Plos ONE: Nikotin zavira Cisplatin-inducirane apoptoze preko urejanju α5-nAChR /AKT signalnega v Human želodca raka celic

Povzetek

incidenca raka želodca izkazuje močno etiološke povezave z kajenjem. Nikotin je glavna sestavina v tobaku, je agonist preživetje, ki zavira apoptozo nekaterih kemoterapevtikov inducirano, vendar natančnih mehanizmov, vpletenih še vedno v veliki meri neznan. V zadnjem času so raziskave so pokazali, da je α5-nikotinski receptor (α5-nAChR) zelo povezano s tveganjem pljučnega raka in nikotinske odvisnosti. Kljub temu pa je nobena informacija je na voljo o tem, ali nikotin vpliva tudi širjenje človeških želodčnih rakavih celic z regulacijo α5-nAChR. Za oceno hipotezo, da lahko α5-nAChR igrajo vlogo pri raku želodca, smo raziskovali njegovo izražanje v želodčnih tkiv rakom in celičnih linij. Izraz α5-nAChR povečala želodčnega tkiva raka v primerjavi s para-karcinomom tkiva. Glede na rezultate, smo izhajali, da razišče, ali nikotin zavira-cisplatin inducirano apoptozo preko urejanja α5-nAChR želodčnega rakave celice. Rezultati so pokazali, da je nikotin bistveno napredoval celične proliferacije v dozi in časovno odvisen način z aktiviranjem α5-nAChR v želodčnih celicah človeka. Nadalje, nikotin inhibira apoptozo inducirano s cisplatinom. Molk α5-nAChR ablacije zaščitnih učinkov nikotina. Vendar, ko so-upravljajo LY294002, inhibitor PI3K /AKT poti, so opazili povečano apoptozo. Ta učinek povezana z indukcijo Bcl-2, Bax, survivin in kaspaza-3, ki ga je nikotin v celičnih linijah želodca. Ti rezultati kažejo, da lahko izpostavljenost nikotin negativno vpliva na apoptotske potencial citostatikov in da α5-nAChR /AKT signalizacijo igra ključno vlogo pri anti-apoptotske aktivnosti nikotina cisplatin inducirane

Navedba. Jia Y , ned H Wu H, Zhang H, Zhang X Xiao D, et al. (2016) Nikotin zavira Cisplatin-inducirane apoptoze preko urejanju α5-nAChR /AKT signalnega v Human želodca rakavih celic. PLoS ONE 11 (2): e0149120. doi: 10,1371 /journal.pone.0149120

Urednik: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, UNITED STATES

Prejeto: Junij 1, 2015; Sprejeto: 15. januar, 2016; Objavljeno: 24. februar 2016

Copyright: © 2016 Jia et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

razpoložljivost podatkov. Zaradi omejitve, ki jih Jinan centralna bolnišnica, so na voljo na zahtevo podatkov. Zainteresirani raziskovalci lahko obrnete na dr Xiaoli Ma ([email protected]) zahteva dostop do podatkov

Financiranje:. To delo je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske (št 81272588) in province Shandong naravoslovja Foundation of China (št ZR2012HM061and ZR2013CM010)

konkurenčni interesi:. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden od glavnih vzrokov. smrti zaradi raka na svetu. Očitno sta genetski in okoljski dejavniki, vključenih v želodcu rakotvornost. Prejšnje ugotovitve so razkrili močno povezavo med cigaretnega dima in incidenco želodčnega raka [1-3], pa podrobni mehanizem ni bila v celoti raziskana.

Nikotin, ki je pomemben del cigaretnega dima, se je izkazalo, da vključeni v začetek, promocijo in celo napredovanje več tumorjev, vključno z rakom želodca. Precej podatkov kažejo, da nikotin doseže svoj celične funkcije skozi nikotinski receptor (nAChRs). Različne epitelijskih celic, ne samo nevronske celice, hitrih nAChRs in struktura nAChRs je homo- (α7or α9) ali heteropentamer (α2-α10; b2-b4). Študije so pokazale, da nikotin stimulira proliferacijo človeških želodčnih rakavih celic s svojo interakcijo s α7-nAChR [4, 5]. Medtem ko lahko različni člani nAChR družine urediti zbližujejo signalnih poti, imajo pogosto različne in celo nasprotujoče si ukrepe. V zadnjem času so genoma široko pridružitveni študije so pokazale, da je α5-nAChR zelo povezano s tveganjem pljučnega raka in nikotinske odvisnosti [6, 7]. Kljub temu pa je nobena informacija je na voljo o tem, ali nikotin vpliva tudi širjenje človeških želodčnih rakavih celic z regulacijo α5-nAChR.

Dostava kemoterapevtskim cisplatinom sredstva po kirurški odstranitvi trenutno definira standardno zdravljenje za rakom želodca [8 -10]. Na žalost, pridobljena odpornost s cisplatinom je pogosto in izogibanje celične apoptoze je priznan kot eden od glavnih mehanizmov, ki so odgovorni za odpornost cisplatin [11, 12]. Zlasti bi nikotin zavira apoptozo cisplatin inducira v pljučnim rakom celic [13-15] in ustnih raka [16]. Zaviralni učinek nikotina na apoptozo je pripisati njegovi sposobnosti za aktiviranje anti-apoptotične proteine ​​kot Bcl-2 in survivin, kakor tudi inaktivacije od proapoptotičnih proteinov, kot Bax in kaspaza-3, z aktiviranjem obeh PI3K /AKT in PKC /ERK signalne poti v rakavih celicah [13-15]. Ta učinek nikotina na celično apoptozo je tudi mediira nAChRs, ampak poleg α5-nAChR, izbranega druge podenote biti vključeni [17, 18].

Čeprav so bili mnogi od teh mehanizmov opazili v pljučnem raku [19-21], ni dokaza o anti-apoptotske smislu in mehanizem nikotin deluje na želodcu rakavih celic. Cilj raziskave je bil raziskati nikotin zavira apoptozo-cisplatin povzroča preko urejanja α5-nAChR želodčnega rakave celice. Poleg tega predlagamo vključevanje dejavnikov pro-preživetje, kot so Bcl-2 in survivin, jih aktivirajo Akt poti oz.

Materiali in metode

Etika Izjava

protokol študije je bil odobren s strani medicinsko etiko in človeške Trial odbora Jinan centralna bolnišnica Kliničnem. Pisna privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikih.

tkiv osebki, celične kulture in zdravljenje odvisnosti od drog

Petdeset-formalinom določen,-parafin vgrajeni vzorci vsebujejo 40 primerkov rakom želodca in 10 para-karcinomske tkiva so bile naknadno in naključno izbrana iz spisov Jinan centralne bolnišnici, potem ko je protokol odobril lokalni odbor raziskovalne etike. Glede na zapis kajenja (ali ne) v zgodovini primera bolnikov je bilo 32 primerov nima zgodovine dovod kajenje, 8 imel zgodovino dovod kajenje. Vsi vzorci so bili ocenjeni za diagnozo dveh izkušenih patologi za diagnozo.

človekovih želodca rakave celične linije MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27 in MKN45 so bili pridobljeni iz celic banke v Šanghaju, Inštitut za biokemijo in biologijo celice, kitajske akademije znanosti. Celice smo kultivirali v DMEM (Invitrogen), dopolnjenem z 10% fetalni goveji serum (FBS; Invitrogen), 1% antibiotiki pri 37 ° C v 5% CO2 navlažen zrak. V vseh poskusih smo sprali in inkubirali v mediju brez seruma 24 ur pred zdravljenjem z nikotina, cisplatinom in LY294002 (Sigma, St. Louis, MO) za navedeni čas 60-70% konfluentnih celic.

Imunohistokemija

Imunohistokemijsko z uporabo metode streptavidin peroksidaze (metoda SP) je bila izvedena na 4 um odsekih-parafinskih vgrajeni vzorcev za odkrivanje α5-nAChR izraz v želodcu raka in para-karcinomom tkiva. Na kratko, potem ko deparaffinization in hidratacije, so drsi obdelamo z endogenim peroksidazo na 0,3%, H _{2O 2 za 30 minut in blokirana 2 uri pri sobni temperaturi z 1,5% blokiranje seruma v fosfatno pufrani fiziološki raztopini (PBS ). Odseki smo nato inkubirali z anti-α5-nAChR protitelesa (Abcam, Inc. Cambridge, MA) (1: 100 razredčitev) pri 4 ° C preko noči, speremo s PBS in inkubiramo s sekundarnim anti-miš Biotinilirana protiteles (KIT-5010 Max Vision, Maixin.Bio, Kitajska) (1: 2000) v PBS 30 minut pri 37 ° C. Protitelo vezava je bila odkrita s pomočjo streptavidin-biotin-peroksidaze kompleks /HRP (Code K0377, Dako) s 3, 3 diaminobenzidine 3 minute kot kromogenega substrata. Drsniki smo nato rahlo jih nasprotno s hematoksilinom. Kot negativno kontrolo smo podvojene sekcije obarvali brez izpostavljanja primarnimi protitelesi. Rezultati so bili pod mikroskopom opazili.}

Kvantitativna Real-time RT-PCR

Total RNA smo izolirali z TRIzola reagenta (Invitrogen) v skladu z navodili proizvajalca. Petindvajset nanogram skupno RNA na vzorec smo reverzno prepisana s pomočjo Reaction Kit Povratne Transcription (Takara Code: DRR061S) v skladu z navodili proizvajalca. Kvantitativni PCR v realnem času smo izvedli analizirali na Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR sistem za določanje relativne količine α5-nAChR in beta-aktin (notranji nadzor) mRNA izražen. SYBR Green Supermix je bila uporabljena za vse v realnem času PCR reakcij. PCR, ki se uporabljajo v tej študiji, so naslednji: α5-nAChR Forward: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Reverse: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) naprej, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 'in obratno, 5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'. Kvantitativni parametri v realnem času PCR bila 95 ° C za 10s kot korak pred denaturira sledilo 40 PCR ciklov 95 ° C za 5 sekund, 60 ° C za 30 sekund in 72 ° C za 10 minut. Vsi vzorci so bili izvedeni v treh izvodih v vsakem poskusu. Relativna vrednost mRNA je bila izračunana z metodo primerjalne CT po normalizacija na beta-aktinske ravni mRNA.

Western blot analiza

Cell pelete smo homogenizirali v ekstrakcijskega pufra (50 mmol /L Tris-HCl pH 6,8, 0,1% SDS, 150 mol /L NaCI, 100 mg /L fenilmetilsulfonil fluorid, 1 mg /l aprotinina, 1% NP-40 in 0,5% natrijevega ortovanadata), inkubirali pri 4 ° C 30 minut in centrifugiramo 20 minut pri 12.000 g /min. Skupno beljakovin v celičnem lizatu smo merili z uporabo kolorimetričnega kompleta Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Za zahodni blot analizo, je bila skupna protein ločili na 10% SDS-PAGE in prenese na nitroceluloza membrane (0,45 um, Millipore, Billerica, MA, ZDA), ki smo inkubirali 24 ur pri 4 ° C s protitelesi za α5-nAChR (1: 500, ab41173 ali ab166718) AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Cat no: 2118-1), kaspazne-3 (1: 500, Epitomics Cat no: 1087-1), Bcl-2 (1: 500, Epitomics Cat no: 1017-1), survivin (1: 500, Epitomics Cat no: 2463-1) in GAPDH (1: 1000; ab37168) nato hrenovo peroksidazo konjugiranih anti-miš /zajca IgG protitelesa (santa Cruz Biotechnology) po zadnjem izpiranju. Signali so bile ugotovljene z uporabo okrepljenega kemiluminiscentnim komplet (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). Stopnja GAPDH je interni standard

RNA interference

Dvojna veriga siRNA oligonukleotid ciljanje CHRNA5, ki kodira α5-nAChR (občutek. 5'-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ', protismiselni: 5' -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ') sintetiziramo Shanghai Genepharma Co Ltd (Kitajska). Par negativnega kontrolnega siRNA je bil zasnovan tudi s sekvencami razlikujejo od siRNA-CHRNA5 in ni skladna s katerimkoli zaporedja najdemo v genske banke (smislu: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', protismiselni: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'). Celice smo nanesli v šestih vdolbinami. Ko celice dosegla 30-50% strnjene, so siRNAs dodamo do končne koncentracije 50 nM z Lipofectamine 2000 (Invitrogen) po navodilih proizvajalca.

bil mobilnega Viabilnost Vsebnost

Viabilnost celic določena z CCK8 testom (Dojindo, Tokio, Japonska). Na kratko, celice prevlečeni s 96-vdolbinami (1500 celic /jamico) smo obdelali z nikotinom na označenih odmerkih. Test širjenje Celica je bila izvedena z dodatkom raztopine 10 ul CCK8 v vsako vdolbino, čemur sledi inkubacija pri 37 ° C 2 h. Absorbanco smo merili pri valovni dolžini 450 nm z uporabo mikroploščnega bralec (Sinergija 2 Multi-Mode mikroplošči Reader, BioTek, WINOOSKI, VT, ZDA).

aneksin V /7-AAD obarvanje

BGC823 celice kultiviramo pri izliva v 6 vdolbinami tkivne kulture plošč (Falcon, Becton Dickinson LABWARE) v kompletnem mediju. Nato smo medij nadomestimo s svežim kompletnem mediju ali mediju brez seruma; Celice smo nato stimulirali s samim ali v kombinaciji z 20 mM cisplatinom 24 h na osnovi naših prejšnjih podatkih 100 uM nikotina, tripsinizirali in dvakrat speremo s PBS. Celice smo obarvali z PE označeni aneksinom V /7-AAD (7-aminoactinomycine-D) v skladu z navodili proizvajalca (aneksin V /7-AAD kit; Becton, Dickinson and Company). Na kratko je bila sprana celica pelete ponovno suspendirali v 500 ul vezavnem pufru. Naslednji dodamo 5 ul aneksin-V-PE in 5μl 7-AAD. Analiza toka citometrična je bila izvedena takoj po supravital obarvanjem. Zbiranje podatkov in analize so bile izvedene v toku Becton Dickinson FACSCalibur citometrom uporabo programa Cellquest. Celice v zgodnjih fazah apoptoze so AnnexinV pozitiven in 7-AAD negativna, medtem ko so bile celice v poznih fazah apoptoze tako AnnexinV in 7-AAD pozitiven.

Hoechst 33342 obarvanje

Cells smo zasejali v 12 vdolbinami tkivne kulture ploščah in obdelamo z označenimi koncentracijami nikotina in cisplatina. Na koncu vsakega inkubacije, so bile celice pritrjen s 4% paraformaldehida v 20 minutah speremo s PBS in nato inkubiramo z Hoechst 33342 (1 mg /ml) 10 minut. Po spiranju s PBS, so opazili celice s pomočjo fluorescentne mikroskopom (Olympus, Japonska). Vsaj 400 celic iz 12 naključno izbranih področjih na krožnik so bili prešteti, in vsaka obravnava je bila izvedena v treh izvodih.

Statistika analiza

Rezultat imunohistokemijo smo analizirali z uporabo χ ^{2 Test. Vsi rezultati so bili predstavljeni kot sredstvo ± SD od trojnih poskusov izvedemo vzporedno, če ni navedeno drugače. Pomen razlike med kontrolnimi skupinami in nikotina zdravljenih skupinah je bila določena z dvo-tailed Studentovim t-testom. Razlike so bile upoštevane pomembno pri P < 0,05 ali P < 0.01.}

Rezultati

α5-nAChR izrazi v želodcu osebkov raka tkivnih in celičnih linij

so odkrili in lokalizirana in-parafin vgrajeni človeške želodčne tkiva Izraz α5-nAChR sekcije. α5-nAChR je predvsem lokalizirana na membrani tumorskih celic, čeprav je bilo opaziti tudi nekaj citoplazmo obarvanje (slika 1A). Izražanje α5-nAChR je bila višja v želodčnih tkiva raka (77,5%, 31/40), kot da je v para-karcinomom tkiva (20%, 2/10). Rezultati so pokazali trend, da je pozitivna stopnja α5-nAChR izražanja povečana pri bolnikih z anamnezo sesalni nikotina (87,5%, 08/07) v primerjavi z bolniki brez nikotina zgodovine dovoda zraka (75,0%, 24/32).

α5-nAChR mRNA in proteina bilo mogoče zaznati v senatu želodčnega raka celičnih linij. Celične linije izražene različne stopnje α5-nAChR proteina, kjer so celične linije z višjo izražanja BGC823, AGS in SGC7901 normalizirano tisti GAPDH (slika 1B). Ravni α5-nAChR mRNA izraza z RT-PCR odkrite povezana s stopnjami beljakovin izražanja (slika 1C). BGC823 izraža višjo stopnjo α5-nAChR od drugih celičnih linij. Za nadaljnje funkcionalne eksperimentov, je celična linija BGC823 izbran zaradi svoje višje izražanje (primerno za indukcijo ga nikotina ali utišanje ga siRNA).

Nikotin spodbuja proliferacijo želodčni rak celic skozi α5-nAChR

ugotoviti, ali lahko nikotin uravnavajo proliferacijo želodčnih celic, smo preučili vpliv nikotina z različnimi koncentracijami o sposobnosti preživetja celic v BGC823 z analizo CCK8 (slika 2A). BGC823 bili izpostavljeni nikotina (0, 1, 10, 100, 500, 1000 iM) 24, 48 in 72h, zaporedju. Kot je prikazano na sliki 2A, nikotin spodbuja proliferacijo celic v časovno odvisne in koncentracijsko odvisni zvezi s. Nikotin znatno stimulira proliferacijo celic pri nižji koncentraciji (1, 10, 100, 500 uM) in čas (24-72 h), vendar je opazen padec števila celic smo opazili, nikotina obdelamo kulture pri višjih koncentracijah (1000 uM) in čas (72 h). Študije so pokazale stopnje nikotina v telesu med posamezniki močno razlikujejo četudi kajenje enako število identičnih cigaret [22-24] Odprta koncentracija nikotina (100 uM), uporabljene v tej študiji posnemal dnevni vnos cigaret v zmernih kadilcev [ ,,,0],25, 26]. Koncentracija nikotina (100 uM) je enaka koncentraciji v slini pri kadilcu, ki sesalni 25 cigaret /dan [27]. Za nadaljnje funkcionalne eksperimentov je bila izbrana koncentracija nikotina (100 uM) za zdravljenje želodčnih celic za 24 h.

Da bi ugotovili, ali je nikotina posredovano pospeševanje proliferacije celic v želodčnih celicah posredovana preko α5-nAChR signalizacijo smo analizirali vpliv nikotina na izražanje α5-nAChR beljakovin v BGC823 celic z Western blot. Kot je prikazano na sliki 2B, zdravljenje nikotina v dozi nikotina (0, 1, 10, 100, 500, 1000 iM) za 24 ur spodbuja ekspresijo α5-nAChR proteina na način, odvisen od doze. Da bi še dodatno potrditev udeležbe α5-nAChR signalnih poti v-nikotina posredovana spodbujanje širjenja želodčnega raka celic, smo blokirali α5-nAChR beljakovin izraz s transfekcijo BC823 celic z α5-nAChR specifične siRNA (si-α5-nAChR) ( slika 2C) in ocenili njegove učinke na nikotina posredovana spodbujanja proliferacije celic s CCK testom (slika 2D). V primerjavi z umešana nespecifične nadzora siRNA (si-NC), transfekciji s SI-α5-nAChR proliferacije zaviral celic. Poleg tega si-α5-nAChR transfekciji bistveno zmanjšala, nikotina posredovano spodbujanje celične proliferacije v BGC823 celic (slika 2D).

Nikotin zaviranje-cisplatinom inducirane apoptoze

Za nadaljnjo opredelitev apoptozo učinki nikotina v kombinaciji s cisplatinom na BGC823 je cisplatin uporabljena za induciranje apoptoze v BGC823 celicah. Celice smo obdelali z 20 mM cisplatinom [28]. Kot je prikazano na sliki 3A, postal apoptoze celice zaobljeni in njihova jedra razstavljena razdrobljen morfologijo, ki tvorijo apoptotične telesa. V nasprotju s tem, celice sočasno zdravijo z nikotinom in cisplatina pokazala malo jedrsko razdrobljenosti in nekaj apoptotične telesa.

Cisplatin inducirane apoptoze je dodatno analizirali s AnnexinV /7-AAD barvanjem. Citometrija parcele je pokazala, da se je delež skupnih apoptotskih celic (AnnexinV + /7-AAD-) se je zmanjšalo from43.2 ± 2.32% to29.9 ± 1,26%, kadar je izpostavljen cisplatinom v kombinaciji s 100 LM nikotina (slika 3B). Ti rezultati kažejo, da lahko nikotin zavirajo apoptozo cisplatin povzročeno.

α5-nAChR /AKT signalizacijo pot vključeni v anti- apoptotska učinki nikotina v-cisplatinom inducirane apoptoze od BGC823 celice

Za določitev vloga AKT pri posredovanju učinke nikotina v teh celicah, smo ugotovili, ali nikotin povzroči aktiviranje AKT v BGC823 celicah. Na sliki 4A, 20 mM cisplatina odločno zatreti aktivnostjo AKT (proga 2), vendar nikotin povečana Akt ekspresijo (pasu 3) v prisotnosti cisplatina. Predlagala je, da je bil AKT aktivira po izpostavitvi 100 uM nikotina v BGC823 celic, kot je navedeno v različnih dokumentih [29, 30]. Navzdol-ureditev α5-nAChR izražanja zmanjšala P-AKT izraz (proga 4). Zdravljenje z 10 mM LY294002, s fosfatidilinozitol 3-kinazo (PI3K) /AKT pot zaviralca, zmanjšano za preprečevanje apoptotične učinke nikotina v BGC823 celicah (linija 5). Poleg tega je zdravljenje z LY294002 kombinaciji z SI-CHRNA5 transfekciji močno potlačeno nikotina oblikovane višine p-AKT proteina (linija 6). Ti podatki kažejo, da α5-nAChR /AKT poti igrajo ključno vlogo pri posredovanju učinke nikotina in kemoterapije v želodčnih rakavih celic.

smo podrobneje proučiti učinke nikotina na-cisplatinom povzroča aktivacije kaspaze-3 v BGC823 celice z Western blot testom. Kot je prikazano na sliki 4B, cisplatina povzroča povečanje aktivacije kaspaze-3, medtem ko je nikotin blokiranih cisplatin povzroča aktivacija kaspaze-3 v BGC823 celicah. Poleg tega je izpostavljenost BGC823 celic cisplatinom povzročila ekspresijo apoptotske proteina Bax povečano medtem ko prosurvival protein Bcl-2 in survivin zmanjšala, ki so bili inhibira z obdelavo z nikotinom.

Medtem, kot je prikazano na sliki 4C je anti-apoptotično učinek nikotina je očitno blokiral SI-α5-nAChR v BGC823 celicah. Citometrija parcel je pokazala, da je delež skupnih apoptotskih celic (AnnexinV + /7-AAD-) povečala s 18,5 ± 0,92% na 34,9 ± 1,74%, potem si-5 zdravljenja v primerjavi s skupino si-NC. Dodajanje zaviralcev AKT LY294002 s si-α5-nAChR močno spodbuja apoptotske učinek cisplatina od 31,5 ± 1,57% na 61,2 ± 3,06%, v primerjavi s skupino LY294002. Ti rezultati kažejo, da ima nikotin pomembno vlogo pri preprečevanju-cisplatinom inducirane apoptoze preko α5-nAChR /AKT signalne poti.

Pogovor

Ta študija je prva dokazati ključno vlogo α5-nAChR v nikotina anti-apoptoza cisplatina v človeških želodca rakavih celic. Analiza kliničnih vzorcih pokazale, da je α5-nAChR izraz na splošno višja v tumorskih celicah v primerjavi s para-celic karcinoma. Rezultati so pokazali trend, ki je bila pozitivna stopnja α5-nAChR izražanja višja pri bolnikih z nikotinom zgodovino sesalni kot bolniki brez nikotina zgodovini polnilnega. In vitro Rezultati so pokazali, da nikotin navzgor regulirano ekspresijo α5-nAChR proteina in blokiranem-cisplatinom inducirane apoptoze z uravnavanjem α5-nAChR /Akt signalnih poti v želodčnih rakavih celic. Nikotin preprečiti-cisplatin povzroča aktivacija kaspaze-3 in Bax, in navzgor regulirano ekspresijo anti-apoptotičnimi proteini, Bcl-2 in survivin. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da aktiviranje AKT da igrajo vlogo pri posredovanju-cisplatin inducirano apoptozo, kakor tudi proti apoptotične učinke nikotina v BGC823 celicah. Morda je zanimivo, da bodite pozorni na razmerje med cigaretni dim (drugi kajenja) in incidenco raka želodca.

Prejšnje ugotovitve so razkrili močno povezavo med cigaretnim dimom in rakom želodca [31, 32]. Nikotin je dokazano, da poveča proliferacijo in migracijo želodčnih rakavih celic z indukcijo cyclooxgenase-2 (COX-2), prostaglandin E2, VEGF, beta-adrenergičnih receptorjev, protein kinaza C [26, 33, 34]. pojavijo ti učinki, ki se posredujejo preko homopentameric α7-nAChRs [35]. Vendar pa so nedavne študije pokazale, nepričakovan učinek heteropentameric α5-nAChRs glede vnosa nikotina v telo [36-38]. Naša prejšnja dela, je poročala, da je nikotin /α5-nAChR pot bistvena za pljučni rak celic preživetja [21, 39]. Kljub temu pa je nobena informacija je na voljo o tem, ali nikotin vpliva tudi širjenje človeških želodčnih rakavih celic z regulacijo α5-nAChR. Tukaj smo raziskovali vlogo α5-nAChR pri raku človeške želodčne. Naši rezultati pokazali, da je bila ekspresija α5-nAChR višja v želodčnih tkivih rakom v primerjavi s para-karcinom tkiva, ki nakazujejo, da je lahko α5-nAChR igrajo vlogo v želodcu karcinogenezo. Poleg tega, nikotin spodbuja izražanje α5-nAChR beljakovin in blokira aktivacijo α5-nAChR s siRNA oslabljen-nikotina povzroča želodčne širjenje rakavih celic. Predlagala je, da je α5-nAChR eden od glavnih molekul, da posredujejo proliferacije celic, ki jih nikotina v želodcu rakavih celic stimulirati.

trenutni standard kemoterapijo raka želodca cisplatin, vendar je stopnja uspešnosti tega zdravljenja je slaba. Učinkovitost cisplatinom je odvisna od zmožnosti za povzročanje poškodb DNA [40, 41]. Torej, kako se rakave celice odzivajo na cisplatina inducirano apoptozo igra ključno vlogo pri občutljivosti cisplatina. Nedavna poročila kažejo, da nikotin zavira cisplatin inducirano apoptozo v pljučnim rakom celic, raka ustne votline, Raw264.7 in EL4 celice [13, 16, 18], ki bi lahko kazale, da nikotin ima sposobnost, ne samo za spodbujanje razvoja raka z aktiviranjem poti rasti celic , ampak tudi za zmanjšanje učinkovitosti kemoterapevtikov s spodbujanjem poti preživetja. V soglasju s predhodnimi ugotovitvami, rezultati te študije so pokazali, da so opazili sočasno obdelava celic s cisplatinom in nikotin, značilni aktivacija kaspaze-3, kar kaže, da je nikotin je sposoben določiti inhibicijo apoptoze potenciala cisplatin z rakom želodca.

signalne poti, ki uravnavajo celične procese, vključno s celično proliferacijo, napredovanju celičnega ciklusa in celične apoptoze, imajo pomemben vpliv na odločanje celični odziv na cisplatinom. Predhodne študije so pokazale, da se aktiviranje AKT poti vodijo k odpornosti proti cisplatin [42, 43]. Prekomerno ekspresijo serinske fosforilirajo AKT bila zaznana v številnih človeških raka, vključno z rakom želodca [44, 45]. Kot je navedeno v različnih dokumentih, nikotin z vezavo na nAChR vodi k nižji stopnji aktivacije tumorskih spodbujanje proteinov, vključno z aktiviranjem poti AKT [46-48]. Izpostavljenost nikotina lahko negativno vplivajo na apoptoze potencial cisplatinom pri človeških ustnih rakavih celic in AKT pot je bila potrebna za delovanje nikotina [16]. Vendar pa je bilo AKT pot nikotinske tokom signalizacije in anti-apoptotskih učinki nikotina v želodcu rakavih celic ni znan. Zato smo raziskovali ali lahko P-AKT predstavljajo antagonizira učinek nikotina na citotoksičnosti cisplatina. Ugotovili smo, da-co obdelan z siRNA-α5-nAChR in LY294002, zaviralca poti, v PI3K /AKT, povečano apoptozo-cisplatin inducirane in oslabljen učinke nikotina v BGC823 celicah. Več študij poudaril nikotina aktivira Akt signalne poti v moduliranje celično proliferacijo in preživetje po aktiviranju prosurvival proteina Bcl-2 in survivin [15, 49, 50]. Naša raziskava je pokazala tudi, da vlogo nikotina na celične apoptoze pa cisplatin z α5-nAChR /AKT inducirane potrjuje indukcijo survivin in Bcl-2, kot končni efektor o poti zgoraj.

Če povzamemo, smo dokazali da nikotin aktivira α5-nAChR /AKT signalizacijo in je vključen v odpornosti cisplatinom za zdravljenje raka želodca. Te ugotovitve nove vpogled v možne molekularnih mehanizmov nikotina zaviranja-cisplatinom inducirane apoptoze v človeške želodčne rakavih celic (slika 5). Nikotin prisotne v cigaretnem dimu lahko vpliva na raka želodca farmakološko zdravljenje z zaviranjem kemoterapevtsko apoptozo zaradi drog. Strategije za razumevanje signalizacijo, nikotina posredovano lahko olajša razvoj izboljšanih terapij pri raku želodca.

Podpora Informacije
S1 Sl. Izražanje α5-nAChR in α7-nAChR brez ali z α5-siRNA zdravljenje
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s001
(IOD)
S2 Sl. Dol-ureditev α5-nAChR izražanja znižala raven P-AKT
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s002
(IOD)
S3 Sl. Izražanje α5-nAChR v BGC823 celic z ali brez zdravljenja si-α5-nAChR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s003
(IOD)
S4 Sl. Nikotin napredoval BGC823 proliferacije celic skozi α5-nAChR in α7-nAChR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s004
(IOD)
S5 Sl. Nikotin napredoval SGC7901 proliferacije celic skozi α5-nAChR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s005
(IOD)
S6 Sl. Nikotin zaviranje-cisplatinom inducirano apoptozo SCG7901
doi:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s006
(TIF)

• Plos ONE: A limfnih vozlov Uprizoritev Sistem želodca raku: hibridni Tip podlagi topografskih in numerično Systems
• Plos ONE: N-Terminal polipeptid aneksina A2 Zmanjša Okužba Mycoplasma hyorhinis do želodca raka celice