude étend nos connaissances sur la réglementation de la cycline D1 et Ets1 au niveau post-transcriptionnel par miRNA, et suggère que miR-9 peut être des valeurs potentielles comme une nouvelle cible thérapeutique pour le cancer gastrique.

Matériaux et Méthodes

approbation des patients tissulaires échantillons pour mener cette étude ont été obtenues auprès du Conseil institutionnel d'examen du Tongji Medical College (numéro d'agrément: 2010-S003). Paraffine et les échantillons frais de 86 cas de cancer gastrique primaires ont été obtenus auprès du Département de chirurgie, Hôpital Union de Tongji Medical College. Leur diagnostic pathologique a été prouvé par au moins deux pathologistes. Les données démographiques et clinicopathologiques de tous les patients ont été résumés dans le tableau S1. une muqueuse gastrique adjacente qui contenait aucune tumeur macroscopique a également été obtenu, et les zones non néoplasiques ont ensuite été vérifiée par examen histologique au microscope. Les échantillons de tumeur frais et de la muqueuse non néoplasique adjacents ont été recueillis et conservés à -80 ° C jusqu'à utilisation.

immunohistochimie

La coloration immunohistochimique a été réalisée comme décrit précédemment [44], avec des anticorps spécifiques pour cycline D1, Ets1, MMP-9 et CD31 (Abcam Inc, Cambridge, MA, 1: 200 dilutions). Les contrôles négatifs comprenaient des sections parallèles traitées avec une omission de l'anticorps primaire, en plus d'une section adjacente du même bloc dans lequel l'anticorps primaire a été remplacé par IgG polyclonale de lapin (Abcam Ine) en tant que contrôle d'isotype. Le degré de réactivité a été évaluée par au moins deux pathologistes sans connaître les caractéristiques clinico de tumeurs. Le degré de positivité a été initialement classé en fonction du pourcentage de cellules cancéreuses positives comme suit: (-) < 5% de cellules positives, (1+) 6-25% des cellules, (2 +) des cellules positives 26-50% de positif et (3+) > 50% de cellules positives. Diapositives avec positive modérée (2+) ou fortement positif (3+) réactivité ont été classés comme ayant une «haute expression», alors que des diapositives avec négatif (-) ou faiblement positif (1+) réactivité ont été classés comme ayant un "faible expression" .

Western blot

protéine cellulaire a été extraite avec 1 x lyse cellulaire tampon (Promega, Madison, WI). Protéines (50 pg) provenant de chaque échantillon a été soumis à un gel de polyacrylamide prémoulé 20.4% (Bio-Rad, Hercules, CA) électrophorèse et transféré sur des membranes de nitrocellulose (Bio-Rad). Pour la cycline D1, Ets1, MMP-9, pRB et β-actine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) de détection, les dilutions d'anticorps primaires étaient 1:500, 1:500, 1:500, 1:500 et 1: 1000, respectivement, suivie par une dilution 1:3000 de chèvre anti-anticorps de lapin marqué à la peroxydase de raifort (Bio-Rad). kit de substrat de chimioluminescence amélioré (Amersham, Piscataway, NJ) a été utilisé pour la détection de chemiluminscent de signaux avec un film d'autoradiographie (Amersham).

RT-PCR en temps réel et RT-PCR quantitative

Total L'ARN a été isolé avec Mini Kit RNeasy (Qiagen Inc., Valencia, CA). Les réactions de transcription inverse ont été réalisées avec Transcriptor Trousse Strand cDNA Synthesis (Roche, Indianapolis, IN). Les amorces de PCR pour la cycline D1, Ets1, MMP-9 et β-actine ont été conçues par le logiciel Primer Premier 5.0 (Tableau S2). La RT-PCR a été effectuée comme décrit précédemment [44]. En temps réel RT-PCR quantitative avec SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) a été réalisée en utilisant ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). Les signaux de fluorescence ont été recueillies durant la phase d'extension, les valeurs Ct des échantillons ont été calculés et les niveaux de cycline D1, Ets1 et MMP-9 transcrits ont été normalisées à celles de β-actine de 2 ^{-ΔΔCt méthode.}

Quantification de miR-9 expression

Les niveaux de maturité miR-9 dans les tissus et les lignées de cellules primaires ont été déterminées à l'aide Bulge boucle ™ miARN qPCR Primer Set (RiboBio Co. Ltd, Guangzhou, Chine). Après l'ADNc a été synthétisé avec une tige-boucle amorce spécifique miARN, la PCR quantitative a été réalisée avec les amorces spécifiques (voir le tableau S2). Les miR-9 niveaux ont été normalisées à celles des U6 snRNA.

miRNA prédiction cible

miRNA cibles ont été prédits en utilisant les algorithmes MIRANDA, miRDB, RNA22 et Targetscan [45]. Pour identifier les gènes couramment prédites par quatre algorithmes différents, les résultats des objectifs prévus ont été recoupées en utilisant miRWalk [46].

Culture cellulaire et transfection

lignées cellulaires de cancer gastrique humaine (SGC-7901 et MKN-74) et SV40-transformés, épithéliales gastriques normaux et non-tumorigènes GES-1 des cellules [20] ont été obtenus à partir de type Culture Collection de l'Académie chinoise des sciences (Shanghai, Chine). lignée cellulaire de cancer gastrique humain AGS (CRL-1739) a été acheté sous forme American Type Culture Collection (Rockville, MD). Les cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal (Life Technologies, Inc.), de la pénicilline (100 U /ml) et de la streptomycine (100 ug /ml). Les cellules ont été maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _2.

• PLOS ONE: Association entre la réduction des taux d'adiponectine plasmatique et risque d'infection bactérienne après chirurgie du cancer gastrique
• PLOS ONE: Expression de l'AFP et de STAT3 est impliquée dans trioxyde d'arsenic induit l'apoptose et l'inhibition de la prolifération dans les cellules AFP-Producing cancer gastrique