PLoS ONE: miR-30b, stads Geregeld bij maagkanker, Bevordert apoptose en onderdrukt tumorgroei door zich te richten plasminogeenactivatorremmer-1

De abstracte

Achtergrond

Maagkanker is een van de meest voorkomende kwaadaardige ziekten wereldwijd. Opkomende bewijs heeft aangetoond dat microRNAs (miRNAs) geassocieerd met tumorontwikkeling en progressie. Onze vorige studies hebben aangetoond dat H.
pylori infectie kon de veranderde expressie van miR-30b induceren in maagepitheelcellen. Er is echter weinig bekend over de mogelijke rol van miR-30b bij maagkanker.

Methods

We analyseerden de expressie van miR-30b bij maagkanker cellijnen en menselijke maagkanker weefsels. We onderzochten de effecten van miR-30b bootst de apoptose van maagkanker cellen in vitro door flowcytometrie (FCM) en caspase-3/7-activiteit assays. Naakt muis xenograft model werd gebruikt om te bepalen of miR-30b is betrokken bij tumorigenese van maagkanker. De doelstelling van miR-30b werd geïdentificeerd door bio-informatica-analyse, luciferase assay en Western blot. Tot slot voerden we de correlatie-analyse tussen miR-30b en zijn doel expressie bij maagkanker.

Resultaten

miR-30b was significant down-gereguleerd bij maagkanker cellen en menselijke maagkanker weefsels. Gedwongen expressie van miR-30b bevorderde de apoptose van maagkanker cellen in vitro en miR-30b aanzienlijk kunnen remmen tumorigeniciteit van maagkanker door het verhogen van het aandeel van apoptose van kankercellen in vivo. Bovendien, plasminogeen activator inhibitor-1 (PAI-1) werd geïdentificeerd als potentieel doel van miR-30b en miR-30b niveau was omgekeerd gecorreleerd met PAI-1-expressie bij maagkanker. Bovendien silencing van PAI-1 in staat was het effect van miR-30b overexpressie op apoptose regulering van kankercellen phenocopy en overexpressie van PAI-1 kan het effect dat apoptose onderdrukt door miR-30b, aangeeft PAI-1 is mogelijk betrokken zijn bij miR-30b-geïnduceerde apoptose op kankercellen.

Conclusie

miR-30b kan functioneren als een nieuw tumor suppressor gen bij maagkanker door zich te richten PAI-1 en het reguleren van de apoptose van kankercellen. miR-30b kunnen dienen als potentiële biomarker en therapeutisch doelwit tegen maagkanker

Citation:. Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) miR-30b, stads Geregeld bij maagkanker, Bevordert apoptose en onderdrukt tumorgroei door zich te richten plasminogeenactivatorremmer-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10.1371 /journal.pone.0106049

Editor: Gerolama Condorelli, Federico II Universiteit van Napels, Italië,

Ontvangen: 7 mei 2014; Aanvaard: 28 juli 2014; Gepubliceerd: 29 augustus 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Data Availability:. De auteurs bevestigen dat alle gegevens waarop de bevindingen zijn volledig beschikbaar zonder beperking. Alle relevante gegevens zijn binnen het papier en de Ondersteunende informatie bestanden

Financiering:. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr 81202310), wetenschappelijke innovatie Research Foundation van de Derde Militaire Medische Universiteit (No. 2009XQN20). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker veroorzaakt ongeveer 738.000 sterfgevallen per jaar en is erkend als derde belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen bij mensen [1]. Vroege diagnose en behandeling hebben geleid tot uitstekende verwachtingen voor de lange termijn te overleven en goede prognose, terwijl de vooruitzichten voor patiënten met gevorderde maagkanker slecht blijft. Net als andere vormen van kanker, is de ontwikkeling van maagkanker gedacht multifactorieel. Helicobacter pylori (H. Pylori)
infectie is erkend als een belangrijke oorzaak van maagkanker zijn [2]. Hoewel vele genetische en epigenetische veranderingen zijn gemeld bij maagkanker, het moleculaire mechanisme achter de ontwikkeling van maagkanker blijft onduidelijk.

microRNA's (miRNA's) zijn kleine niet-coderende RNA's die posttranscriptionally genexpressie. Volwassen miRNAs specifiek kan binden aan 3 'UTR's van target cellulaire mRNA beurt triggeren mRNA afbraak of remming van translatie [3], [4]. miRNAs fungeren als sleutelregulatoren van diverse biologische processen zoals ontwikkeling, celdifferentiatie, apoptose, metabolisme en signaaltransductie [5], [6]. Er is aangetoond dat 50% van miRNAs vaak zich op kankergeassocieerde genoomgebieden of kwetsbare gebieden [7]. Groeiend bewijs heeft aangetoond dat miRNAs afwijkende expressie correleert met verschillende menselijke kankers en geeft aan dat miRNAs kan functioneren als oncogenen en tumorsuppressorgenen [8] - [10]. Onlangs heeft een aanzienlijk aantal van ontregelde miRNAs waaronder miR-106b-25 cluster, miR-21, miR-218, miR-7 en miR-335 zijn geïdentificeerd als modulatoren van celgroei, apoptose, migratie en invasie bij maagkanker ontwikkeling [11] - [15]. Deze bevindingen suggereren de miRNAs kan een cruciale rol in de pathogenese van maagkanker spelen.

Onze vorige studies hebben aangetoond dat H. pylori
infectie was in staat om de veranderde expressie van miRNAs in de maag epitheelcellen waaronder miR-155, miR-146a en miR-30b te induceren, kan miRNAs fungeren als nieuwe negatieve regulatoren te fine-tunen H. pylori
geïnduceerde ontsteking [16], [17]. Bovendien toonden we aan dat miR-146a mogelijke rol in de ontwikkeling van maagkanker kan spelen bij het moduleren van de proliferatie en apoptose van maagkanker cellen [18]. Met name vonden we ook miR-30b kan de autofagie proces tijdens de H reguleren. pylori
aanhouden infectie, aldus bij te dragen aan het voortbestaan ​​van de H. pylori
infecties [19]. Maar de rol van miR-30b bij maagkanker is nog grotendeels onbekend.

plasminogeen activator inhibitor 1 (PAI-1) is de voornaamste serine proteaseremmer weefseltype (t-PA) en urokinase-type ( u-PA) en plasminogeenactivator speelt dus een belangrijke rol in het plasminogeen plasmine systeem [20]. Eerdere studies hebben getoond PAI-1 is een slechte prognostische factor verscheidene gemeenschappelijke tumoren en wordt geassocieerd met kanker en metastase [21]. Onlangs vele groepen hebben ook gevonden dat PAI-1 tumorgroei kunnen bevorderen door remming van apoptose. Bijvoorbeeld, toevoeging van een stabiele wildtype PAI-1 naar de humane prostaatkanker cellijn PC-3, de humane promyelocytische leukemie cellijn HL-60 en zelfs niet-tumorale cellen, resulteerde in een significante remming van apoptose [22] . Wanneer subcutaan geïnjecteerd in naakt muizen met PAI-1 overexpressie muis fibrosarcoma cellen werden de tumoren snel vastgesteld, terwijl PAI-1 deficiënte cellen had onderdrukt tumorigeniciteit [23]. Een ander rapport toonde aan dat genetische en farmacologische remming van PAI-1 in humane tumor cellijnen (HT-1080, A549, HCT-116 en MDA-MB-231) verhoogde spontane apoptose en interessant, geïmplanteerd PAI-1 knockdown HT- 1080 cellen PAI-1 knockout muizen resulteerde in verminderde tumorvorming en langere overleving in vergelijking met controle muizen [24]. Deze studies leveren belangrijke aanwijzingen dat PAI-1 oefent een beschermende rol tegen tumorcellen apoptose.

In de huidige studie vonden we dat miR-30b significant neerwaarts gereguleerd bij maagkanker cellen en tumorweefsels. Ectopische expressie van miR-30b kon de apoptose van maagkanker cel te bevorderen in vitro en miR-30b aanzienlijk kunnen remmen tumorigeniciteit van maagkanker in naakt muis xenograft model. Bovendien PAI-1 werd geïdentificeerd als potentiële doelwitten van miR-30b en miR-30b kunnen apoptose induceren en onderdrukken van tumorgroei door het onderdrukken van de expressie van PAI-1. Onze resultaten suggereren dat miR-30b kan functioneren als een nieuw tumor suppressor gen bij maagkanker en kan een potentiële therapie doelwit voor maagkanker zijn.

Materialen en methoden

Ethics Verklaring

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Ethische en Experimentele Comité van de Derde Militaire Medische Universiteit. Alle dier operatie werd uitgevoerd onder natriumpentobarbital verdoving, en alle inspanningen werden gedaan om het lijden te minimaliseren. De studie waarbij weefselmonsters werd goedgekeurd door de Ethische Review Board op de derde Militaire Medische Universiteit, en schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten voor deelname.

weefselmonsters

In totaal maagkanker weefsels en naburige niet-tumorweefsels werden verkregen van patiënten met primaire maagkanker ondergaan ingrijpende gastrectomie bij Southwest Hospital, Derde Militaire Medische Universiteit, China, en de clinicopathologic kenmerken van maagkanker patiënten worden samengevat in tabel 1. Na chirurgische verwijdering werden de weefsels bevroren onmiddellijk in vloeibare stikstof en bij -80 ° C bewaard. De studie werd goedgekeurd door de ethische toetsingscommissie aan Third Militaire Medische Universiteit, en geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten voor deelname.

Cellijnen en celkweek

Alle cellijnen die in deze studie werden verkregen van Shanghai Type Culture Collection van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China), de menselijke maagkanker cellijnen AGS werd gekweekt in Ham's F12 (Hyclone) medium met 10% foetaal runderserum (FBS), andere maagkanker cellijnen MKN45 , HGC-27, BGC-823, SGC-7901 en humane embryonale nier (HEK) 293-cellen werden gekweekt in DMEM (Hyclone) met 10% FBS, werden ze allemaal gehandhaafd in een bevochtigde incubator met 5% CO _{2 bij 37 ° C zoals eerder beschreven.}

Kwantitatieve RT-PCR

Totaal RNA werd geëxtraheerd met Trizol reagens (Invitrogen), gevolgd door een reverse transcriptie met behulp TaqMan miRNA assays (Ambion), met kleine U6 nucleaire RNA als interne referentie genormaliseerd. qRT-PCR reacties werden uitgevoerd met de volgende parameters: 95 ° C gedurende 2 minuten gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 s en 60 ° C gedurende 30 s. qRT-PCR analyses voor het mRNA van PAI-1 werd uitgevoerd met behulp PrimeScript RT-PCR kit (Takara), met de volgende parameters: 95 ° C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van 95 ° C gedurende 5 s, 60 ° C 5 sec en 72 ° C gedurende 30 s. Het mRNA niveau van β-actine werd gebruikt als een interne controle. De sequenties van de gebruikte primers zijn weergegeven in tabel 2.

Northern blot

De klein RNA werd geïsoleerd onder de Mirvana RNA isolatie kit (Ambion). Drie paren van klinische monsters werden willekeurig gekozen uit de 21 patiënten voor verdere Northern blotanalyse. Northern blot werd uitgevoerd volgens de standaard procedure zoals eerder [17] descried. De DNA-oligonucleotide antisense probes gebruikt voor miR-30b detecteren en U6 snRNA als volgt: miR-30b (5'AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') en U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3')

Celtransfectie.

miR-30b bootst, roerei miR-control, chemisch gemodificeerd miR-30b duplex (agomir), chemisch gemodificeerd scrambled miR-control, PAI-1 siRNA, of siRNA negatieve controle werden gekocht van GenePharma (Shanghai GenePharma Co . Ltd., China). PAI-1 (Serpine1) Human cDNA ORF kloon werd gekocht van Origene (Origene Technologies, Beijing, China). Transfecties uitgevoerd met gebruik van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) volgens het protocol van de fabrikant.

Cell apoptoseassay FCM

SGC-7901 of HGC-27 cellen werden gezaaid in 12-well plaat in een geschikt dichtheid en gekweekt tot 30% confluentie na 24 uur. Daarna werden cellen getransfecteerd met miR-30b nabootst of miR-controle, en het medium vervangen door serumvrij DMEM gedurende 48 uur. Voor co-transfectie experimenten met miR-30b en PAI-1 tot expressie vector, werden SGC-7901-cellen die met miR-control of miR-30b nabootst en daarna met PAI-1 menselijke cDNA ORF kloon vector (aangeduid als PAI-1) of lege vector 24 uur later. 24 uur na transfectie vector, werd het medium vervangen door serumvrij DMEM nog eens 24 uur. Tenslotte werden de cellen toegepast om apoptose analyse. FCM-analyse, een Annexine V-FITC Apoptose Detectie Kit I (BD Pharmingen) werd vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie (BD FACSCantoTM II).

Caspase-Glo 3/7 Assay

de activiteit van caspase-3/7 werd gedetecteerd met de caspase-Glo 3/7 Assay (Promega). Voeg 100 ul van caspase-3/7 Glo reagens witte wanden 96 putjes, meng de inhoud van de putjes, en incubeer de putjes bij kamertemperatuur gedurende 30 min. De luminescentie werd gedetecteerd met de GloMax-96 Microplate Luminometer (Promega).

tumorigeniciteit assays naakt muizen

De muizen die bij dit experiment werden onder specifieke pathogeenvrije omstandigheden gehouden. Levensvatbare miR-30b en miR-mimics--controlegetransfecteerde SGC-7901-cellen (1 x 10 ^{6) werden gesuspendeerd in 100 pi PBS en subcutaan geïnjecteerd in elke zijde van de achterste flank van dezelfde vrouwelijke BALB /c athymische naakt muis 4-6 weken oud zoals eerder [25] beschreven. Tumorgroei en de conditie waaronder de algemene gezondheid en het gedrag van de muizen werden om de drie dagen onderzocht op 4 weken. De tumor beared muizen geen tekenen van pijn of angst, zoals gewichtsverlies of gedragsveranderingen, dus alle muizen werden opgeofferd door CO _{2 stikken op dag 28 na de injectie vertonen. Tumor volume (V) werd gevolgd door de lengte (L) en breedte (W) met schuifmaten en berekend met de formule (L x W 2) x 0,5.}}

TUNEL kleuring

De tumoren werden geoogst op 26 dagen en 10% formaldehyde-oplossing gefixeerd, vervolgens ingebed in paraffine. Secties (5 pm dik) die waren ontdaan van paraffine en gerehydrateerd werden gekleurd met hematoxyline en eosine. Apoptotische tumorcellen werden gekleurd door in situ methode terminal-deoxynucleotidyltransferase gemedieerde dUTP nick end labeling (TUNEL) met behulp van een in situ celdood detectie kit (POD; Roche Diagnostics Co.). Negatieve controle werd onderworpen aan dezelfde kleuring voor TUNEL zonder TdT. Beelden werden verzameld met behulp van microscoop met 200 x vergroting.

De bouw van plasmiden

De bouw van diverse luciferase rapport vectoren voor miR-30b doelwit werd uitgevoerd zoals eerder beschreven [16], [26] en het construct dat gemuteerd zaad gebied werd geproduceerd als een controle. De sequenties van oligonucleotiden die gebruikt zijn getoond in Tabel 2.

Luciferase assay en GFP repressie experimenten

HEK-293 cellen werden in 96-well platen geënt bij 5.000 cellen per putje de dag voor de transfectie. De cellen werden getransfecteerd met elk glimworm luciferase reporter vector, Renilla luciferase controlevector, pRL-TK (Promega) en miR-30b nabootst of miR-control (GenePharma). De luciferase assay werd uitgevoerd met behulp van de duale luciferase reporter assay systeem (Promega).

Voor GFP onderdrukking experimenten werden HEK-293 cellen uitgezaaid in 12-putjes plaat bij 1 x 10 ^{5 per putje de dag voor transfectie en vervolgens werden gecotransfecteerd met de miR-30b nabootst of miR-control met verschillende GFP reporter vectoren. De cellen werden onderworpen aan cytometrische analyse stromen, en gegevens werden geanalyseerd met behulp van CellQuest-Pro software.}

Western blot

Bewerkte cellen werden gewassen met ijskoude PBS en vervolgens gelyseerd met een cel lysis buffer (Doorboren). Na centrifugatie bij 12.000 rpm gedurende 15 min bij 4 ° C, werd de eiwitconcentratie gemeten door BCA eiwit assay kit (Pierce). Celeiwit lysaten werden gescheiden op 12% SDS gedenatureerde polyacrylamidegel en vervolgens overgebracht naar een polyvinylideendifluoridemembraan. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melkpoeder in Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 7,4, bevattende 0,05% Tween 20 en geïncubeerd met primaire antilichamen voor PAI-1 (1:1000, Abcam) en β-actine (1:1000 Santa Cruz) bij 4 ° C overnacht respectievelijk. Membranen werden gewassen en geïncubeerd met mierikswortel peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5000, Santa Cruz) volgens de instructies van de fabrikant. Het gewenste eiwit werd zichtbaar gemaakt met ECL Western blotting substraat (Pierce) en Chemidoc XRS Gel Documentation System (BioRad).

Statistische analyse

De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) uit ten minste drie onafhankelijke experimenten. Student's t test werd toegepast om de verschillen tussen groepen te analyseren. De relatie tussen de miR-30b-niveau en PAI-1expression werd geanalyseerd met behulp van Pearson's correlatie. Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS software (versie 17). Statistische verschillen waren significant bij het opgegeven P Restaurant < 0,05-niveau. Statistisch significante gegevens worden aangegeven met een asterisk ( P Restaurant < 0,05 (*), P
. ≪ 0,01 (**)

Resultaten

verminderde miR-30b in humane maagkanker cellijnen en weefselmonsters GC

Om de rol van miR-30b bij de pathogenese van maagkanker bepalen, analyseerden we de miR-30b niveaus in verschillende maagkanker cellen, waaronder HGC-27, AGS, BGC-823 en SGC-7901. Zoals getoond in figuur 1A, de expressie van miR-30b significant neerwaarts gereguleerd vier cellijnen vergeleken met een groep van vijf niet-tumor gastrische weefsels ( P Restaurant <.. 0,01)

De expressie van miR-30b werd verder onderzocht in 21 gekoppelde GC en de aangrenzende niet-tumor maag weefsels door middel van TaqMan kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) Zoals getoond in de Figuur 1B was de daling van miR-30b werd gevonden in 18 van 21 patiënten (85,7%) vergeleken met de overeenkomstige niet-tumorweefsels. Ook de spreidingsdiagram gebleken dat miR-30b significant neerwaarts gereguleerd in maagkanker monsters versus normale maagslijmvlies, met gemiddeld 6,28-voudige verlaging ( P
= 0,002) (Figuur 1C). De expressie gegevens verkregen van qRT-PCR valideren, 3 van 21 paren monsters werden willekeurig gekozen om het niveau van miR-30b middels Northern bout bepalen. We vonden ook de consequente verminderde expressie van miR-30b bij maagkanker in vergelijking met niet-tumor maag weefsels (figuur 1D). Deze resultaten suggereren dat miR-30b expressie vaak neerwaarts gereguleerd bij maagkanker en misschien betrokken zijn bij de ontwikkeling van maagkanker.

Overexpressie van miR-30b verhoogt de apoptose van maagkanker cellen

Een van het kenmerk van kanker is de mogelijkheid om apoptose [27] ontwijken, zodat het effect van miR-30b op maagkanker cellen apoptose onderzocht. SGC-7901 of HGC-27 cellen werden getransfecteerd met miR-30b nabootst of roerei miR-controle, en de geldigheid van miR-30b ectopische expressie werd bevestigd door qRT-PCR (Figuur 2A). Dan is het effect van miR-30b op apoptose van SGC-7901 of HGC-27-cellen werd geëvalueerd door flowcytometrie analyse (FCM) en caspase-3/7-activiteit assays. Zoals getoond in figuur 2B en 2C, vonden we het percentage apoptotische cellen significant verhoogd in SGC-7901 of HGC-27 cellen getransfecteerd met miR-30b bootst opzichte van miR-controle getransfecteerde cellen (16,08% versus
8,25% tot SGC-7901 cellen, en 17,83% versus
10,87% naar HGC-27 cellen). Bovendien, aanzienlijke toename van caspase-3/7-activiteit werd gevonden in SGC-7901 of HGC-27-cellen die met miR-30b ten opzichte van miR-control transfectanten ( P Restaurant < 0,01, figuur 2D). Bovenstaande resultaten tonen aan dat overexpressie van miR-30b van de apoptose van maagkanker kunnen bevorderen in vitro.

miR-30b onderdrukt tumorgeniciteit en bevordert de cel apoptose in vivo

Om verder te bepalen of miR-30b is die betrokken zijn bij het ontstaan ​​van tumoren van maagkanker, werd naakt muis xenograft model gebruikt. Omdat we vonden dat miR-30b een belangrijke rol gespeeld bij het bevorderen van SGC-7901 cellen apoptose dan HGC-27 cellen in vitro onderzoeken we de rol van miR-30b in het ontstaan ​​van tumoren van maagkanker met behulp van SGC-7901-cellen. miR-controle- en-miR-30b getransfecteerd SGC-7901-cellen werden subcutaan geïnjecteerd in beide achterste flank van dezelfde naakt muizen. De muizen werden gedurende waarneming van xenograft groei van 4 weken. Het bleek dat invoering van miR-30b in SGC-7901 cellen tot een significante vermindering van de omvang van tumorvolume (figuur 3A en 3B), en tumoren afgeleid van miR-30b behandelde SGC-7901-cellen groeiden langzamer dan in de controlegroep groep gedurende de hele tumor groeiperiode (figuur 3C, linkerpaneel). Wanneer tumoren werden geoogst, het gemiddelde volume van de tumoren zijn afgeleid van de groep miR-30b bootst was slechts 27,87% van die in de miR-controlegroep (figuur 3C, rechter paneel, P Restaurant < 0,01). De tumoren werden geoogst 26 dagen na twee zijden van de achterste flank van dezelfde muis apoptose in situ gemeten door TUNEL. Zoals getoond in figuur 3D, tumorsecties van miR-30b bootst behandelde xenotransplantaten vertoonden significant toenemen in TUNEL-positieve cellen. Deze resultaten suggereren sterk dat de invoering van miR-30b kon maag groei van kanker remmen door het bevorderen van apoptose van kankercellen.

PAI-1 is een kandidaat-doelwit-gen van miR-30b

Om verder de functie van miR-30b, is het belangrijk om te bepalen welke gastheer mRNA wordt gereguleerd door miR-30b. In onze vorige studie onderzochten we het mRNA expressieprofiel in vijf paar primaire tumorweefsels maagkanker patiënten en voldoen niet-tumorweefsels gebruikt microarray. Totally, hebben we 303 opwaarts gereguleerd genen (fold change > 2, P Restaurant < 0,05) bij maagkanker weefsels in vergelijking met niet-tumorweefsels (gegevens niet getoond). Gezien de downregulated expressie van miR-30b bij maagkanker, hebben we ons gericht op de lijst van genen met een toename van uitdrukkingen en gekozen voor de top 30 steeg genen bij maagkanker, vervolgens bepaald of deze genen waren potentiële doelwitten van miR-30b met behulp van de voorspelling algoritme , TargetScan. Interessant, vonden we dat PAI-1 gen dat werd opgereguleerd in microarray (3,83 maal, P
= 0,04) kan een waarschijnlijke doelgen van miR-30b (figuur 4A) zijn. Om direct aan te pakken of miR-30b bindt aan de 3'-UTR van het doel mRNA's, gebouwd we het luciferase rapport vectoren die de vermeende miR-30b bindingsplaatsen binnen 3'-UTR bevatten. Zoals getoond in figuur 4B, zagen we een duidelijke vermindering van luciferaseactiviteit ( P
< 0,01) na contransfection luciferase verslag vectoren en miR-30b nabootst. In tegenstelling, geen verandering van luciferase werd waargenomen in cellen getransfecteerd met het gemuteerde 3'-UTR constructen. Dit resultaat werd vervolgens bevestigd door GFP repressie experimenten. Zoals getoond in figuur 4C en 4D, werd GFP fluorescentie significant verminderd in cellen getransfecteerd met GFP verslag vectoren die bindingsplaatsen en miR-30b nabootst, terwijl er geen verandering van GFP-fluorescentie in cellen die met vector mutant en miR-30b nabootst. Bovendien overexpressie van miR-30b en AGS HGC-27 cellen resulteerde in de down-regulatie van de eiwit niveaus van PAI-1 (Figuur 4E). Samengevat bovenstaande gegevens suggereren dat PAI-1 is een mogelijk doelwit van miR-30b en miR-30b kan downreguleren het doeleiwit.

omgekeerde correlatie tussen mir-30b en PAI-1-expressie in de maag kanker weefsels en kankercellijnen

Aangezien miR-30b neerwaarts gereguleerd bij maagkanker, en het is gerapporteerd dat PAI-1 eiwit bij maagkanker weefsels veel hoger dan in de niet-tumorweefsels [ ,,,0],28], voerden we de correlatie-analyse tussen miR-30b en PAI-1 expressie in maagkanker cellijnen en maagkanker weefsels. Zoals getoond in figuur 5A top, PAI-1 eiwitniveau de laagste in AGS cel, onder de vijf maag cellijnen. Daarentegen miR-30b niveau het hoogst in AGS, vergeleken met andere cellijnen (figuur 5A onder). Vervolgens onderzochten we PAI-1 en miR-30b expressie in 21 sets van maagkanker en naburige niet-tumorweefsels. Wij vonden dat 81% (17/21) van maagkanker getoond hoger PAI-1-mRNA in vergelijking met normale weefsels. In contrast, miR-30b werd algemeen down-gereguleerd in 18 van 21 tumoren. Met behulp van Pearson's correlatie analyse, zagen we een significante omgekeerde correlatie tussen miR-30b en PAI-1-mRNA (Figuur 5B, R
= -0,6475, P
= 0,0123). Bovenstaande resultaten suggereren dat miR-30b expressie omgekeerd gecorreleerd is met PAI-1-expressie bij maagkanker en verhoogde PAI-1-expressie bij maagkanker gevolge van lagere miR-30b expressie kunnen zijn.

PAI-1 is mogelijk betrokken zijn bij-miR-30b-geïnduceerde apoptose

Om verder te onderzoeken of PAI-1 is betrokken bij miR-30b-bevorderde apoptose, we eerst getest of de silencing van PAI-1 expressie kan hebben soortgelijke apoptose bevorderen effect als miR-30b overexpressie. SGC-7901-cellen werden getransfecteerd met PAI-1 siRNA of RNA negatieve controle (NC) gedurende 48 uur, zie figuur 6A, kunnen de mRNA niveaus van PAI-1 aanzienlijk worden verminderd door de siRNA. Vervolgens, PAI-1 siRNA wordt weergegeven voor de hand liggende stijgingen in de apoptotische tarief SGC-7901-cellen (figuur 6B, 6C), in vergelijking met miR-control. Met name PAI-1 siRNA kon het effect van miR-30b overexpressie op apoptose regulatie kankercellijnen (Figuur 6B, 6C) phenocopy. Een representatief voorbeeld van puntdiagram werd weergegeven in figuur 6D. Vervolgens hebben we ook onderzocht of PAI-1 het effect van het bevorderen van apoptose door miR-30b kon af te schaffen. SGC-7901-cellen werden getransfecteerd met miR-control of miR-30b signaalpeptidase 24 uur, gevolgd door transfectie van PAI-1 ORF Human cDNA kloon vector (aangeduid als PAI-1) of lege vector. Zoals getoond in figuur 6E-G, de overexpressie van PAI-1 resulteerde in duidelijke onderdrukking van het effect van miR-30b-geïnduceerde apoptose. Samengenomen suggereren onze resultaten dat PAI-1 mogelijk is betrokken bij miR-30b-bevorderde apoptose.

Discussie

Hoewel deregulering van miRNAs waargenomen bij maagkanker weefsels en cellijnen, de exacte werkingsmechanisme waardoor miRNAs moduleren het proces van tumorigenese is nog niet volledig opgehelderd. Tot op heden is een aantal miRNAs gemeld gefunctioneerd als oncogen bij de ontwikkeling van maagkanker [29], [30], maar miRNAs als tumorsuppressorgenen moeten verder worden onderzocht.

Hier hebben we toonde miR-30b werd down-gereguleerd bij maagkanker cellen en tumor weefsel. Onze gegevens blijkt ook dat overxepression van miR-30b de apoptose van maagkanker cellen in vitro en in vivo kunnen verbeteren en miR-30b kon tumorgroei onderdrukken maagkanker in vivo. We verder gekenmerkt PAI-1 als potentieel doel van miR-30b en de expressie van miR-30b is omgekeerd gecorreleerd met PAI-1-expressie bij maagkanker. Bovendien wordt PAI-1 mogelijk betrokken in miR-30b-geïnduceerde apoptose. Bovenstaande bevindingen suggereren miR-30b kan fungeren als nieuw tumor suppressor door het reguleren van apoptose van kankercellen bij maagkanker.

miR-30b is een van de miR-30 familie die is geassocieerd met de ontwikkeling van vele types kankers. De rol van miR-30b tumorigenese is controversieel. miR-30b werd gemeld te worden down-gereguleerd bij prostaatkanker [31], invasieve blaas tumor [32], anaplastisch schildklierkanker [33], slokdarmkanker [34], en longkanker [35], terwijl verhoogde expressie van de buitenspiegels 30b werd geïdentificeerd in medulloblastoom [36] en maligne mesothelioom [37]. Daarnaast werd miR-30b geïdentificeerd als een onafhankelijke voorspellers van herhaling-vrije overleving van hepatocellulair carcinoom [38]. Sinds miR-30b was ofwel up-gereguleerd of gereduceerd in verschillende vormen van kanker, kunnen we een conclusie dat miR-30b verschillende rollen kan spelen als een oncogen of een tumor suppressor gen in diverse vormen van kanker te trekken.

In de huidige studie vonden we dat miR-30b expressie aanzienlijk maagkanker weefsels en cellijnen werd verminderd vergeleken met normale gastrische weefsels. In overeenstemming met onze bevinding werd miR-30b blijkt te zijn down-uitgedrukt door microRNA array 184 maagkanker en 169 niet-tumor mucosae [39], en Qiao et al vonden dat miR-30b werd naar beneden gebracht in maagkanker weefsel en maagkanker cellijnen, AGS en BGC-823 cellen [40]. Derhalve kan het verlies van miR-30b expressie betrokken bij de pathogenese en progressie van maagkanker.

Apoptose is een geordend proces van celdood die optreedt in fysiologische en pathologische omstandigheden. Een verstoring van deze delicate evenwicht kan leiden tot de ontwikkeling van kanker [27]. Nu is er weinig bekend over het effect van miR-30b op apoptose bij kanker. De controversiële expressie van miR-30b stelt de complexiteit van de functie van miR-30b. Onlangs, Li et al [41] vonden dat miR-30b significant verlaagd in reactie op de oxidatieve stress stimulatie en miR-30b kunnen mitochondriale splijting en daaropvolgende apoptose remmen. Integendeel, is aangetoond dat miR-30 de zelfvernieuwing kan remmen en apoptose van borst tumor-initiërende cellen (BT-ICs) door silencing UBC9 en ITGB3 [42]. Boven bewijzen geven aan dat miR-30 is een multifunctionele gen dat kan remmen of induceren de apoptose. In het huidige rapport, vonden we ectopische expressie van miR-30b kon de apoptose van maagkanker cellen in vitro, en overexpressie van miR-30b induceren aanzienlijk kunnen remmen tumorgroei in naakt muis xenograft model door het induceren van de apoptose van maagkanker cellen in vivo. Bovenstaande bevindingen suggereren dat miR-30b mogelijke rol in de maag kankerontwikkeling door bevordering van apoptose van kanker spelen.

Om het moleculaire mechanisme dat ten grondslag miR-30b functie staand, is het belangrijk om het doelgen te identificeren. Onlangs heeft een aantal nieuwe targets van miR-30b is bevestigd, waaronder p53 [43], Delta-achtige 4 [44], en Snail1 [45]. In ons onderzoek PAI-1was geïdentificeerd als een doelgen van miR-30b bij maagkanker. PAI-1 is de belangrijkste remmer van tPA en uPA en PAI-1 kan blokken de activatie van plasminogeen. Het is goed gedocumenteerd dat de expressie van PAI-1 is hoger bij maagkanker dan in controle weefsels en PAI-1 kan dienen als een prognostische factor bij maagkanker, voorspelt kortere overleving [28], [46], [47 ]. Interessant is dat uit recente cijfers blijkt de protumorigenic activiteit van PAI-1 kan worden door middel van een antiapoptotic functie [22]. Onze studie toonde aan dat miR-30b expressie omgekeerd werd gecorreleerd met PAI-1 expressie in maagkanker cellijnen en tumor weefsel, PAI-1 overexpressie kon het effect van het bevorderen van apoptose door miR-30b tegen te gaan, en ectopische expressie van miR-30b had soortgelijke bevorderen van apoptose effect tegen silencing PAI-1-expressie. Het suggereert dat de miR-30b-PAI-1 as betrokken kan zijn bij de ontwikkeling van maagkanker. Maar de downstream pathway is nodig nader worden onderzocht.

De ontwikkeling van maagkanker wordt gekenmerkt door multifactoriële en meertraps proces, en H. pylori
is aangetoond dat de belangrijkste oorzaak van maagkanker. Recente rapporten van ons onderzoek en andere onderzoeken hebben de regulerende rol van miRNAs in H gemarkeerd. pylori
infectie en geassocieerde ziekten. miRNA is een mogelijke brug uit H.

• PLoS ONE: intratumor IL-17-positieve mestcellen zijn de voornaamste bron van de IL-17 die voorspellend is voor overleving bij maagkanker Patients
• PLoS ONE: Helicobacter pylori Bevordert-mesenchymale transitie bij maagkanker door neerwaarts reguleren van geprogrammeerde celdood Protein 4 (PDCD4)