PLoS One: miR-30b, alulszabályozott gyomorrákban, elősegíti az apoptózist és gátolja a tumor növekedését célzás plazminogén aktivátor inhibitor-1

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

A gyomorrák egyik leggyakoribb rosszindulatú daganatos megbetegedések világszerte. Feltörekvő bizonyítékok azt mutatják, hogy a mikroRNS (miRNS) társított tumor kialakulásában és progressziójában. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a H. pylori
fertőzés volt képes indukálni a megváltozott expressziója miR-30b gyomor epiteliális sejtekben. Azonban keveset tudunk a lehetséges szerepét a miR-30b gyomorrákban. Katalógusa

Módszerek katalógusa

Elemeztük a kifejezés a miR-30b gyomorrákban sejtvonalak és humán gyomorrák szöveteket. Vizsgáltuk a hatását miR-30b utánozza a apoptózisát gyomorrák sejtek in vitro áramlási citometriával (FCM) és a kaszpáz-3/7-aktivitására vizsgálatokban. Csupasz egér xenograft modellt alkalmaztunk annak meghatározására, hogy a miR-30b szerepet játszik tumorigenezisben gyomorrák. A cél a miR-30b azonosítottuk bioinformatikai elemzés iuciferázvizsgáió és Western blot. Végül végeztünk a korrelációs elemzés között miR-30b és cél expressziós gyomorrákban. Katalógusa

Eredmények katalógusa

miR-30b szignifikánsan lefelé szabályozni a gyomorrák sejtek és humán gyomorrák szöveteket. Erőltetett expressziója miR-30b elősegítette a apoptózis gyomorrák sejtek in vitro, és miR-30b jelentősen gátolni tumorképző gyomorrák növelésével apoptózis aránya a rákos sejtek in vivo. Ezen kívül, a plazminogén aktivátor inhibitor-1 (PAI-1) azonosították, mint a potenciális célpont a miR-30b, és miR-30b-szint fordított korrelációban áll a PAI-1 expresszió gyomorrák. Ezen túlmenően, hangtompító a PAI-1 képes volt phenocopy hatását miR-30b túlexpresszió apoptózis szabályozása a rákos sejtek, és túlzott mértékű expressziója a PAI-1 tudta elnyomta a hatása, hogy elősegíti sejt apoptózis által miR-30b, jelezve, PAI-1 potenciálisan részt vevő miR-30b-indukált apoptózis a rákos sejtekre.

Következtetés

miR-30b működhet, mint egy új tumor-szuppresszor gén gyomorrák megcélozva PAI-1 és szabályozó apoptózisát rákos sejteket. miR-30b szolgálhat, mint potenciális biomarker és terápiás célpont ellen gyomorrák.

bevezető hivatkozás: Zhu E-D, Li N, Li B-S, Li W, Zhang W-J, Mao X-H, et al. (2014) miR-30b, alulszabályozott gyomorrákban, elősegíti az apoptózist és gátolja a tumor növekedését célzás plazminogén aktivátor inhibitor-1. PLoS ONE 9 (8): e106049. doi: 10,1371 /journal.pone.0106049 katalógusa

Szerkesztő: Gerolama Condorelli, Federico II Egyetem Nápoly, Olaszország, Olaszország katalógusa

Beérkezett: május 7, 2014; Elfogadva: július 28, 2014; Megjelent: augusztus 29, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Zhu et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Az adatok elérhetősége: A szerzők megerősítik, hogy az összes adatot a megállapításokat alátámasztó teljes mértékben hozzáférhető, korlátozás nélkül. Minden lényeges adat a papír és az azt támogató információs fájlokat. Katalógusa

Forrás: Ezt a munkát támogatott Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 81202310), Tudományos Innovációs Kutatási Alapítvány Harmadik Katonai Orvosi Egyetem (No. 2009XQN20). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a gyomorrák miatt körülbelül 738.000 halnak meg világszerte évente, és ez már elismerten a harmadik vezető oka a rák okozta halál a férfiak [1]. A korai diagnózis és kezelés vezettek kiváló elvárások a hosszú távú túlélés és a jó prognózisú, míg a kilátások betegek előrehaladott gyomorrák továbbra is gyenge. Mint más rák, a gyomorrák kialakulásával Úgy gondolják, hogy multifaktoriális. Helicobacter pylori (H. Pylori) fertőzés katalógusa felismerték, hogy fontos kiváltó gyomorrák [2]. Bár sok genetikai és epigenetikai változások jelentettek gyomorrák, a molekuláris mechanizmusának fejlesztése gyomorrák még tisztázatlan.

mikroRNS (miRNS-ek) kis nem kódoló RNS-ek, hogy a poszttranszkripciós szabályozzák a génexpressziót. Érett miRNS képes specifikusan kötődni a 3 'UTRs megcélzott celluláris mRNS viszont kiváltó mRNS lebomlás vagy gátlását fordítás [3], [4]. miRNS jár kulcsfontosságú szabályozó sokféle biológiai eljárások, beleértve a fejlesztési, a sejt differenciálódást, az apoptózist, az anyagcserét, és a jelátvitel [5], [6]. Bebizonyosodott, hogy 50% -a miRNS gyakran található rákhoz kapcsolódó genomi régiók vagy a törékeny oldalak [7]. Egyre több bizonyíték azt mutatja, hogy az aberráns miRNS expressziója korrelál a különböző humán rák, és azt jelzi, hogy a miRNS működhet onkogének vagy tumor-szuppresszor gének [8] - [10]. Nemrégiben jelentős számú szabályozatlan miRNS beleértve a miR-106b-25 klaszter, a miR-21, miR-218, miR-7, és a miR-335 azonosítottak modulátorok sejtnövekedést, apoptózist, a migráció, vagy invázió a gyomorrák fejlesztés [11] - [15]. Ezek az eredmények azt sugallják, a miRNS játszhatnak fontos szerepet játszik a az gyomorrák. Katalógusa

A korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a H. pylori fertőzés katalógusa képes indukálni a megváltozott expressziója miRNS a gyomornyálkahártya-sejtek, beleértve a miR-155, miR-146a és miR-30b, miRNS működhet újszerű negatív szabályozó finomhangolását H. pylori
-indukált gyulladás [16], [17]. Ezenkívül kimutattuk, hogy a miR-146a játszhat potenciális szerepet a gyomorrák kialakulásával modulálja a proliferáció és az apoptózis a gyomorrák-sejtek [18]. Nevezetesen, azt is megállapította miR-30b lehet szabályozni a autofágia folyamat során H. pylori
fennállnak fertőzés, hozzájárulva ezzel a tartósan H. pylori fertőzés katalógusa [19]. Azonban a szerepe a miR-30b a gyomorrák még mindig nagyrészt ismeretlen.

A plazminogén aktivátor inhibitor 1 (PAI-1) a fő szerin proteáz inhibitor a szöveti típusú (t-PA) és az urokináz-típusú ( u-PA) plazminogén aktivátor, és ezért fontos szerepet játszik a plazminogén-plazmin rendszer [20]. Korábbi tanulmányok már illusztrált PAI-1 egy rossz prognosztikai faktor több közös tumorok, és a kapcsolódó rák terjedését és áttétét [21]. Az utóbbi időben sok csoport is úgy találták, hogy a PAI-1 elősegítheti a tumor növekedését gátlásán keresztül apoptózis. Például mellett egy stabil vad típusú PAI-1 a humán prosztatarák sejtvonalat PC-3, a humán promielocitás leukémia sejtvonal HL-60 és még a nem-tumoros sejtek eredményezett jelentős az apoptózis gátlása [22] . Amikor injektáltunk szubkután meztelen egerek a PAI-1 overexpresszáló rágcsáló fibrosarcoma sejtek, a tumorokat gyorsan létre, míg a PAI-1 deficiens sejtek volt egy elfojtott tumorképző [23]. Egy másik jelentés azt mutatta, hogy a genetikai és farmakológiai gátlása PAI-1 humán tumor sejtvonalakon (HT-1080, A549, HCT-116 és MDA-MB-231) fokozott spontán apoptózist, és érdekes módon, beültetett a PAI-1 knockdown HT- 1080 sejtek PAI-1 knockout egerekben csökkenését eredményezte tumorigenezis és hosszabb túlélést, mint a kontroll egerekben [24]. Ezek a tanulmányok fontos bizonyítékot arra, hogy a PAI-1 protektív szerepet ellen tumorsejtek apoptózisát.

jelenlegi vizsgálatban azt találtuk, hogy a miR-30b szignifikánsan down-szabályozott gyomor rákos sejtek és a tumoros szövetekben. Méhen kívüli kifejezése miR-30b elősegítheti az apoptózist gyomorrák sejt in vitro, és miR-30b jelentősen gátolja tumorképző gyomorrák csupasz egér xenograft modellben. Sőt, a PAI-1-et azonosították a potenciális célpontok a miR-30b, és miR-30b befolyásolhatják az apoptózist, és elnyomja a tumornövekedést represszáló expresszióját a PAI-1. Eredményeink arra utalnak, hogy a miR-30b működhet egy új tumor szupresszor gén gyomorrák és lehet potenciális terápiás célpont gyomorrák. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai Nyilatkozat katalógusa

Minden az állatkísérletek hagyta jóvá állat Etikai és Kísérleti Bizottsága harmadik Katonai Orvosi Egyetem. Minden állat a műtét alatt végeztük nátrium pentobarbitál érzéstelenítés, és minden erőfeszítést tettek arra, hogy minimálisra csökkentsék a szenvedést. A tanulmány magában szövetmintából jóváhagyta az etikai bizottsága a Harmadik Katonai Orvosi Egyetem, és írásos beleegyezését adta a minden beteg való részvétel előtt. Katalógusa

szövetmintából katalógusa

A teljes, gyomorrák szövetek és a szomszédos nem-daganatos szöveteket szenvedő betegekből származó primer gyomorrák áteső radikális gastrectomián a Southwest Kórház, harmadik Katonai Orvosi Egyetem, Kína, és a klinikai és patológiai jellemzői gyomorrák betegek 1. táblázat foglalja össze műtéti eltávolítását követően, a szöveteket lefagyasztottuk azonnal folyékony nitrogénben, és -80 ° C-on. A tanulmány által jóváhagyott etikai bizottsága a Harmadik Katonai Orvosi Egyetem, és beleegyezését adta az összes beteg való részvétel előtt. Katalógusa

Sejtvonalak és sejtkultúrák katalógusa

Minden sejtvonal ebben a vizsgálatban alkalmazott kaptuk Shanghai Type Culture Collection of kínai Tudományos Akadémia (Shanghai, Kína), a humán gyomorrák sejtvonalakon AGS volt tenyésztjük Ham-féle F12 (Hyclone) tápközegben, amely 10% magzati borjúszérumot (FBS), egyéb gyomor rákos sejtvonalak MKN45 , HGC-27, BGC-823, SGC-7901 és humán embrionális vese (HEK) 293 sejteket tenyésztettünk DMEM (Hyclone), 10% FBS-sel, mindannyian fenn nedvesített inkubátorban, 5% CO _{2 at 37 ° C-on az előzőekben leírt.}

kvantitatív RT-PCR

Teljes RNS-t extraháljuk Trizol reagens (Invitrogen), majd egy reverz transzkripció, TaqMan miRNS assay (Ambion), a U6 kis nukleáris RNS mint belső normalizált referencia. QRT-PCR reakciót végeztünk az alábbi paraméterek: 95 ° C-on 2 perc, majd 40 ciklus 95 ° C-on 15 s és 60 ° C-on 30 másodpercig. QRT-PCR analízis az mRNS a PAI-1 végeztük alkalmazásával PrimeScript RT-PCR kitek (Takara), a következő paraméterek mellett: 95 ° C-on 30 s, majd 40 ciklus: 95 ° C-on 5 s, 60 ° C-on 5 s és 72 ° C-on 30 másodpercig. Az mRNS szintje β-aktin használtunk belső kontrollként. A szekvenciák alkalmazott primerek az 2. táblázatban mutatjuk be

Northern blot

Kis méretű RNS-t izoláltunk a Mirvana RNS Isolation Kit (Ambion). Három pár klinikai mintákat véletlenszerűen kiválasztott a 21 beteg a későbbi Northern blot analízissel. Northern-blot szerint végeztük a szokásos eljárás, mint descried korábban [17]. A DNS-oligonukleotid antiszensz próbák kimutatására használt miR-30b és U6 snRNS a következők voltak: a miR-30b (5'AGCTGAGTGTAGGATGTTTACA-3 ') és U6 (5'-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3').

Cell transzfekció

miR-30b utánozza, rántotta miR-ellenőrzés, kémiailag módosított miR-30b duplex (agomir), kémiailag módosított kódolt miR-vezérlés, PAI-1 siRNS vagy siRNS negatív kontroll vásároltunk GenePharma (Shanghai GenePharma Co Kft., Kína). PAI-1 (Serpine1) Humán cDNS ORF klónt vásárolt OriGene (OriGene Technologies, Peking, Kína). A transzfekciókat végeztünk Lipofectamine 2000 (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint.

sejt apoptózis assay által FCM

SGC-7901 vagy HGC-27 sejteket szélesztettünk 12 lyukú lemez egy megfelelő sűrűség és nőtt a 30% -os összefolyásig 24 óra után. Ezután sejteket transzfektáltunk a miR-30b utánozza, vagy miR-ellenőrzés, és a tápközeget helyettesítettük szérummentes DMEM 48 órán át. Ko-transzfekcióhoz kísérlet miR-30b és a PAI-1-et expresszáló vektor, SGC-7901 sejteket transzfektáltunk miR-kontroll, illetve a miR-30b utánozza, majd a PAI-1 humán cDNS ORF-klón vektor (jelölése a PAI-1) vagy üres vektorral 24 órával később. 24 h után vektor transzfekció a tápközeget helyettesítettük szérummentes DMEM további 24 órán át. Végül a sejteket alkalmazzuk apoptózis elemzést. FCM analízis, egy Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen) használtunk, majd áramlási citometriával analizáltuk (BD FACSCantoTM II).

Caspase-Glo 3/7 Assay

a tevékenység a kaszpáz-3/7 alkalmazásával mutattuk caspase-Glo 3/7 Assay (Promega). Adjon 100 ul Caspase-Glo 3/7 reagenssel, fehér falú 96-lyukú lemezen, óvatosan keverjük össze tartalmát kutak, majd inkubáljuk az üregeket szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. A lumineszcencia alkalmazásával mutattuk GloMax-96 Microplate luminométer (Promega).

tumorképző assay nude egerekben

Az egereket ebben a kísérletben használt tartottuk alatt specifikus patogénmentes körülmények között. Életképes miR-30b mimics- és miR-vezérlés-transzfektált SGC-7901 sejteket (1 × 10 ^{6) szuszpendáltunk 100 ul PBS-ben, majd szubkután injekció formájában beadjuk mindkét oldalán a hátsó szárnyát ugyanazon nőstény BALB /c atímuszos meztelen egeret 4-6 hetes korban a korábban ismertetett módon [25]. A tumor növekedését és a feltétellel, beleértve az általános egészség és az egerek viselkedésére vizsgáltuk háromnaponta 4 héten át. A tumor csapágyazott egerek nem mutatják a fájdalom jeleit vagy stresszt, mint a súly veszteség vagy viselkedési változásokat, így az összes egereket leöltük CO _{2 fulladás a 28. napon injekció beadása után. A tumor térfogatát (V) mérésével követtük nyomon a hosszúság (L) és szélességét (W) féknyergek és képlet segítségével számíthatók ki (L × W 2) × 0.5. Katalógusa}}

TUNEL festés katalógusa

A tumorokat betakarított 26 nap, és a rögzített 10% -os formaldehid-oldatot, majd paraffinba ágyazzuk. Szakaszok (5 jim vastag), amelyet előzőleg paraffint és rehidratált megfestjük hematoxilinnel és eozinnal. Az apoptotikus tumorsejteket festettük in situ terminál deoxynucleotidyltransferase közvetítette dUTP nick end címkézés (TUNEL) módszer alkalmazásával in situ sejthalált detektáló kit (POD; Roche Diagnostics Co.). Negatív kontroll vetjük alá, ugyanazt a festési TUNEL nélkül TdT. Kép gyűjtöttük segítségével mikroszkóp × 200 nagyítással. Katalógusa

plazmidok

Az építkezés különböző luciferáz jelentés vektorok miR-30b cél a korábbiakban leírt [16], [26] , és a konstrukciót tartalmazó mutáns mag régiót keletkezett, mint a kontroll. A szekvenciákat az oligonukleotidok felhasznált 2. táblázatban mutatjuk be

Luciferáz assay és GFP elnyomás kísérletek

HEK-293-sejteket szélesztettünk 96 lyukú lemezen 5000 sejt per lyuk a nap előtt transzfekció. A sejteket transzfektáltuk az egyes szentjánosbogár luciferáz riporter vektorral, Renilla luciferáz kontroll vektorral, pRL-TK (Promega), és miR-30b utánozza, vagy miR-vezérlés (GenePharma). A luciferáz assay alkalmazásával végeztük kettős luciferáz riporter vizsgálati rendszer (Promega).

GFP elnyomás kísérletekhez HEK-293-sejteket szélesztettünk 12 lyukú lemezre 1 × 10 ^{5 per jól nap transzfekció előtt, majd kotranszfektáltunk a miR-30b utánozza, vagy a miR-szabályozás különböző GFP riporter vektorok. A sejteket vetjük alá áramlási citometriás elemzés, és az adatokat elemeztük alkalmazásával CellQuest Pro szoftver.}

Western blot

kezelt sejteket mostuk jéghideg PBS-sel, majd lizáljuk egy sejt lízis pufferben (Pierce). Centrifugálás után 12,000 rpm-en 15 percen át 4 ° C-on, a fehérje-koncentrációt BCA protein assay kit (Pierce). Sejtfehérje lizátumokat elválasztottuk 12% SDS-denaturáltuk poliakrilamid gélen, majd átvisszük egy polivinilidén-difluorid membránra. A membránokat blokkoltuk 5% zsírmentes szárított tej Tris-pufferolt sóoldat, pH = 7,4, amely 0,05% Tween 20-at, és inkubáltuk primer antitestekkel a PAI-1 (1:1000, ABCAM) és β-aktin (1:1000 , santa Cruz), 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán volt. A membránokat mostuk és inkubáltuk tormaperoxidázzal konjugált másodlagos antitestekkel (1:5000, Santa Cruz) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Az érdeklődésre számot tartó fehérje láthatóvá tettük ECL Western-blot szubsztrát (Pierce), és Chemidoc XRS Gel dokumentációs rendszer (BioRad).

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± standard deviáció (SD) legalább három független kísérlet során. Student-féle t-tesztet alkalmazva, hogy elemezze a csoportok közötti különbségek. A kapcsolat a miR-30b szint és a PAI-1expression elemeztük Pearson korreláció. A statisztikai elemzést az SPSS szoftver (version 17). Statisztikai különbségek nyilvánították szignifikáns P katalógusa < 0,05 szinten. Statisztikailag szignifikáns adatok csillagokkal jelöltük ( P katalógusa < 0,05 (*), P katalógusa < 0,01 (**). Katalógusa

Eredmények katalógusa

csökkent a miR-30b expresszió humán gyomorrák sejtvonalakon és GC szövetminták

Annak megállapításához, szerepét a miR-30b patogenezisében gyomorrák, elemeztük a miR-30b szintek különböző gyomorrák sejtek, beleértve HGC-27, AGS, BGC-823, SGC-7901. Amint az 1A ábrán látható, a kifejezés a miR-30b szignifikánsan alulszabályozott négy sejtvonalak összehasonlítva egy medence öt nem-daganatos gyomor szövetek ( P katalógusa < 0,01). katalógusa

A kifejezés a miR-30b tovább vizsgálták, 21 páros GC és a szomszédos nem-daganatos gyomor vetek TaqMan kvantitatív valós idejű PCR (qRT-PCR). Amint a 1B ábra, a csökkenés a miR-30b találtak 18 21 beteg (85,7%), mint a megfelelő nem-tumoros szövetekben. Továbbá a szórás diagram azt mutatta, hogy a miR-30b szignifikánsan down-szabályozott gyomorrák mintákban versus normál gyomornyálkahártya, átlagosan 6,28-szeres csökkenését ( p
= 0,002) (1C). Hogy érvényesítse a kifejezés szerzett adatok qRT-PCR, 3 mind a 21 pár mintákat véletlenszerűen választottuk szintjének meghatározása a miR-30b használó Észak csavart. Azt is megállapították, következetes csökkent expressziója miR-30b a gyomorrák, mint a nem-tumoros szövetekben gyomor (1D). Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a miR-30b kifejezés gyakran lefelé szabályozni a gyomorrák és talán részt vesz az a gyomorrák kialakulásával. Katalógusa

túltermelése miR-30b növeli az apoptózis gyomorrák sejtek katalógusa

az egyik fémjelzi a rák, hogy képes elkerülni az apoptózist [27], így felmértük a miR-30b a gyomor rákos sejtek apoptózis. SGC-7901 vagy HGC-27 sejteket a miR-30b utánozza, vagy kódolt miR-ellenőrzés, és az érvényességét miR-30b ectopiás expresszióját igazoltuk qRT-PCR (2A ábra). Akkor a hatása miR-30b az apoptózis SGC-7901 vagy HGC-27 sejteket értékeltük áramlási citometriával (FCM) analízissel és kaszpáz-07/03 aktivitás vizsgálatok. Amint azt a 2B ábra és a 2C, azt találtuk, az aránya az apoptotikus sejtek szignifikánsan emelkedett volt SGC-7901 vagy HGC-27 transzfektált sejtek miR-30b utánozza összehasonlítva miR-vezérlés-transzfektált sejtek (16,08% versus
8,25% az SGC-7901 sejtek és 17.83% versus katalógusa 10,87% -ról HGC-27 sejtek). Emellett jelentős növekedése kaszpáz-07/03 aktivitást észleltek SGC-7901 vagy HGC-27 transzfektált sejtek miR-30b képest miR-ellenőrzési transzfektánsok ( P katalógusa < 0,01, 2D ábra). Fenti eredmények azt mutatják, hogy túltermelése miR-30b elősegítheti a apoptózist gyomorrák in vitro. Katalógusa

miR-30b elnyomja tumorgenézisre és elősegíti a sejtek apoptózis in vivo katalógusa

A további meghatározására, hogy a miR-30b szerepet játszik tumorigenezisben gyomorrák, csupasz egér xenograft modellt alkalmaztunk. Mert azt találtuk, hogy a miR-30b játszott jelentősebb szerepet játszhat SGC-7901 sejtek apoptózis mint HGC-27 sejtek in vitro, kutatjuk a szerepe a miR-30b a tumorok gyomorrák segítségével SGC-7901 sejtek. miR-ellenőrzési és miR-30b-transzfektált SGC-7901 sejtek szubkután fecskendeztünk vagy hátsó oldalba azonos csupasz egerekben. Az egereket követendő megfigyelésére xenograft növekedési 4 héten át. Azt találtuk, hogy bevezetése miR-30b figyelembe SGC-7901 sejtek vezetett jelentős csökkenése a méret a tumor térfogata (3A és 3B ábrák), és a tumorok származó miR-30b kezelt SGC-7901 sejtek nőtt lassabban, mint a kontroll csoportban a teljes tumor növekedési időszak (3C, ábra, bal panel). Amikor a tumorok szüretelték, az átlagos mennyisége daganatok származó miR-30b utánozza csoport csak 27,87% -a, amely a miR-kontrollcsoport (3C, ábra, jobb panel, P katalógusa < 0,01). A tumorokat betakarított 26 nap két oldalán a hátsó szárnyon az azonos egér, az apoptózis in situ mértük TUNEL. Ábrán látható a 3D, a tumor metszetet miR-30b utánozza kezelt xenograftok mutatott jelentősen növeli a TUNEL-pozitív sejteket. Ezek az eredmények erősen javasolta, hogy bevezetése miR-30b gátolhatja gyomorrák növekedést elősegítő apoptózis rákos sejtek szaporodását. Katalógusa

PAI-1 egy kiszemelt gén miR-30b katalógusa

további értékeléséhez funkciója miR-30b, fontos meghatározni, hogy melyik gazda mRNS-ek jelenleg szabályozza miR-30b. Korábbi Azt vizsgáltuk, az mRNS expressziós profil öt pár primer tumor szöveteinek gyomorrákos betegek és kiegyenlített a nem daganatos szöveteket microarray. Teljesen, azt találtuk, 303 serkentett gének (szeres változást > 2, P
< 0,05) gyomorrák szövetekben, mint a nem-tumoros szövetekben (az adatokat nem mutatjuk be). Figyelembe véve a downregulált kifejezése miR-30b gyomorrákban összpontosítottunk listáján gének erősödését mutatja kifejezéseket és kiválasztotta a legjobb 30 emelkedett gének gyomorrák, akkor határozható meg, ha ezek a gének potenciális célpontjai a miR-30b használatával predikciós algoritmus , TargetScan. Érdekes módon azt találtuk, hogy a PAI-1-gén, amelyet felülszabályozott microarray (3,83-szeres, P
= 0,04) lehet egy valószínű célgént a miR-30b (4a ábra). Közvetlen megoldásához, hogy a miR-30b kötődik a 3'-UTR a cél mRNS-ek, megszerkesztettük a luciferáz jelentés vektorok, amelyek tartalmazzák a feltételezett miR-30b kötőhelyek belül 3'-UTR. Ahogyan a 4b ábrán látható, azt figyeltük meg egy jelentős luciferáz aktivitásban beállt csökkenés ( p
< 0,01) után contransfection luciferáz jelentés vektorok és miR-30b utánozza. Ezzel szemben a nem változik meg a luciferáz volt megfigyelhető transzfektált sejtekben a mutáns 3'-UTR konstrukciókat. Ezt az eredményt később megerősítette GFP elnyomás kísérletek. Amint azt a 4C és 4D, GFP fluoreszcencia jelentősen csökkent transzfektált sejtekben GFP jelentést tartalmazó vektorokkal kötőhelyek és miR-30b utánozza, míg nem volt változás a GFP fluoreszcencia transzfektált sejtekben mutáns vektort és miR-30b utánozza. Továbbá overexpressziója miR-30b AGS és HGC-27 sejteket eredményezett a down-regulációja a fehérje szintje a PAI-1 (ábra 4E). Összefoglalva, a fenti adatok arra utalnak, hogy a PAI-1 egy potenciális célpontja a miR-30b, és miR-30b lehet lefelé szabályozni a megcélzott fehérje.

inverz korrelációt mir-30b és a PAI-1 expressziót a gyomor rák szövetek és rákos sejtvonalakban

Tekintettel arra, hogy a miR-30b alulszabályozott a gyomorrák, és arról számoltak be, hogy a PAI-1 fehérje gyomorrák szövetekben drámaian magasabb, mint a nem tumoros szövetekben [ ,,,0],28], végeztünk a korrelációs elemzés között miR-30b és a PAI-1 expressziót gyomorrák sejtvonalakon és gyomorrák szövetekben. Amint az 5A ábra felső, a PAI-1 fehérje szinten volt a legalacsonyabb AGS sejt közül öt gyomor sejtvonalak. Ezzel szemben, a miR-30b szintű volt a legmagasabb AGS, míg a többi sejtvonal (5A ábra lent). Ezt követően megvizsgáltuk a PAI-1 és miR-30b expressziós 21 készlet gyomorrák és a szomszédos nem tumoros szövetekben. Azt találtuk, hogy 81% (17/21) a gyomor-daganatok jelennek meg magasabb PAI-1 mRNS összehasonlítva a normális szövetekben. Ezzel szemben a miR-30b-t gyakran alulszabályozott 18 21 daganatok. Pearson-féle korreláció analízis észleltünk szignifikáns negatív korreláció mutatkozott miR-30b és PAI-1 mRNS (5B, R katalógusa = -0,6475, P katalógusa = 0,0123). Fenti eredmények arra utalnak, hogy a miR-30b expressziós fordítottan arányos a PAI-1 expresszió a gyomorrák, és a továbbfejlesztett PAI-1 expresszió gyomorrák lehet eredményeként csökkent miR-30b expressziós.

PAI-1 potenciálisan részt vevő miR-30b-indukálta apoptózis katalógusa

Ahhoz, hogy tovább vizsgálja, hogy a PAI-1 szerepet játszik a miR-30b-mozdítani apoptózis, először azt vizsgáltuk, ha a hangtompító a PAI-1 expressziója lehet a hasonló mértékű apoptózist elősegítő a hatása, mint a miR-30b túltermelése. SGC-7901 sejteket transzfektáltunk a PAI-1 siRNS vagy negatív kontroll RNS-t (NC), 48 órán át, amint a 6a ábrán látható, az mRNS szinteket a PAI-1 jelentős mértékben csökkenthető annak siRNS. Ezt követően, a PAI-1 siRNS jelenik nyilvánvaló növekedés az apoptotikus ráta SGC-7901 sejteket (6B, 6C), szemben az miR-ellenőrzés. Nevezetesen, a PAI-1 siRNS képes volt phenocopy hatását miR-30b túlexpresszió apoptózis szabályozásában ráksejt (6B, 6C). Egy reprezentatív példája a dot plot ábrán látható 6D. Továbbá azt is vizsgálta, hogy a PAI-1-ből megszünteti a hatása, hogy elősegíti az apoptózis által miR-30b. SGC-7901 sejteket transzfektáltunk miR-kontroll, illetve a miR-30b utánozza 24 órán, és utána transzfekcióval PAI-1 humán cDNS ORF-klón vektor (jelölése a PAI-1), vagy üres vektor. Amint az ábrán 6E-G, a túltermelő a PAI-1 eredményezte nyilvánvaló elnyomás hatására a miR-30b-indukált apoptózis. Összegezve, eredményeink arra utalnak, hogy a PAI-1 potenciálisan részt vevő miR-30b-mozdítani az apoptózist. Katalógusa

Vita katalógusa

Bár deregulációja miRNS észlelték gyomorrák szövetek és sejtvonalak, a pontos molekuláris mechanizmus, amely által miRNS modulálják a folyamat a tumorigenezis még nem teljesen tisztázott. A mai napig, egy sor miRNS számoltak működni, mint onkogén a fejlesztés a gyomorrák [29], [30], azonban miRNS meghatalmazotti tumorszuppresszor gének tovább kell vizsgálni.

Itt mi kimutatta, miR-30b-t lefelé szabályozni a gyomorrák sejtek és tumoros szövetekben. Adataink azt is jelezte, hogy overxepression miR-30b javíthatja az apoptózis gyomorrák sejtek in vitro és in vivo, és miR-30b volt képes elnyomni tumornövekedés gyomorrák in vivo. Mi tovább jellemezzük a PAI-1, mint egy potenciális célpontja a miR-30b, és a kifejezés a miR-30b fordítottan korrelált a PAI-1 expresszió gyomorrák. Ezen túlmenően, a PAI-1 potenciálisan részt vevő miR-30b-indukált apoptózis. Fenti megállapítások azt sugallják, miR-30b járhat, mint új tumor szuppresszor szabályozása által a apoptózis a rákos sejt a gyomorrák.

miR-30b egyike a miR-30 család, amely kapcsolatban van a fejlesztés számos fajta rák. Azonban a szerepe a miR-30b a tumorok ellentmondásos. miR-30b jelentették, hogy lefelé szabályozni prosztatarák [31], az invazív húgyhólyag tumor [32], anaplasticus pajzsmirigy rák [33], nyelőcsőrák [34], és a tüdőrák [35], míg a fokozott expressziójának miR 30b-ben azonosították medulloblastomában [36] és a rosszindulatú mesothelioma [37]. Ezen túlmenően, a miR-30b-t, mint az egyik független előrejelzője kiújulás-mentes túlélés májrák [38]. Mivel a miR-30b volt, vagy akár szabályozott, illetve csökkenteni a különböző rákos megbetegedések, tudtuk levonni, hogy a miR-30b játszhat különböző szerepeket, mint egy onkogén vagy tumor szupresszor gén különböző rákos. Katalógusa

A jelenlegi vizsgálat azt találtuk, hogy a miR-30b expressziós szignifikánsan csökkent a gyomorrák szövetekben és sejtvonalakban összehasonlítva normál gyomor szövetekben. Összhangban a megállapítás, miR-30b azt találtuk, hogy a lefelé által kifejezett mikro-RNS tömb 184 gyomor rákos megbetegedések és a 169 nem-tumor nyálkahártyák [39], és Qiao és munkatársai azt találták, hogy a miR-30b-t le-ben kifejezve gyomorrák szövetek és gyomor rákos sejtvonalak, AGS és BGC-823 sejteket [40]. Ezért, a veszteség a miR-30b expressziós összefüggésben lehet a patogenezisében és progressziójában gyomorrák.

Az apoptózis egy rendezett sejthalál folyamat, amely a fiziológiás és patológiás körülmények között. A zavar ez a kényes egyensúly vezethet a rák kialakulásában [27]. Most keveset tudunk a hatása, miR-30b on apoptózist rák. Az ellentmondásos kifejezése miR-30b sugallja bonyolítja a funkció a miR-30b. A közelmúltban, Li és munkatársai [41] megállapította, hogy a miR-30b szignifikánsan csökkent, válaszul a oxidatív stressz stimuláció, és miR-30b gátolhatja mitokondriális hasadás és az ebből következő apoptózis. Éppen ellenkezőleg, kimutatták, hogy a miR-30 képes gátolni az önmegújító és apoptózist indukál a emlőtumor-kezdeményező sejtek (BT-IC-k) által silencing Ubc9 és ITGB3 [42]. Fent bizonyítékok azt mutatják, hogy a miR-30 többfunkciós gén, mely gátolja vagy indukálja az apoptózist. A jelenlegi jelentés, azt találtuk, ektopikus expresszióját miR-30b képes indukálni az apoptózist gyomorrák sejtek in vitro, és overexpressziója miR-30b jelentősen gátolja a tumor növekedését csupasz egér xenograft modell által indukálva az apoptózis gyomorrák-sejtek in vivo. Fenti megállapítások azt sugallják, hogy a miR-30b játszhat a potenciális szerepe a gyomorrák fejlődés előmozdítása apoptózis rák. Katalógusa

Hogy vizsgálja meg a molekuláris mechanizmusa a miR-30b funkció, fontos azonosítani a megcélzott gén. Az utóbbi időben több új célpontjai miR-30b bebizonyosodott, beleértve a p53 [43], a Delta-szerű 4 [44], és Snail1 [45]. Tanulmányunkban a PAI-1was azonosított célgént miR-30b gyomorrákban. PAI-1 a fő inhibitor tPA és uPA, és a PAI-1 gátolja a plazminogén aktiválását. Azt jól dokumentált, hogy a kifejezés a PAI-1 magasabb a gyomorrák, mint a kontroll szövetekben, és a PAI-1 szolgálhat egy új prognosztikai faktor a gyomorrák, előre rövidebb túlélési [28], [46], [47 ]. Érdekes, A legújabb kutatások szerint a protumorigenic aktivitását a PAI-1 lehet keresztül antiapoptotikus funkcióval [22]. A tanulmány azt mutatta, hogy a miR-30b expressziós fordítottan korrelált a PAI-1 expresszió a gyomorrák sejtvonalakon és tumoros szövetekben, a PAI-1 túltermelése lehet ellensúlyozni a hatása, hogy elősegíti apoptózis miR-30b, és a méhen kívüli expressziója miR-30b hasonló volt előmozdítása-apoptózis hatással szemben hangtompító PAI-1 expresszióját. Ez azt sugallja, hogy a miR-30b-PAI-1 tengely is be lehet vonni a gyomorrák kialakulásával. Azonban a későbbi útvonal szükséges, tovább kell vizsgálni. Katalógusa

A gyomorrák kialakulásával jellemezhető többtényezős és többlépéses eljárás, és H. pylori
kimutatták, hogy a fő oka a gyomorrák. A legújabb jelentések a kutatási és más vizsgálatok rávilágítottak a szabályozó szerepét miRNS H. pylori fertőzés
és a kapcsolódó betegségek. miRNS potenciális híd H. pylori katalógusa fertőzés krónikus gyomorhurut és a gyomorrák [16], [48], [49]. Ami a miR-30b, lehet, hogy a többfunkciós H. pylori fertőzés katalógusa és H. pylori
-asszociált betegségek. A korábbi jelentés szerint a miR-30b volt képes szabályozni a autofágia folyamatának megcélozva ATG12 és BECN1 során H. pylori
fennállnak fertőzés [19].

• PLoS One: tumorba IL-17-pozitív hízósejtek a fő forrása az IL-17 Ez előrevetíti Survival gyomorrákban Patients
• PLoS One: Helicobacter pylori Elősegíti Epithelialis-mesenchymalis Átmenet a gyomorrák által mTOR gátlása miatt csökken a programozott sejthalál Protein 4 (PDCD4)