PLoS ONE: Никотин Угнетает Цисплатин-индуцированному апоптозу с помощью регулирования а5-Nachr /Akt сигнализации в клетках человека рак желудка

Абстрактный
<р> Желудочный заболеваемости раком демонстрирует сильную этиологической ассоциации с курением. Никотин, основным компонентом в табаке, является агонистом выживания, который ингибирует апоптоз, индуцированный некоторых химиотерапевтических агентов, но точные механизмы, участвующие в основном остаются неизвестными. В последнее время исследования показали, что α5-никотинового рецептора ацетилхолина (α5-нАХР) сильно связан с риском развития рака легких и никотиновой зависимости. Тем не менее, никакая информация не была доступна также о том, влияет ли никотин пролиферацию клеток рака желудка человека посредством регуляции а5-нАХР. Для того, чтобы оценить гипотезу о том, что α5-нАХР может играть роль в развитии рака желудка, мы исследовали его экспрессию в желудочном раковых тканей и клеточных линий. Выражение а5-нАХР увеличилась в желудочном ткани рака по сравнению с тканями пара-карциномы. С учетом результатов, мы продолжили исследовать, ингибирует ли никотин цисплатин-индуцированного апоптоза через регулирующий а5-Nachr в желудочном раковой клетки. Результаты показали, что никотин значительно повышен пролиферацию клеток в дозе и зависимым от времени образом посредством активации α5-нАХР в клетках желудка человека. Кроме того, никотин ингибирует апоптоз, индуцированный цисплатином. Молчание а5-нАХР абляции защитные эффекты никотина. Однако, когда совместно администрировать LY294002, ингибитор PI3K /AKT пути, наблюдалось увеличение апоптоза. Этот эффект коррелирует с индукцией Bcl-2, Bax, сурвивина и каспазы-3 никотином в желудочном клеточных линиях. Эти результаты свидетельствуют о том, что воздействие никотина может отрицательно сказаться на апоптический потенциал химиотерапевтических препаратов и что передача сигналов α5-нАХР /AKT играет ключевую роль в антиапоптической активности никотина, вызванной цисплатином
<р> Образец цитирования:. Цзя Y , вс H, Wu H, Чжан H, Чжан X, Сяо D и др. (2016 г.) никотином приводит к подавлению Цисплатин-индуцированному апоптозу с помощью регулирования а5-Nachr /Akt сигнализации в клетках человека рак желудка. PLoS ONE 11 (2): e0149120. DOI: 10.1371 /journal.pone.0149120
<р> Редактор: Сальваторе В. Пиццо, Duke University Medical Center, США
<р> Поступило: 1 июня 2015 года; Принято: 15 января 2016 г. Опубликовано: 24 февраля 2016
<р> Copyright: © 2016 Цзя и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Доступность данных:. Благодаря ограничения, налагаемые центральной больницы Цзинань, данные могут быть предоставлены по запросу. Заинтересованные исследователи могут связаться с Dr. Xiaoli Ма ([email protected]), чтобы запросить доступ к данным
<р> Финансирование:. Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (№ 81272588) и провинции Шаньдун естественных наук Основание Китая (№ ZR2012HM061and ZR2013CM010)
<р> конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одной из основных причин. случаев смерти от рака в мире. По-видимому, как генетические и экологические факторы участвуют в желудочном канцерогенезе. Предыдущие выводы разгадали сильную связь между сигаретным дымом и желудочных заболеваний раком [1-3], однако детальный механизм не был полностью изучен.
<Р> Никотин, одним из основных компонентов сигаретного дыма, было показано, принимать участие в инициации, продвижения по службе и даже прогрессии нескольких опухолей, включая рак желудка. Несколько линий доказательств указывают на то, что никотин оказывает свои клеточные функции через никотиновые рецепторы ацетилхолина (nAChRs). Различные эпителиальные клетки, а не только нейронные клетки, экспрессируют nAChRs и структура nAChRs является гомо- (α7or α9) или heteropentamer (α2-α10; b2-b4). Исследования показали, что никотин стимулирует пролиферацию клеток рака желудка человека путем его взаимодействия с А7-нАХР [4, 5]. В то время как различные члены семьи нАХР могут регулировать сходящихся сигнальные пути, они часто имеют различные и даже противоположные действия. В последнее время генома широкие исследования ассоциаций показали, что α5-нАХР сильно связан с риском развития рака легких и никотиновой зависимости [6, 7]. Тем не менее, никакая информация не была доступна также о том, влияет ли никотин пролиферацию клеток рака желудка человека посредством регуляции а5-нАХР.
<Р> Поставка химиотерапевтического цисплатин агента после хирургической резекции в настоящее время определяет стандартное лечение по поводу рака желудка [8 -10]. К сожалению, приобрели устойчивость к цисплатин является общим и уклонение от апоптоза клеток признается в качестве одного из основных механизмов, ответственных за сопротивление цисплатин [11, 12]. В частности, никотин может ингибировать апоптоз, вызванный цисплатином в раковых клетках легких [13-15] и рака ротовой полости [16]. Ингибирующее действие никотина на апоптоз было обусловлено его способностью активировать анти-апоптотических белков, как Bcl-2 и сурвивина, а также инактивация проапоптических белков, таких как Bax и каспазы-3, с помощью активации и PI3K /Akt и PKC /ERK сигнальных путей в раковых клетках [13-15]. Этот эффект никотина на апоптоза клеток также опосредовано nAChRs, но в дополнение к а5-нАХР, другие субъединиц-видимому, участвуют [17, 18].
<Р> Несмотря на то, что многие из этих механизмов, наблюдались при раке легкого [19-21], нет никаких доказательств антиапоптической эффекта и механизм, оказываемое никотином на клеток рака желудка. Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы исследовать никотин ингибирует цисплатин-индуцированного апоптоза через регулирующий а5-Nachr в клетку рака желудка. Кроме того, мы предлагаем участие факторов про-выживания, таких как Bcl-2 и сурвивина, активированных AKT путей, соответственно.

Материалы и методы

Этика Заявление
<р> протокол исследования был одобрен медицинской этики и человеческого клинического испытания комитета Центральной больницы Цзинань. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов.

Образцы тканей, культуры клеток и медикаментозное лечение
<р> Пятьдесят фиксированных формалином, парафином образцы, содержащие 40 образцов рака желудка и 10 тканей пара-карциномы были ретроспективно и случайным образом выбираются из файлов центральной больницы Цзинань после того, как протокол был одобрен местным комитетом по этике. Согласно протоколу курения (или нет) в истории болезни пациентов, 32 случая не было истории всасываемого курить, 8 имели историю всасываемого курить. Все образцы были оценены для диагностики двух опытных патологоанатомов для установления диагноза.
<Р> Желудочные клеточные линии рака человека MKN28, SGC7901, BGC823, MGC803, AGS, HGC27 и MKN45 были получены из банка клеток Шанхая, Институт биохимии и клеточной биологии китайской академии наук. Клетки культивировали в среде DMEM (Invitrogen) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Invitrogen), 1% антибиотиков при 37 ° С в 5% СО2 увлажненного воздуха. Во всех экспериментах, на 60-70% из сливных клетки промывали и инкубировали в бессывороточной среде в течение 24 часов до начала лечения с никотином, цисплатин и LY294002 (Sigma, St. Louis, МО) в течение указанного времени.

Immunohistochemistry
<р> Иммуногистохимическое окрашивание с использованием метода стрептавидин пероксидазы (метод SP) проводили на 4 мкм секций залитых парафином образцов для обнаружения а5-нАХР выражение в рака желудка и пара-карциномы тканей. Короче говоря, после депарафинизации и гидратации, срезы обрабатывали эндогенной пероксидазы в 0,3% Н <к югу> 2O <суб> 2 в течение 30 минут и блокировали в течение 2 ч при комнатной температуре с 1,5% блокирующего сыворотки в фосфатном буферном растворе (PBS ). Затем срезы инкубировали с анти-α5-нАХР антителом (Abcam, Inc., Cambridge, MA) (разведение 1: 100) при 4 ° С в течение ночи, промывали PBS, и инкубировали с вторичным анти-мышиного антитела (биотинилированный KIT-5010 , Макс зрение, Maixin.Bio, Китай) (1: 2000) в PBS в течение 30 мин при 37 ° с. Связывание антитела детектировали с использованием стрептавидин-биотин-пероксидаза комплекс /HRP (код K0377; Dako) с 3, 3-диаминобензидина в течение 3 мин в качестве хромогенного субстрата. Срезы затем слегка контрастному окрашиванию гематоксилином. В качестве отрицательного контроля, дублированные Срезы окрашивали без контакта с первичными антителами. Результаты наблюдали под микроскопом.

Количественные в режиме реального времени RT-PCR
<р> Общую РНК выделяли с использованием реагента тризола (Invitrogen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Двадцать пять нанограмм общей РНК на образец подвергали обратной транскрипции с использованием реакции обратной транскрипции Kit (Takara Код: DRR061S) в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественная ПЦР в реальном времени проводили анализировался на Applied Biosystems 7300 ПЦР в реальном времени системы для определения относительных количеств а5-нАХР и бета-актина (внутренний контроль) мРНК экспрессируется. SYBR Green Supermix использовался для всех ПЦР в реальном времени реакции. ПЦР-праймеры, используемые в данном исследовании, являются следующие: α5-нАХР Вперед: GAAACTGAGAGTGGTAGTGGACCAA, Реверс: GGGCTATGAATTTCC AATCTTCAAC; глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) вперед, 5'-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 'и обратный, 5'-AGTCCTTCCACG ATACCAAAGT-3'. Количественные в режиме реального времени параметров ПЦР были 95 ° С в течение 10 секунд, как на стадии предварительной денатурации с последующими 40 циклов ПЦР при 95 ° С в течение 5 сек, 60 ° С в течение 30 с и 72 ° С в течение 10 мин. Все образцы были выполнены в трех повторах в каждом эксперименте. Относительное количество мРНК была рассчитана с использованием сравнительного метода КТ после нормализации к бета-актина уровни мРНК.

Вестерн-блоттинга
<р> Клеточные гранулы гомогенизируют в буфере для экстракции (50 ммоль /л Трис-HCl, , рН 6,8, 0,1% SDS, 150 мкмоль /л NaCl, 100 мг /л фенилметилсульфонилфторида, 1 мг /л апротинина, 1% NP-40 и 0,5% ортованадата натрия), инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин и центрифугировали в течение 20 мин при 12000 г /мин. Общее содержание белка в лизате клеток измеряли с использованием колориметрического набора Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Для вестерн-блот-анализа, общего белка разделяли на 10% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозные мембраны (0,45 мкм, Millipore, Биллерика, Массачусетс, США), которые инкубировали в течение 24 ч при 4 ° С с антителами к а5-нАХР (1: 500, ab41173 или ab166718), AKT (1: 500, Epitomics Cat №: 1085-1), P-AKT (1: 500, Epitomics Cat №: 2118-1), каспазы-3 (1: 500, Epitomics Cat №: 1087-1), Bcl-2 (1: 500, Epitomics Cat №: 1017-1), Survivin (1: 500, Epitomics Cat №: 2463-1) и GAPDH (1: 1000; ab37168), затем конъюгированного с пероксидазой хрена анти-мыши /кролика IgG-антитела (Santa Cruz Biotechnology) после окончательной промывки. Сигналы были обнаружены с использованием расширенного набора хемилюминесценции (Amersham Pharmacia, Buckinghamshire, UK). Уровень GAPDH был внутренний стандарт

РНК-интерференции
<р> Двойная цепь миРНК олигонуклеотид ориентации CHRNA5, который кодирует а5-Nachr, (смысл: 5'-CCCGCAAACUACAAAAGUUTT-3 ', антисмысловая: 5'. -AACUUUUCUAGUUUGCCGGTG-3 ') синтезировали Shanghai Genepharma Co. Ltd. (Китай). Пара отрицательного контроля миРНК был также разработан с последовательностями, отличными от миРНК-CHRNA5 и не гомологичны любых последовательностей, обнаруженных в банка генов (смысле: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ', антисмысловой: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGA-3'). Клетки высевали в шесть-луночных планшетах. Когда клетки достигали 30-50% сплошности, что миРНК были добавлены до конечной концентрации 50 нМ с Липофектамином 2000 (Invitrogen) в соответствии с инструкцией изготовителя.

Жизнеспособность клеток Анализ
<р> жизнеспособность клеток определяется CCK8 анализа (Dojindo, Токио, Япония). В кратком изложении, клетки высевали в 96-луночные планшеты (1500 клеток /лунку) обрабатывали никотином в указанных дозах. Анализ пролиферации клеток осуществляли путем добавления 10 мкл раствора CCK8 в каждую лунку с последующим инкубированием при 37 ° С в течение 2 ч. Измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм с использованием микропланшет-ридера (Synergy 2 Multi-Mode микропланшетов чтения; Биотек, Winooski, VT, США).

аннексина V /7-AAD окрашивание
<р> BGC823 клетки культивировали при слиянии в 6-луночные планшеты для культивирования тканей (Falcon, Becton Dickinson Labware) в полной среде. Затем среду заменяли свежей полной средой или с помощью свободной от сыворотки среде; клетки затем стимулировали с помощью монотерапии или в комбинации с цисплатином 20 мМ в течение 24 ч на основе предыдущих данных 100 мкМ никотина, обрабатывали трипсином и промывали дважды PBS. Клетки окрашивали PE меченого аннексина V /7-AAD (7-aminoactinomycine-D) в соответствии с инструкциями изготовителя (аннексина V /7-AAD комплект; Becton, Dickinson и Компания). Кратко, промывают осадок клеток ресуспендировали в 500 мкл буфера для связывания. Затем добавляли 5 мкл аннексина-V-РЕ и 5 мкл 7-АСР. Анализ проточной цитометрии проводили сразу после прижизненной окраски. сбор и анализ данных проводили в потоке Becton Dickinson FACSCalibur цитометрии с использованием программного обеспечения CellQuest. Клетки на ранних стадиях апоптоза были AnnexinV положительными и 7-AAD отрицательным, в то время как клетки на поздних стадиях апоптоза были как AnnexinV и 7-AAD положительный.

Hoechst 33342 окрашивание

Клетки были посеяны в 12-луночные планшеты для тканевых культур и обрабатывали указанными концентрациями никотина и цисплатина. В конце каждой инкубации клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 мин, промывали PBS, а затем инкубировали с помощью Hoechst 33342 (1 мкг /мл) в течение 10 мин. После промывания PBS, наблюдались клетки с помощью флуоресцентного микроскопа (Olympus, Япония). По крайней мере, 400 клеток из 12 случайно выбранных полей на чашку были подсчитаны, и каждая обработка была выполнена в трех экземплярах.

Анализ статистики
<р> Результат иммуногистохимии анализировали с помощью χ 2 контрольная работа. Все были представлены результаты, как средние значения ± S.D. из трех повторных экспериментов проводили параллельным образом, если не указано иное. Значимость различий между контрольными группами и никотином группами лечения определяли с помощью Т-тест был на два Стьюдента. Различия считались достоверными при P < 0,05 или Р &л; 0.01.

Результаты

а5-нАХР выражения в желудочных образцах ткани рака и клеточных линий
<р> Выражение а5-нАХР были обнаружены и локализованы в парафин ткани человека желудка разделов. α5-нАХР в основном локализованы на мембране опухолевых клеток, хотя некоторые цитоплазма окрашивание также наблюдалось (Фиг.1А). Выражение а5-нАХР была выше в желудочных раковых тканей (77,5%, 31/40), чем в тканях пара-карциномы (20%, 2/10). Результаты показали, что тенденция положительная скорость а5-Nachr экспрессии повышен у пациентов с историей всасывания никотина (87,5%, 7/8) по сравнению с пациентами без никотина истории потребления (75,0%, 24/32).
<Р> α5-нАХР мРНК и белка были обнаружены в панели желудочных линий раковых клеток. Линии клеток выражали различные уровни α5-нАХР белка, где клеточные линии с более высокой экспрессии были BGC823, АГС и SGC7901 нормированную к тому, что из GAPDH (рис 1B). Уровни экспрессии α5-нАХР мРНК, обнаруженные с помощью ОТ-ПЦР коррелирует с уровнем экспрессии белка (рис 1C). BGC823 выражает более высокие уровни а5-нАХР, чем у других клеточных линий. Для получения дополнительных функциональных экспериментов, клеточная линия BGC823 была выбрана из-за его более высокой экспрессии (подходит для индукции никотина или глушителей по миРНК).

Никотин способствует пролиферации раковых клеток желудка через α5-нАХР
<р> Для определить, может ли никотин регулирует пролиферацию клеток желудка, мы исследовали влияние никотина с различными концентрациями на жизнеспособность клеток в BGC823 с помощью анализа CCK8 (рис 2А). BGC823 подвергались воздействию никотина (0, 1, 10, 100, 500, 1000 мкМ) в течение 24, 48 и 72 ч, соответственно. Как показано на фиг.2А, никотин способствует пролиферации клеток в зависимой от времени и зависимости от концентрации отношения. Никотин значительно стимулировали пролиферацию клеток при более низкой концентрации (1, 10, 100, 500 мкМ) и времени (24-72 ч), но заметное уменьшение количества клеток наблюдалась в никотине обработанных культурах при более высокой концентрации (1000 мкМ) и во времени (72 ч). Исследования показали уровни никотина в организме широко изменяются среди людей даже при курении такое же количество одинаковых сигарет [22-24] .The концентрация никотина (100 мкМ), используемого в настоящем исследовании, имитировали ежедневное потребление сигарет в умеренных курильщиков [ ,,,0],25, 26]. Концентрация никотина (100 мкМ) эквивалентно концентрации в слюне в курильщик, который впуск 25 сигарет /день [27]. Для получения дополнительных функциональных экспериментов, была выбрана концентрация никотина (100 мкМ) для лечения желудочных клеток в течение 24 ч.
<Р> Чтобы определить, является ли никотин-опосредованное стимулирование пролиферации клеток в клетках желудка опосредовано через сигнализацию α5-нАХР, мы проанализировали влияние никотина на экспрессию белка α5-нАХР в BGC823 клетках с помощью Вестерн-блоттинга. Как показано на фиг.2В, лечение никотиновой в дозе никотина (0, 1, 10, 100, 500, 1000 мкМ) в течение 24 часов, облегчали экспрессию белка α5-нАХР в зависимости от дозы образом. Для дальнейшего подтверждения участия α5-нАХР сигнального пути в никотине-опосредованного содействия пролиферации клеток рака желудка в, мы блокировали экспрессию белка α5-Nachr трансфекцией BC823 клетки с α5-нАХР-специфической миРНК (си-α5-нАХР) ( фиг.2С) и оценивали его воздействие на никотин-опосредованного содействия пролиферации клеток CCK анализа (рис 2D). По сравнению с зашифрованным неспецифической управления миРНК (Si-NC), трансфекцию с си-α5-нАХР пролиферации клеток тормозится. Кроме того, си-α5-нАХР трансфекция значительно снижается никотин-опосредованной продвижение пролиферации клеток в BGC823 в клетках (рис 2D).

Никотин ингибирование цисплатин-индуцированного апоптоза

Для дальнейшей характеристики апоптозу воздействие никотина в сочетании с цисплатином на BGC823, цисплатина был использован для индукции апоптоза в клетках BGC823. Клетки обрабатывали 20 мМ цисплатином [28]. Как показано на фиг.3А, Апоптические клетки стали округлой формы и их ядер выставлены фрагментированного морфологии, образуя апоптозных тел. В противоположность этому, клетки, совместно обрабатывали никотином и цисплатин показали небольшое фрагментация ядер и несколько апоптотических тел.
<Р> цисплатин индуцирует апоптоз дополнительно анализировали с помощью AnnexinV /7-AAD окрашивания. Проточная цитометрия участков показал, что доля от общего числа апоптотических клеток (AnnexinV + /7-AAD-) уменьшилась from43.2 ± 2,32% to29.9 ± 1,26%, при воздействии цисплатина в сочетании с 100 мкМ никотина (фиг.3В). Эти результаты свидетельствуют о том, что никотин может подавлять апоптоз, индуцированный цисплатином.

α5-нАХР /AKT сигнального пути вовлечены в анти-апоптотических эффектов никотина в цисплатин-индуцированного апоптоза клеток BGC823
<р> Для определения роль AKT в опосредовании эффекты никотина в этих клетках, мы определили, вызывает ли никотин активацию AKT в BGC823 клетках. На Фиг.4А, 20 мМ цисплатин сильно подавлена ​​активность AKT (дорожка 2), но никотин увеличивает экспрессию AKT (полоса 3) в присутствии цисплатина. Он предположил, что АКТ был активирован после облучения до 100 мкМ никотина в BGC823 клетках, как сообщалось в различных работах [29, 30]. Вниз регулирование а5-нАХР выражении снизился P-AKT выражение (дорожка 4). Лечение с помощью 10 мМ LY294002, в фосфатидилинозитол 3-киназы (PI3K) /ингибитор пути AKT, снижение анти-апоптотических эффекты никотина в BGC823 клеток (дорожка 5). Кроме того, лечение с LY294002 в сочетании с Si-CHRNA5 трансфекцией значительно подавляли Никотин индуцированная P-АКТ ​​уровни белка (дорожка 6). Эти данные свидетельствуют о том, что α5-нАХР /AKT пути играют решающую роль в опосредовании влияния никотина и химиотерапии в раковых клетках желудка.
<Р> Кроме того, мы изучили влияние никотина на цисплатин-индуцированной каспазы-3 в активации BGC823 клетки с помощью Вестерн-блот-анализа. Как показано на фиг.4В, цисплатин вызывали повышение активации каспазы-3, тогда как никотин заблокирован цисплатин-индуцированной активации каспазы-3 в клетках BGC823. Кроме того, облучение BGC823 клеток к цисплатину вызвало экспрессию апоптотических белков Bax увеличилась в то время как prosurvival белок Bcl-2 и сурвивин снижалось, что тормозились обработкой никотина.
<Р> Между тем, как показано на фиг.4С, то антиапоптозный эффект никотина явно заблокирован си-а5-нАХР в BGC823 клетках. Проточная цитометрия участков показал, что доля от общего числа апоптотических клеток (AnnexinV + /7-AAD-) увеличилась с 18,5 ± 0,92% до 34,9 ± 1,74% после того, как си-5 лечения по сравнению с группой Si-NC. Добавление ингибитора AKT LY294002 с си-а5-нАХР значительно способствовал апоптический эффект цисплатина с 31,5 ± 1,57% до 61,2 ± 3,06% по сравнению с группой LY294002. Эти результаты указывают на то, что никотин играет важную роль в предотвращении цисплатин-индуцированного апоптоза через α5-нАХР /AKT сигнального пути.

Обсуждение
<р> Это исследование является первым, чтобы продемонстрировать важную роль α5-нАХР в никотиновой антиапоптоз цисплатина в раковых клетках желудка человека. Анализ клинических образцов показал, что α5-нАХР выражение, как правило, выше в опухолевых клетках по сравнению с пара-клетками карциномы. Результаты показали, что тенденция положительная скорость а5-Nachr экспрессия была выше у пациентов с никотиновой истории всасывания, чем у пациентов без никотина истории впуска. Экстракорпорального приводит показали, что никотин повышающей регуляции экспрессии белка α5-нАХР и заторможенной цисплатин-индуцированного апоптоза путем регуляции α5-нАХР /Akt сигнального пути в клетках рака желудка. Никотин предотвращено цисплатин-индуцированной активации каспазы-3 и Bax, и повышающей регуляции экспрессии анти-апоптотических белков, Bcl-2 и сурвивин. Кроме того, было обнаружено, активация AKT, чтобы играть роль в опосредовании цисплатин-индуцированной апоптозу, а также анти-апоптотических эффекты никотина в BGC823 клетках. Это может быть интересно обратить внимание на связь между сигаретным дымом (второй курение) и заболеваемости раком желудка.
<Р> Предыдущие выводы разгадали сильную связь между сигаретным дымом и раком желудка [31, 32]. Никотин было показано увеличение пролиферации и миграции клеток рака желудка путем индукции cyclooxgenase-2 (ЦОГ-2), простагландин Е2, СЭФР, бета-адренорецепторы, протеинкиназа С [26, 33, 34]. Эти эффекты, по всей видимости, опосредовано через homopentameric А7-nAChRs [35]. Однако недавние исследования показали неожиданный эффект heteropentameric а5-nAChRs на потребление никотина [36-38]. Наши предыдущие работы сообщили, что никотин /α5-нАХР путь имеет решающее значение для жизнеспособности клеток рака легких [21, 39]. Тем не менее, никакая информация не была доступна также о том, влияет ли никотин пролиферацию клеток рака желудка человека посредством регуляции а5-нАХР. Здесь мы изучали роль а5-нАХР в развитии рака желудка человека. Наши результаты показали, что экспрессия а5-нАХР была выше в желудочных раковых тканей по сравнению с пара-карцинома ткани, что предположил, что α5-нАХР может играть определенную роль в желудочном канцерогенезе. Кроме того, никотин способствует а5-нАХР экспрессию белка и блокирует активацию а5-нАХР по миРНК ослабляется пролиферацию раковых клеток желудка никотин-индуцированного. Он предположил, что α5-нАХР является одним из основных молекул опосредуют клеточную пролиферацию, стимулированную никотина в раковых клетках желудка.
<Р> В настоящее время стандартной химиотерапии по поводу рака желудка является цисплатин, но вероятность успеха такого лечения оставляет желать лучшего. Эффективность цисплатин зависит от способности индуцировать повреждение ДНК [40, 41]. Следовательно, как раковые клетки реагируют на цисплатина индуцированный апоптоз играет важную роль в чувствительности цисплатин. Последние отчеты показывают, что никотин ингибирует цисплатин индуцируется апоптоз в клетках рака легких, рак ротовой полости, RAW264.7 и EL4 клеток [13, 16, 18], что может означать, что никотин обладает способностью не только способствовать развитию рака путем активации пути клеточного роста , но и снизить эффективность химиотерапевтических средств путем стимулирования путей выживания. В согласии с предыдущими результатами, результаты данного исследования показали, что наблюдалось совместное обработка клеток с цисплатином и никотин, значительной активации каспазы-3, что указывает, что никотин способен определить ингибирование апоптотической потенциала плоскости цисплатин при раке желудка.
<р> сигнальных путей, которые регулируют клеточные процессы, включая пролиферацию клеток, клеточного цикла и апоптоза клеток, оказывают значительное влияние на определении клеточного ответа на цисплатин. Предыдущие исследования показали, что активация AKT пути может привести к резистентности к цисплатину [42, 43]. Избыточная экспрессия серина фосфорилируется AKT был обнаружен в широком диапазоне раковых заболеваний человека, в том числе рака желудка [44, 45]. Как сообщалось в различных работах, никотин, связываясь с нАХР приводит к активации вниз по течению опухолевых белков, включая содействие активации AKT путей [46-48]. Воздействие никотина может отрицательно сказаться на апоптического потенциале цисплатин в полости рта раковых клеток человека и AKT путь был необходим для функции никотина [16]. Однако AKT путь никотиновой вниз по течению сигнализации и антиапоптотических эффектов никотина в клетках рака желудка были неизвестны. Поэтому мы исследовали, может ли Р-АКТ объяснить антагонистических действием никотина на цитотоксичность цисплатина. Мы обнаружили, что совместное лечение с миРНК-а5-нАХР и LY294002, ингибитор пути к PI3K /AKT, увеличение цисплатин-индуцированной апоптоз и ослабляются эффекты никотина в BGC823 клетках. Несколько исследований выделены никотин активированный сигнальные пути Akt в модулирующий пролиферацию и выживаемость клеток посредством активации prosurvival белка Bcl-2 и сурвивина [15, 49, 50]. Наше исследование также показало, что роль никотина на апоптоза клеток, вызванной цисплатин через α5-нАХР /AKT подтверждается индукцией сурвивина и Bcl-2, в качестве конечных эффекторов вышеуказанных путей.
<Р> Таким образом, мы показали, что никотин активированный а5-Nachr /сигнализации АКТ и участвует в сопротивлении цисплатином при раке желудка. Эти результаты дают новое понимание возможных молекулярных механизмов никотина ингибирования цисплатин-индуцированного апоптоза в клетках рака желудка человека (рис 5). Никотин присутствует в табачном дыме может помешать рака желудка фармакотерапии путем ингибирования химиотерапевтическое апоптозу медикаментозный. Стратегии, направленные на понимание никотин-опосредованной сигнализации может способствовать развитию улучшенных методов лечения при раке желудка.

Поддержка Информация
S1 Рис. Выражение а5-нАХР и А7-нАХР без или с а5-миРНК лечения
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s001
(TIF)
S2 Рис. Понижающей регуляции а5-нАХР выражении снизился уровень P-AKT
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s002
(TIF)
S3 Рис. Выражение а5-нАХР в BGC823 клетках без или с обработкой си-α5-нАХР
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s003
(TIF)
S4 Рис. Никотин способствует BGC823 пролиферации клеток через а5-нАХР и α7-нАХР
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s004
(TIF)
S5 Рис. Никотин способствует SGC7901 пролиферации клеток через а5-нАХР
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s005
(TIF)
S6 Рис. Никотин ингибирование цисплатин-индуцированного апоптоза SCG7901
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0149120.s006
(TIF)

• PLoS ONE: перевалочный система лимфоузла для рака желудка: Гибридная типа на основе топографической и числовых Sy…
• PLoS ONE: N-Terminal Полипептид аннексина A2 Уменьшает Заражение Mycoplasma hyorhinis для клеток рака желудка