Plos ONE: miR-30b, Down urejeno želodčnega raka, spodbuja apoptozo in zavira rast tumorja, ki ga ciljanje aktivator plazminogena inhibitor-1

Povzetek

Ozadje

Rak želodca je ena izmed najpogostejših malignih bolezni po vsem svetu. Emerging dokazi kažejo, da so microRNAs (miRNAs), povezane z razvojem in napredovanje tumorjev. Naši prejšnje študije so pokazale, da je H. pylori
okužba mogel inducirati spremenila ekspresijo miR-30B v epitelijskih celic želodca. Vendar pa je malo znanega o potencialni vlogi pokoj-30B raka želodca.

Metode

smo analizirali ekspresijo pokoj-30B v želodcu raka celičnih linijah in človeških želodčnega raka tkiva. preučila smo vpliv miR-30b posnema na apoptozo želodčnih rakavih celic in vitro z citometrije pretoka (FCM) in testi kaspaze-3 aktivnosti /7. Nude Model miška ksenogenskega bila uporabljena za določitev, ali je miR-30b, vključenih v tumorigeneze raka želodca. Cilj pokoj-30B je bila ugotovljena z analizo bioinformatika, luciferazni test in Western blot. Na koncu smo izvedli korelacijsko analizo med pokoj-30B in ciljno izražanja raka želodca.

Rezultati

miR-30b je bilo precej navzdol urejeno v želodčnih rakavih celic in človeških želodčnega raka tkiva. Prisilno izraz miR-30B promovira apoptozo želodčnih rakavih celic in vitro, in miR-30b lahko pomembno zaviranje tumorogenosti raka želodca s povečanjem apoptozo delež rakavih celic in vivo. Poleg tega je aktivator plazminogena inhibitor-1 (PAI-1) opredeljeni kot potencialni cilj pokoj-30B in raven miR-30b je bilo obratno povezana z PAI-1 izražanja raka želodca. Poleg tega je bilo utišanje PAI-1 sposobna phenocopy učinek miR-30b prekomerno o ureditvi apoptozo rakavih celic, in čezmernim PAI-1 lahko zavre učinek spodbujanja celične apoptoze z miR-30B, kar kaže, PAI-1 je potencialno vključene v miR-30b-inducirane apoptoze na rakave celice.

Zaključek

miR-30b lahko deluje kot nova zaviralnih genov pri raku želodca z usmerjanjem PAI-1 in regulacijo apoptozo rakave celice. miR-30b lahko služi kot potencialno biomarker in terapevtske tarče proti raku želodca

Navedba. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) miR-30b, Down urejeno želodčnega raka, spodbuja apoptozo in zavira rast tumorja, ki ga ciljanje aktivator plazminogena zaviralcem-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10,1371 /journal.pone.0106049

Urednik: Gerolama CONDORELLIJA, Federico II Univerza v Neaplju, Italija, Italija

Prejeto: 7. maj 2014; Sprejeto: 28. julij 2014; Objavljeno: 29. avgust 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Data Zaloga:. avtorji potrjujejo, da so v celoti na voljo brez omejitev vse podatke, na katerih temeljijo ugotovitve. Vsi pomembni podatki so v papirju in njene dodatne informacije datotek

Financiranje:. To delo je podprl National Natural Science Foundation Kitajske (št 81202310), znanstveni Innovation Research Foundation tretjega vojaške Medical University (No. 2009XQN20). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca povzroči okoli 738.000 smrtnih žrtev po vsem svetu na leto, in je bil priznan kot tretji najpogostejši vzrok smrti zaradi raka pri moških [1]. Zgodnja diagnoza in zdravljenje so pripeljale do odličnih pričakovanja za dolgoročno preživetje in dobro prognozo, medtem ko so obeti za bolnike z napredovalim rakom želodca še vedno slaba. Tako kot druge oblike raka, ki je mislil, da je več dejavnikov za razvoj raka želodca. Helicobacter pylori (H. Pylori)
okužbe je bila priznana kot pomemben sprožilec rakom želodca [2]. Čeprav so bile številne genetske in epigenetske spremembe poročali pri raku želodca, molekularni mehanizem, ki določa razvoj raka želodca ostaja nejasna.

microRNAs (miRNAs) so majhne nekodiranih RNA, ki posttranscriptionally uravnavajo izražanje genov. Mature miRNAs lahko specifično veže na 3 'UTRs ciljnim celično mRNA pa sproži mRNA poslabšanje ali zaviranje prevajanja [3] [4]. miRNAs delujejo kot ključni regulatorji v različnih bioloških procesov, vključno z razvojem, diferenciacija celic, apoptoza, presnovo in prenos signalov [5], [6]. Dokazano je bilo, da se 50% od miRNAs pogosto nahaja z rakom povezana genomskih regij ali v nestabilnih območij [7]. Narašča dokazi kažejo, da neobičajne miRNAs izražanje v korelaciji z različnimi človeških rakih in kaže, da lahko miRNAs delujejo kot onkogenov ali tumor-supresorskih genov [8] - [10]. V zadnjem času precejšnje število dereguliranih miRNAs vključno pokoj-106b-25 grozda, MIR-21, MIR-218, MIR-7, in miR-335 so bile opredeljene kot modulatorji rasti celic, apoptoza, migracije ali vdor v raka želodca razvoj [11] - [15]. Te ugotovitve kažejo, da miRNAs lahko igrajo ključno vlogo pri patogenezi raka želodca.

Naši prejšnje študije so pokazale, da je H. pylori
okužba je lahko inducira spremenjeno ekspresijo miRNAs v epitelijskih celic želodca, vključno z miR-155, MIR-146A in pokoj-30B, lahko miRNAs delujejo kot nove negativne regulatorji, za prilagoditev H. pylori
inducirano vnetje [16], [17]. Poleg tega smo pokazali, da lahko miR-146a igrajo morebitno vlogo pri razvoju raka želodca z moduliranjem proliferacijo in apoptozo želodčnih rakavih celic [18]. Predvsem pa smo tudi ugotovila, miR-30b bi urejal postopek avtofagija med H. pylori
vztrajajo okužbo, s čimer prispeva k vztrajanju H. pylori
okužbe [19]. Vendar vloga pokoj-30B na raka želodca, je še vedno v veliki meri neznan.

plazminogena inhibitor aktivatorja 1 (PAI-1) je glavni inhibitor serinskih proteaz tkivnega tipa (t-PA) in urokinaze tipa ( u-PA), plazminogen aktivator in zato igra pomembno vlogo v sistemu plazminogena-plazmina [20]. Predhodne študije so prikazani PAI-1 je slaba prognostični faktor več skupnih tumorjev, ki je povezana z invazijo raka in metastaz [21]. Nedavno veliko skupin prav tako ugotovili, da lahko PAI-1 spodbuja rast tumorjev z inhibicijo celične apoptoze. Na primer, dodatek stabilnega divjega tipa PAI-1 do prostate rak humani celični liniji PC-3 je promielocitna levkemija humana celična linija HL-60 in tudi ne tumoural celice povzročilo znatno inhibicijo apoptoze [22] . Ko podkožno injicirali v golih miši s PAI-1 prekomerno ekspresijo mišje celice fibrosarkoma, so tumorji hitro ugotovi, medtem PAI-1 pomanjkanjem celice še eno zatreti tumorogenosti [23]. Drugo poročilo je pokazalo, da so genetski in farmakološki inhibicija PAI-1 pri humanih tumorskih celičnih linijah (HT-1080, A549, HCT-116 in MDA-MB-231) povečana spontana apoptozo, in zanimivo, vsadili PAI-1 razgradljiv HT- 1080 celic na PAI-1 knockout miših povzročilo zmanjšano tumorigeneze in podaljšano preživetje v primerjavi s kontrolnimi miši [24]. Te študije zagotavljajo pomembne dokaze, da PAI-1 izvaja zaščitno vlogo proti tumorskih celic apoptoze.

V sedanji raziskavi smo ugotovili, da je miR-30b občutno navzdol urejeno v želodčnih rakavih celic in tumorskih tkivih. Ektopična ekspresija miR-30B lahko pospeševanje apoptoze želodca rakave celice in vitro, in miR-30b lahko pomembno zaviranje tumorogenosti želodčnih raka pri golih modelu miši ksenotransplantat. Poleg tega je PAI-1 opredeljen kot potencialnih tarč Mir-30B in miR-30b lahko povzroči apoptozo in zavirajo rast tumorja, ki ga zatiranje izražanja PAI-1. Naše ugotovitve kažejo, da lahko miR-30b deluje kot nove zaviralnih genov pri raku želodca in lahko potencialni ciljna terapija za raka želodca.

Izjava Etika materiale in metode

Vse poskuse na živalih so bili potrjeni s etični in eksperimentalni odbora živali tretjega vojaške Medical University. Vse kirurgija žival je bila izvedena v skladu z natrijevim pentobarbital anesteziji, in si je prizadevala za zmanjšanje trpljenja. Študija vključuje tkivne vzorce, ki ga je odobrila etični presoji odbora na tretje vojaške Medical University, in pisno privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikov pred sodelovanjem.

vzorci tkiva

V celoti, želodčni rak ličila in sosednjih non-tumor tkiva so bili pridobljeni pri bolnikih s primarnim rakom želodca poteka radikalna želodca v bolnišnici Southwest, tretje vojaške Medical University, Kitajska, in clinicopathologic značilnosti bolnikov z rakom želodca so povzeti v tabeli 1. po kirurški odstranitvi, so bili zamrznjeni tkiva takoj v tekočem dušiku in shranili pri -80 ° C. Študija je odobrila odbora etika pregledu na tretje vojaške Medical University, privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikov pred sodelovanjem.

Celične linije in celična kultura

Vsi celične linije, ki se uporabljajo v tej študiji so bili pridobljeni iz Shanghai Type Culture Collection kitajske akademije znanosti (Shanghai, Kitajska), je človeški želodca linije AGS rakava celica kultivirani v F12 Ham je (Hyclone) medij z 10% fetalni goveji serum (FBS), druge želodčne linije rakava celica MKN45 , HGC-27, 293 celice so BGC-823, SGC-7901 in človeške embrionalne ledvične (HEK) gojimo v DMEM (Hyclone) z 10% FBS, so bili vsi vzdrževati v vlažnem inkubatorju, ki vsebuje 5% CO _{2 na 37 ° C, kot je opisano zgoraj.}

Kvantitativne RT-PCR

Celotna RNA je bila ekstrahirana z TRIzola reagentom (Invitrogen), čemur sledi reverzno transkripcijo z uporabo TaqMan Mirna teste (Ambion), z majhnim U6 jedrska RNA kot notranji normalizirane referenco. QRT-PCR reakcije smo izvedli z naslednjimi parametri: 95 ° C za 2 min, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 15 sekund in 60 ° C za 30 sekund. QRT-PCR analize za mRNA iz PAI-1 smo izvedli z uporabo PrimeScript RT-PCR kompleti (Takara), kot naslednjimi parametri: 95 ° C za 30 sekund, čemur sledi 40 ciklov 95 ° C za 5 sekund, 60 ° C 5 sekund in 72 ° C za 30 sekund. Raven mRNA p-aktin uporabimo kot notranjo kontrolo. Sekvence oligonukleotidnih uporabljajo, so prikazani v tabeli 2.

Northern blot

Mala velika RNA smo izolirali s pomočjo mirVana izolacije RNA kit (Ambion). Trije pari kliničnih vzorcih so bile naključno izbrane izmed 21 bolnikov, za kasnejšo analizo Northern blot. Northern blot smo izvedli po standardnem postopku, kot prej [17] descried. antisense sonde na DNA oligonukleotidne uporabljajo za odkrivanje MIR-30B in U6 snRNA so naslednji: MIR-30b (5'AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') in U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3')

celice transfekcije.

miR-30B posnema, umešana MIR-nadzor, kemično modificirani miR-30b duplex (agomir), kemično spremenjene umešana miR kontrolo, PAI-1 siRNA ali siRNA negativni kontrolni bili kupljeni od GenePharma (Shanghai GenePharma Co. . Ltd., Kitajska). PAI-1 (Serpine1) Human cDNA ORF Clone je bila kupljena od Origene (Origene Technologies, Peking, Kitajska). Transfekcije smo izvedli s pomočjo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) po protokolu proizvajalca.

Cell apoptozo test FCM

SGC-7901 ali HGC-27 celice smo zasejali v 12 vdolbinicami na primeren gostoto in goji do 30% konfluence po 24 urah. Nato smo celice transfektirali z miR-30b posnema ali miR kontrolo in medij smo zamenjali z DMEM brez seruma 48 ur. Za co-transfekciji poskusu s pokoj-30B in PAI-1 izraža vektor, so SGC-7901 celice transfekciji s miR nadzora ali miR-30b posnema, in nato z PAI-1 Human cDNA ORF Clone vektorja (označena kot PAI-1) ali prazno vektor 24 ur kasneje. 24 ur po transfekciji vektorjev, smo gojišče zamenjali z DMEM za nadaljnjih 24 ur brez seruma. Končno smo celice uporabljajo za analizo apoptoze. Za analizo FCM, Kitom aneksin V-FITC Apoptoza Detection I (BD Pharmingen) je bilo uporabljeno, nato analizirajo s citometrije pretoka (BD FACSCantoTM II).

kaspazne-Glo 3/7 Analiza

aktivnost kaspaze-3/7 je bila odkrita s pomočjo kaspaze-Glo 3/7 testom (Promega). Dodamo 100 ml kaspaze-Glo 3/7 reagentom beli panelni 96 vdolbinicami, rahlo premešamo vsebino vodnjakov in nato inkubiramo vdolbinic pri sobni temperaturi 30 minut. Luminiscenč- je bila odkrita s pomočjo GloMax-96 mikroplošča Luminometer (Promega).

tumorogenosti testi pri golih miškah

miši, ki se uporablja v tem poskusu so se ohranili pod posebnimi pogoji, brez patogenov. Izvedljiv miR-30b mimics- in MIR-nadzorni transfektirana SGC-7901 celice (1 x 10 ^{6) smo suspendirali v 100 ul PBS in nato podkožno injicirali v obeh straneh zadnjo boka iste samice BALB /c atimične nude miške na 4 do 6 tednov, kot je bilo prej [25] opisano. rast tumorja in stanja, vključno s splošno zdravje in vedenje miši so bile pregledane vsake tri dni, 4 tedne. Miši tumorskih beared ne kažejo znakov bolečine ali stiske, kot so izguba telesne teže ali vedenjske spremembe, tako da so bile vse miši žrtvovali s CO _{2 zadušitev na dan 28. post-injekcijo. Volumen tumorja (V) smo spremljali z merjenjem dolžine (L) in širina (W) z čeljusti in izračuna po formuli (L x W 2) × 0,5.}}

TUNEL madeži

tumorji so bile pridelane v 26 dneh, in je določeno v 10% raztopini formaldehida, potem vgrajeni v parafin. Oddelki (5 mikrometrov debela), ki je bil deparaffinized in rehidrirano smo obarvali s hematoksilinom in eozinom. Apoptotske tumorske celice smo obarvali s sponkami-deoxynucleotidyltransferase posredovano dUTP nick konec označevanje (TUNEL) metodo in situ z uporabo in situ komplet za zaznavanje celične smrti (POD; Roche Diagnostics Co.). Negativna kontrola je bila podvržena istemu barvanjem za tunel brez TDT. Slike so bili zbrani s pomočjo mikroskopa z × 200 povečavo.

Gradnja plazmidov

Gradnja različnih luciferaze vektorjev poročilo za cilj miR-30b je bila izvedena kot je opisano prej [16] [26] in je konstrukt, ki vsebuje mutant semena regijo nastane kot kontrolo. Sekvence oligonukleotide uporabimo, so prikazani v tabeli 2.

luciferazni test in GFP represija poskusi

HEK-293 celice smo zasejali v ploščo s 96 vdolbinami pri 5.000 celic na vdolbino na dan pred transfekcijo. Celice smo transfektirali z vsakim firefly luciferazno reporterskega vektor, Renilla nadzorni luciferaza vektor, PRL-TK (Promega) in miR-30b posnema ali miR-kontrolo (GenePharma). Luciferazni test smo izvedli s pomočjo sistema reporter Preskusno dvojno luciferazno (Promega).

Za GFP represijo poskuse, so HEK-293 celic nasadijo v 12 vdolbinicami na 1 x 10 ^{5 na dobro uporabljena dan pred transfekciji, nato pa so bili kotransfektiramo z miR-30b posnema ali miR kontrolo z različnimi vektorji GFP novinar na. Celice so bile izpostavljene pretočna citometrična analiza, in so bili analizirani podatki s pomočjo Cellquest Pro programsko opremo.}

Western blot

Obdelane celice speremo z ledeno mrzlo PBS in nato liziramo s celično liznega pufra (Pierce). Po centrifugiranju pri 12.000 obratih na minuto za 15 minut pri 4 ° C, je bila koncentracija proteina merimo s BCA protein analiznega kompleta (Pierce). Celične proteinske lizate smo ločili na 12% SDS denaturirajo poliakrilamidnem gelu in nato prenese na poliviniliden difluorid membrano. Membrane smo blokirali s 5% nemastno mleko v prahu v Tris-pufrom, pH 7,4, ki vsebuje 0,05% Tween 20, in inkubiramo s primarnimi protitelesi za PAI-1 (1:1000, Abcam) in P-aktin (1:1000 santa Cruz) pri 4 ° C preko noči oz. Membrane smo sprali in inkubirali s hrenovo peroksidazo konjugirano sekundarnih protiteles (1:5000 Santa Cruz) po navodilih proizvajalca. Zanimivi protein smo vizualizirali s pomočjo ECL Western blot substrat (Pierce) in Chemidoc XRS Gel dokumentacijski sistem (BIORAD).

Statistična analiza

Rezultati so izraženi kot srednja vrednost ± standardni odklon (SD) iz vsaj treh neodvisnih eksperimentov. Studentov t test je bil uporabljen za analizo razlik med skupinami. Odnos med stopnjo miR-30b in PAI-1expression smo analizirali z uporabo Pearson je korelacija. Statistična analiza je bila opravljena z SPSS programske opreme (različica 17). Statistične razlike so bile razglašene za pomembne pri P
< 0,05 ravni. Statistično pomembne podatke, so označeni z zvezdico ( P
< 0,05 (*), P
. ≪ 0,01 (**)

Rezultati

Zmanjšana miR-30b izraz v človeške želodčne raka celičnih linij in vzorcev GC tkiva

za določitev vloge pokoj-30B v patogenezi raka želodca, smo analizirali ravni miR-30B v različnih želodčnih rakavih celic, vključno HGC-27, AGS, BGC-823 in SGC-7901. Kot je prikazano na sliki 1A, izražanje pokoj-30B je bila precej navzdol urejeno v štirih celičnih linijah v primerjavi z bazenom pet ne-tumorskih želodčnega tkiva ( P
<.. 0.01)

izraz miR-30B je dodatno preučiti 21 seznanjenih GC in sosednjih non-tumorskih želodčnega tkiva preko TaqMan kvantitativni PCR v realnem času (QRT-PCR) Kot je prikazano na sliki 1B, je bilo znižanje miR-30B na voljo v 18 od 21 bolnikov (85,7%) v primerjavi z ustreznimi ne-tumorskih tkivih. Poleg tega scatter diagram je pokazala, da je bil miR-30b občutno navzdol urejeno v vzorcih raka želodca v primerjavi z običajnim želodčne sluznice, s povprečno znižanje 6,28-krat ( P
= 0,002) (slika 1C). Za potrditev podatkov izražanja, pridobljene iz QRT-PCR, 3 vseh 21 parov vzorcev so naključno izbrali za določanje ravni pokoj-30B s pomočjo Severne vijak. tudi Našli smo dosledno zmanjšala izražanje pokoj-30B z rakom želodca v primerjavi z ne-tumorskih želodčnega tkiva (Slika 1D). Ti rezultati kažejo, da je izraz MIR-30b pogosto navzdol ureja raka želodca in morda vključene v razvoj raka želodca.

Čezmerno pokoj-30B poveča apoptozo želodčnih rakavih celic

Eden od zaščitni znak raka je njegova sposobnost, da bi se izognila apoptozo [27], zato smo preučili vpliv pokoj-30B na želodčno rakavih celic apoptoze. SGC-7901 ali HGC-27 celice so transfekciji s miR-30b posnema ali umešana MIR-nadzor, in veljavnost miR-30b zunajmaternične izražanja je potrdil QRT-PCR (slika 2A). Potem je bil učinek pokoj-30B na apoptozo SGC-7901 ali HGC-27 celic ocenil citometrijo tok analize (FCM) in kaspaze-3 aktivnosti /7 testih. Kot je prikazano na sliki 2B in 2C, smo ugotovili delež apoptotskih celic je bilo v celicah SGC-7901 ali HGC-27 transfekciji z miR-30b posnema v primerjavi s celicami za nadzor-transfekcije MIR znatno povečal (16,08% v primerjavi z
8,25% do SGC-7901 celic, in 17,83% v primerjavi
10,87% do HGC-27 celic). Poleg tega je bilo ugotovljeno bistveno povečanje kaspaze-07/03 aktivnosti v SGC-7901 ali HGC-27 celic, transfektiranih s pokoj-30B v primerjavi z miR nadzora transfektanti ( P
< 0,01, slika 2D). Nad rezultati kažejo, da lahko prekomerno miR-30B spodbuja apoptozo raka želodca in vitro.

miR-30b zavira pojav tumorjev in spodbuja apoptozo celic in vivo

Da bi še ugotoviti, ali je miR-30b vključeni v tumorigeneze raka želodca, je bila uporabljena nude miško ksenogenskega modela. Ker smo ugotovili, da miR-30b igrala bolj pomembno vlogo pri spodbujanju SGC-7901 celic apoptoze kot HGC-27 celic in vitro, smo raziskati vlogo pokoj-30B v tumorigeneze raka želodca uporablja SGC-7901 celic. miR-obvladovanju in miR-30b-tranfected SGC-7901 celice so subkutano injicirali v obeh zadnji del boka istih golih miših. Sledila miši za opazovanje rast ksenotransplantata 4 tedne. Ugotovljeno je bilo, da je za vnos pokoj-30B v SGC-7901 celic, ki so privedli do občutnega zmanjšanja velikosti obsega tumorja (slika 3A in 3B), in tumorji, ki izhajajo iz pokoj-30B zdraviti SGC-7901 celice rasle počasneje v primerjavi s kontrolo skupina v celotnem obdobju rasti tumorja (slika 3C, levo plošče). Ko so bile pridelane tumorji, povprečni obseg tumorjev, ki izhajajo iz skupine MIR-30B posnema je bilo le 27,87%, od tega v skupini miR kontrolo (slika 3C, desno panel, P
< 0,01). Tumorji smo zbrali po 26 dneh od obeh straneh zadnjo boka iste miši so apoptoza in situ merjena s tunel. Kot je prikazano na sliki 3D, tumor profili iz miR-30b posnema obdelan ksenografi razstavljena znatno povečanje TUNEL-pozitivnih celic. Ti rezultati jasno predlagal, da je za vnos pokoj-30B lahko zavirajo rast raka želodca s spodbujanjem apoptozo rakavih celic.

PAI-1 je cilj kandidat gen miR-30b

Da bi še dodatno oceniti funkcija miR-30B, je treba določiti, kateri gostijo mRNA se ureja pokoj-30B. V naši prejšnji raziskavi, smo pregledali profil mRNA izraz v petih parov primarnih tumorskih tkivih bolnikov z rakom želodca in se ujema non-tumorske tkiva z uporabo mikromrež. Celoti, smo ugotovili 303 molekul gene (raztegljiv sprememb > 2 P
< 0,05) v želodčnih tkivih raka v primerjavi z ne-tumorskih tkiv (podatki niso prikazani). Glede na navzdol reguliranih izraz pokoj-30B raka želodca, smo se osredotočili na seznamu genov, ki kažejo povečano izražanje in izbrali top 30 povečane genov v raka želodca, nato pa ugotoviti, če so ti geni potencialne tarče pokoj-30B s pomočjo predvidevanja algoritem , TargetScan. Zanimivo je, da smo ugotovili, da PAI-1 gen, ki je bila povečana pri mikromrežnem (3,83 krat, P
= 0,04), bi bilo verjetno ciljni gen miR-30b (slika 4A). Neposredno naslavljanje ali miR-30b veže na 3'-UTR ciljnih mRNA, smo zgradili vektorji luciferazni poročil, ki vsebujejo domnevnega MIR-30B zavezujoč mesta znotraj 3'-UTR. Kot je prikazano na sliki 4B, smo opazili izrazito znižanje luciferazne aktivnosti ( P
< 0,01) po contransfection luciferaze vektorjev poročila in miR-30b posnema. V nasprotju s tem pa smo opazili nobenih sprememb luciferaze v celicah, transfektiranih s mutiranih 3'-UTR konstruktov. Ta rezultat je bila pozneje potrjena z GFP represijo poskusov. Kot je prikazano na sliki 4C in 4D, je GFP fluorescence bistveno zmanjšala v celicah transfekciji s poročilom GFP vektorji vsebujejo veznih mest in miR-30B posnema, ker ni bilo spremembe GFP fluorescence v celicah transfekciji s mutant vektorsko in miR-30b posnema. Poleg tega čezmernim pokoj-30B v letnem pregledu rasti in HGC-27 celic je povzročilo zmanjšanjem števila ravni beljakovin PAI-1 (slika 4E). Skupaj, zgornji podatki kažejo, da je PAI-1 potencialna tarča pokoj-30B in miR-30b morda down-regulacijo tarčnega proteina.

Inverse korelacija med MIR-30B in PAI-1 izražanja v želodcu rak tkiva in celičnih linij raka

Glede na to, da je miR-30b navzdol ureja raka želodca, in so poročali, da je PAI-1 protein v želodčnih tkivih rakom bistveno višja kot pri ne-tumorskih tkivih v [ ,,,0],28], smo izvedli korelacijsko analizo med pokoj-30B in PAI-1 izražanja v želodcu raka celičnih linijah in želodčnega raka tkiva. Kot je prikazano na sliki 5A vrhu je PAI-1 raven proteina najnižja v AGS celici med pet želodčnega celičnih linij. V nasprotju s tem je bila stopnja miR-30b najvišja v letnem pregledu rasti, v primerjavi z drugimi celičnih linij (slika 5A spodaj). Kasneje smo pregledali PAI-1 in miR-30B izraz v 21 sklopov raka želodca in sosednjih non-tumorskih tkivih. Ugotovili smo, da 81% (17/21) želodčnih rakov prikaže višje PAI-1 mRNA v primerjavi z običajnimi tkiva. V nasprotju s tem, miR-30b je pogosto navzdol urejeno v 18 od 21 tumorjev. Uporaba analize korelacije Pearson je, smo opazili precejšnje inverzno povezavo med pokoj-30B in PAI-1 mRNA (slika 5B, R
= -0,6475, P
= 0.0123). Nad rezultati kažejo, da je miR-30b izraz obratno povezana z PAI-1 izražanja na raka želodca, in okrepljeno PAI-1 izraz v raka želodca je lahko posledica zmanjšanega izražanja miR-30b.

PAI-1 je potencialno vključene v miR-30b-inducirane apoptoze

Da bi še dodatno raziskati, ali je PAI-1 vključeni v miR-30b-spodbuja apoptozo, smo najprej testirali, če ima lahko utišanje PAI-1 izražanja podobna apoptoza, spodbujanje učinek kot miR-30b prekomerno. SGC-7901 celice smo transfektirali z PAI-1 siRNA ali negativni kontrolni RNA (NC) za 48 ur, kot je prikazano na sliki 6A, lahko nivoji mRNA iz PAI-1 bistveno zmanjša njen siRNA. Kasneje, PAI-1 siRNA prikaže očitne povečanje apoptoze stopnjo v SGC-7901 celic (Slika 6b, 6c), v primerjavi z miR kontrolo. Predvsem je PAI-1 siRNA lahko phenocopy učinek miR-30b prekomerno o ureditvi apoptoze rakave celice (slika 6B, 6C). En predstavnik Primer dot parcele je prikazano na sliki 6D. Dalje, smo pregledali tudi, ali bi PAI-1 odpravi učinek pospeševanje apoptoze s pokoj-30B. SGC-7901 celice smo transfektirali z miR-kontrolnimi ali miR-30b posnema 24 ur, čemur sledi transfekciji s PAI-1 Humani cDNK ORF Clone vektor (naveden kot PAI-1) ali nov vektor. Kot je prikazano na sliki 6E-G je prekomerno ekspresijo PAI-1 povzročil očitne zatiranju o učinku miR-30b-inducirane apoptoze. Skupaj, naši rezultati kažejo, da je PAI-1 lahko sodeluje pri miR-30b-spodbuja apoptozo.

Pogovor

Čeprav je bilo opaziti deregulacija miRNAs v želodčnih tkiv rakom in celičnih linij, natančen molekularni mehanizem, s katerim miRNAs modulirajo proces tumorigeneze še ni povsem pojasnjen. Do danes so poročali številni miRNAs deluje kot onkogena v razvoj raka želodca [29], [30], vendar miRNAs deluje kot zaviralnih genov treba dodatno raziskati.

Tu pokazala miR-30b je navzdol urejeno v želodčnih rakavih celic in tumorskih tkivih. Naši podatki prav tako kažejo, da bi overxepression miR-30B izboljšanje apoptozo želodčnih rakavih celic in vitro, in vivo, in miR-30b mogla zatreti rasti tumorjev raka želodca in vivo. Nadaljevali smo značilen PAI-1 kot potencialni cilj pokoj-30B in izraz pokoj-30B je bilo obratno povezana z PAI-1 izražanja raka želodca. Poleg tega je PAI-1 lahko sodeluje pri miR-30b-inducirane apoptoze. Nad rezultati kažejo, miR-30b lahko deluje kot nova zaviralnih z ureditvijo apoptozo rakavih celic raka želodca.

miR-30b je eden od MIR-30 družine, ki je povezana z razvojem različnih vrst raka. Vendar pa je vloga pokoj-30B v tumorigeneze je sporen. miR-30b so poročali, da se navzdol urejeno pri raku prostate [31], invazivni tumor na mehurju [32], anaplastični rak ščitnice [33], raka požiralnika [34], in pljučnega raka [35], ker so okrepljeno izražanja miR- 30b je bilo ugotovljeno v meduloblastoma [36] in malignim mezoteliomom [37]. Poleg tega je bila miR-30b opredeljena kot eden od neodvisnih kazalcev za ponovitev brez preživelih iz karcinomom jetrnih celic [38]. Ker je bil miR-30b navzgor regulirano ali zmanjšati na različne vrste raka, lahko potegnemo zaključek, da lahko miR-30b igrajo različne vloge kot onkogen ali zaviralnih genov v različnih vrst raka.

V sedanji raziskavi smo ugotovili, da je bil miR-30b izraz bistveno zmanjšal v želodčnih tkiv raka in celičnih linij, v primerjavi z običajnimi želodčnih tkiva. V skladu z našo ugotovitvijo, je bilo ugotovljeno, miR-30b, ki jih microRNA paleto navzdol izrazil od 184 želodca raka in 169 niso tumor sluznice [39], in Qiao et al ugotovljeno, da je miR-30b navzdol izrazil želodčnega tkiva raka in linije želodčne celice raka, AGS in BGC-823 celic [40]. Zato se lahko izguba miR-30b izražanja povezana s patogenezo in napredovanje raka želodca.

apoptoza je odredil proces celične smrti, ki se pojavlja v fizioloških in bolezenskih stanj. Motnje v tem občutljivem ravnovesju lahko privede do razvoja raka [27]. Sedaj je le malo znanega o učinku miR-30B na apoptoze pri raku. Kontroverzni izraz pokoj-30B kaže kompleksnost funkcije pokoj-30B. V zadnjem času, Li et al [41] je pokazala, da je bila miR-30b bistveno zmanjša odziv na stimulacijo stresnega oksidativnega in miR-30b lahko zavira mitohondrijske cepitve in posledično apoptozo. Ravno nasprotno, se je izkazalo, da miR-30 lahko zavira samo-obnove in inducira apoptozo dojk-tumorskih začetek celic (BT-ICS), ki ga utišati Ubc9 in ITGB3 [42]. Nad dokazi kažejo, da je miR-30 večfunkcijski gen, ki lahko zavirajo ali inducira apoptozo. V sedanjem poročilu smo ugotovili, da ektopična izražanje miR-30B lahko inducira apoptozo želodčnih rakavih celic in vitro, in čezmerno miR-30B lahko pomembno zaviranje rasti tumorjev pri golih miške modelu ksenograftov z indukcijo apoptoze želodčnih rakavih celic in vivo. Nad ugotovitve kažejo, da lahko miR-30b igrajo potencialno vlogo pri razvoju raka želodca s spodbujanjem apoptozo raka.

Če želite raziskati molekularne mehanizme, na katerih temelji delovanje miR-30B, je pomembno opredeliti svojo ciljno gen. V zadnjem času, več nove tarče pokoj-30B so bile potrjene tudi p53 [43], Delta-kot 4 [44], in Snail1 [45]. V naši raziskavi, PAI-1was opredeljena kot ciljna gena pokoj-30B raka želodca. PAI-1 je glavni inhibitor tPA in uPA in PAI-1 lahko blokira aktiviranje plazminogena. Je bilo dobro dokumentirano, da je ekspresija PAI-1 raka želodca višja kot pri kontrolnih tkivih in PAI-1 lahko služi kot nov prognostični faktor raka želodca, napovedovanje krajše preživetje [28], [46], [47 ]. Zanimivo je, da novejši podatki kažejo, da protumorigenic aktivnost PAI-1 lahko preko antiapoptotic funkcijo [22]. Naša raziskava je pokazala, da je bila miR-30b izraz obratno povezana z PAI-1 izražanja v želodčni rak celičnih linijah in tumorskih tkivih, PAI-1 čezmernim lahko izničijo učinek pospeševanje apoptoze s pokoj-30B in zunajmaternične izraz pokoj-30B je bilo podobno učinek spodbujanja-apoptozo v primerjavi z utišanje PAI-1 ekspresije. Predlaga, da se os miR-30b-PAI-1 lahko sodelujejo pri nastanku raka želodca. Vendar pa je pot na nižji stopnji je bilo treba dodatno raziskati.

Razvoj raka želodca je značilno, da več dejavnikov in večstopenjskem postopku, in H. pylori
Dokazano je, da je glavni vzrok za nastanek raka želodca. Nedavna poročila naših raziskav in drugih študij so poudarili regulatorno vlogo miRNAs v H. pylori
okužbo in s tem povezanih bolezni. miRNA je potencialni most iz H. pylori
okužba kroničnega gastritisa in rakom želodca [16] [48] [49]. Glede na pokoj-30B, lahko ima multi-funkcijo v H. pylori
okužba in H. pylori
-associated bolezni. Naše prejšnjem poročilu ugotovila, miR-30b je sposobna regulirati proces avtofagija z usmerjanjem ATG12 in BECN1 v H. pylori
vztrajajo okužbe [19].

• Plos ONE: intraperitonealna IL-17-Pozitivna mastocitov so glavni vir za IL-17, ki lahko napoveduje preživetje želodčnega raka Patients
• Plos ONE: Helicobacter pylori Spodbuja epitelijskih-mezenhimskih Prehod želodčnega raka, ki ga Downregulating Programirana celična smrt Protein 4 (PDCD4)