Ploche ONE: pyruvátkinázy M2 hrá dvojakú úlohu v nariadení o EGF /EGFR signalizácie cez E-cadherin spôsobom závislým na rakovina žalúdka Cells

abstraktné

Pozadie a ciele

aktivácia EGFR a PKM2 výraz slúži ako nástroj vzniku nádorov. aktivácia EGFR reguluje PKM2 funkcie v závislosti na veľkosti priestoru subcelulárnu závislé a podporuje transkripcii génu a rast nádoru. Okrem toho, PKM2 je up-regulovaná v dráh EGFR indukovanej gliomových malignít. Avšak sme zistili, že PKM2 by tiež mohla regulovať aktivitu EGF /EGFR signalizačné dráhe buniek karcinómu žalúdka. Naším cieľom bolo definovať biologické mechanizmy pre PKM2 pri regulácii pohyblivosti buniek a invázie.

Metódy

zamestnaný sme stabilný transfekcia s krátkymi vlásenky RNA stabilne umlčanie expresie PKM2 v BGC823, SGC7901 a AGS žalúdočné nádorových bunkových línií. Účinky PKM2 in vitro bola stanovená na základe posúdenia migrácie a invázie buniek. Imunohistochemické analýza bola použitá na preskúmanie vzťahu medzi PKM2 a iných proteínov.

Výsledky

Naše výsledky ukazujú, že Vyradenie PKM2 znížil aktivitu E-cadherinu a zvýšila EGF /EGFR signálny dráhu v bunkových líniách žalúdočných BGC823 a SGC7901, ktoré boli pozitívne na E-cadherinu expresie. Avšak, v nediferencovaných žalúdočné bunkovej línii karcinómu AGS, ktorý postráda E-cadherinu expresiu, PKM2 podporoval migráciu a inváziu buniek. Imunohistochemické analýzy ukázali, že hladiny E-cadherin prejavu, ERK1 /2 fosforylácie a cytoplazmatickú PKM2 prejavu boli korelované so sebou ďalších strojov

Záver :.

PKM2 môžu hrať rôzne úlohy v rôzne diferencované žalúdočných karcinóm typy, a toto zistenie je v súlade s predchádzajúcim klinického výskumu. Výsledky našej štúdie ukazujú dôležitou spojnicou medzi PKM2 a E-cadherinu počas EGFR stimulovanej žalúdočnej nádorových buniek pohyblivosť a invázie

Citácia :. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et al. (2013) pyruvátkinázy M2 hrá dvojakú úlohu v nariadení o EGF /EGFR signalizácie cez E-cadherinu spôsobom závislým na žalúdočné rakovinové bunky. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10,1371 /journal.pone.0067542

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japonsko

Prijaté: 7. februára 2013; Prijaté: 20.mája 2013; Uverejnené: 28. júna 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bola podporovaná národná prírodná Science Foundation Číny (No. 30971362, 81072013 & 91229201), základného výskumu fondov pre centrálne univerzít v Číne (No. 2010111082) a ministerstva zdravotníctva nadácie pre štátnu Key klinika. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

pyruvát Kinase (PK) sprostredkováva konečnú rýchlosť určujúci krok glykolýzy katalýzou defosforylácie fosfoenolpyruvát (PEP), na pyruvát, čím sa získa jednu molekulu ATP. Cicavčie bunky majú štyri pyruvátkinázy izoenzýmy (M1, M2, L a R), ktoré sú selektívne vyjadrené v rôznych typov buniek a tkanív [1]. U cicavcov, izoformu M1 (PKM1) je exprimovaný vo väčšine dospelých tkanivách. M2 izoformy (PKM2), alternatívne prepojenej variant M1, je vyjadrený v priebehu embryonálneho vývoja [2]. Štúdie preukázali, že rakovinové bunky exprimujú výlučne PKM2 [3], [4]. PKM2 bolo preukázané, že sú nevyhnutné pre aeróbne glykolýzy v nádoroch (Warburg efekt). V priebehu rokov boli významné pokroky boli vykonané v pochopenie funkcie a regulácie PKM2 ako pyruvát kinázy a proteín kinázy v nádorových bunkách [5]. Nedávna štúdia potvrdila, že PKM2 vyvolaná epidermálneho rastového faktora (EGF), premiestni do jadra buniek, glioblastóm, interaguje s beta-kateninu a vedie k expresii cyclinD1, ktorá podporuje proliferáciu buniek a tumorigeneze [6]. Tieto zistenia ukazujú novú úlohu PKM2 ako transkripčný koaktivátoru. Avšak, existujú niektoré spory týkajúce sa špecifickosti a potenciálu PKM2 ako cieľ proti rakovine v liečbe rakoviny. Nedávne zistenia ukázali, že PKM2 expresia je silne korelované s žalúdočnej diferenciáciu rakoviny. Diferencované typy rakoviny odsávať viac PKM2 bielkovín ako robiť tie nediferencovanej. PKM2 bol nepriaznivý prognostický faktor pri pečatný prsteň bunky rakoviny žalúdka [7]. Biologická úloha PKM2 v rôznych fázach diferenciácie a vo vývoji rakoviny žalúdka je potrebné ďalej objasnený.

Predchádzajúce štúdie týkajúce PKM2 sa zamerala na metabolizme nádorov a rastu nádorov. Tam bolo len niekoľko správ o nádorových metastáz. E-cadherinu hrá rozhodujúcu úlohu v udržiavaní integrity epiteliálne a strata E-cadherinu ovplyvňuje adhezívne repertoár bunky [8]. Predchádzajúce štúdie [9] in vitro ukázali, že strata E-cadherinu v ľudských bunkových líniách karcinómu je spojená so zlou diferenciáciou a fibroblastoidní morfológie. aktivácia EGF-závislé na EGFR bola označená byť inhibovaná v spôsobe E-cadherin adhézie závislé, ktorá inhibuje aktiváciu ligand-dependentný z rôznych receptorové tyrozínkinázy [10]. Náš výskum preukázal, že porazený z PKM2 znížil aktivitu E-cadherinu a posilnila EGF /EGFR signálne dráhu v bunkových líniách BGC823 a SGC7901, ktoré boli pozitívne na E-cadherinu výrazu. Avšak, v nediferencovaných žalúdočné bunkovej línii karcinómu AGS, ktorý postráda E-cadherinu expresiu, PKM2 podporoval migráciu a inváziu buniek. Cieľom tejto štúdie bolo objasniť funkciu a mechanizmus PKM2 vzhľadom na bunkovú motilitu inak diferencovaných bunkových línií.

Materiály a metódy

Cell Culture, podmienky a transfekcia

rakovina žalúdka u bunkové línie BGC823 (zle diferencované, v závislosti od poskytovateľa) a SGC7901 (stredne diferencovaného) boli kultivované v médiu RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, USA). Bunková línia AGS (nediferencovaný) bola kultivovaná v médiu F12K. Všetky bunky boli kultivované v médiu obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum (FBS) (Gibco, Detroit, MI, USA) a 100 IU /ml penicilínu-streptomycínu pri teplote 37 ° C v 5% CO _{2 zvlhčenej atmosfére. Rakovina bunkové línie ľudského žalúdka AGS bolo nariadené od American Type Culture Collection (ATCC, USA), a rakovina žalúdka u ľudí bunkových línií SGC7901 a BGC823 boli získané z Číny Centra pre Type Culture Collection (Shanghai, Čína). SGC7901, BGC823 a AGS bunky boli transfekovány s siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) alebo plazmidu (pcPUR + U6-siRenilla) za použitia Fügen HD (Roche, Indianapolis, IN) PU6. Puromycin (0,1 ug /ml) bol použitý pre skríning stabilne transfekciou klonov. Expresia proteínu bola skúmaná PKM2 s analýzou Western blot s použitím protilátky proti PKM2 overiť schopnosť konštruktov pre inhibíciu expresie cieľového génu; Tieto experimenty boli opakované trikrát. Bunkové kultúry boli v kľudovom stave pestovaním ich do zhlukovania, a bolo médium nahradené čerstvým médiom obsahujúcim 0,5% séra po dobu 1 dňa. EGF sa 100 ng /ml konečná koncentrácia bola použitá k stimulácii buniek. EGF bola získaná od Cell Signaling Technology.}

Stabilné Vyradenie PKM2 a Over-expresia PKM2

Plasmid obsahujúci sekvenciu RNA interferencie, ktorá bola zameraná na PKM2 gén BGC823, SGC7901 a AGS bunky bol konštruovaný. Zmysel oligo pre sekvenciu siPKM2 bola 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 'a antisencie oligonukleotid je 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. BGC-823, SGC-7901 a AGS bunky boli transfekovány pcPUR + U6-siPKM2 alebo pcPUR + U6-siRenilla (kontrola) a vybraná ako puromycin-rezistentné klony. Western blot analýza bola vykonaná s cieľom potvrdiť potlačenie PKM2. Plazmid obsahujúci PKM2 cDNA sekvenciu bol získaný od firmy Invitrogen. BGC-823, SGC-7901 a AGS bunky boli transfekovány s pcDNA6.0-PKM2 alebo pcDNA6.0-Mock (kontrola) a sú vybrané ako je blasticidin-rezistentných klonov. Western blot analýza bola vykonaná na potvrdenie expresie PKM2.

Proteín Extraction a western blot analýza

Bunky boli resuspendované v lyzačním pufri obsahujúcom koktail inhibítora proteázy, a extrahované proteíny boli separované za použitia 8-10% SDS-PAGE. beta-tubulínu bola použitá ako kontrola nanášania. Protilátky proti E-cadherinu a p-E-cadherinu boli získané od Epitomics. Fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfo-PLCγ1 (Tyr783), fosfo-AKT (Ser473), fosfo-Gab1 (Tyr627), fosfo-c-CBL (Tyr700), a fosfo-ERK1 /2 protilátky (Thr202 /Tyr204) boli získané od firmy Cell Signaling Technology.

RNA extrakcie, reverzné transkripcie a PCR v reálnom čase

Celková RNA bola extrahovaná za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen, CA, USA). Vzorky sa potom spracuje s DNázy počas 15 minút pri teplote miestnosti, a RNA ďalej vyčisteným s použitím RNA vyčistenie kit (Qiagen, CA, USA). Reverzný transkripcie (RT) reakcia v prvom vláknom syntézu cDNA bola vykonaná s použitím reverznej transkriptázy (Bio-Rad) s 2 ug celkovej RNA. Kvantitatívna analýza RT-PCR bola vykonaná s ABI 7500 (Applied Biosystems), a hladiny génovej expresie pre každý jednotlivý vzorku boli normalizované k GAPDH. Priemerná relatívna expresia génu bola určená a rozdiely boli vypočítané za použitia 2 ^{-ΔΔCt spôsob elektroforézou na agarózovom géle. Primérov Sekvencie RT-PCR boli nasledujúce: 5'-zmysel TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'a antisencie 5'GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' pre N-cadherinu; sense 5'CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'a antisencie 5'AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3' pre E-cadherinu; sense 5'TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'a 5'antisense GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3 "pre MMP7; sense 5'CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'a 5'-antisencie CCCCATGGTGTCTGAGCG-3 "pre GAPDH.}

Cell Test proliferácie

Bunková proliferácia bola meraná pomocou Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki -gun, Kumamoto, Japonsko) podľa inštrukcií výrobcu. V stručnosti, bunky boli nasadené na štyri 96-jamkové doštičky v hustote 2 x 10 ^{3 buniek /jamka. Jedna platňa odfotil v rovnaký čas každý deň potom, čo boli bunky sa dodržaný do jamiek. Absorbancia bola meraná pomocou ELISA readeru pri vlnovej dĺžke 450 nm. Všetky experimenty boli vykonávané v triplikátech.}

Transwell invázie a hojenie rán Testy

transwell invázie testy boli vykonané s 8,0-um pórov vložky do 24-jamkové doštičky transwell. Bazálna membrána bola hydratovaná s 500 ul bezsérového RPMI 1640 alebo F12K médium 30 minút pred použitím. Pre test invázie, žalúdočné rakovina bunkové línie boli pridané do hornej komôrky Transwell s 0,5 mg /ml kolagénu typu l (BD Bioscience, San Jose, CA) -coated filtre. RPMI 1640 alebo F12K médium s 10% fetálnym bovinným sérom a 1% každého antibiotiká bol pridaný do dolnej komory. BGC a 7901 bunky boli inkubované po dobu 36 hodín. AGS Bunky boli inkubované po dobu 24 hodín. Invázne bunky boli kvantifikované po Gentian fialovým zafarbením. Každý experiment bol vykonaný v troch opakovaniach a údaje boli vyjadrené ako priemerné hodnoty. Test hojenie rán bola vykonaná v 6-jamkových doštičkách. Nádorové bunky v médiu obsahujúcom 10% FBS boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek (Corning, CA). Bunkové kultúry boli v kľudovom stave pestovaním ich do zhlukovania, a bolo médium nahradené čerstvým médiom obsahujúcim 0,5% séra po dobu 1 dňa. Rany v monovrstvě boli vykonané s sterilné špičky pipety. Potom bol použitý EGF s 100 ng /ml konečná koncentrácia pre stimuláciu buniek. Bunky boli potom premyté PBS a aktualizovaná s médiom obsahujúcim 10% FBS. Fotografie boli nasnímané pri 0 a 24 hodín. Všetky experimenty boli vykonávané v troch vyhotoveniach

Ethics Prehlásenie

Táto štúdia bola schválená výborom pre etiku (č: 20081012). V nemocnici Zhongshan spojený s Xiamen University, Xiamen, provincie Fujian, Čína, a získali sme písomné vyjadrenie súhlasu všetkých účastníkov zapojených do tejto štúdie.

Príprava tkanivových vzoriek

nádoru vzorky tkaniva boli odobraté od 15 rôznych pacientov s rakovinou žalúdka, ktorí podstúpili kuratívne resekcii v nemocnici Zhongshan, Xiamen University, Xiamen, Čína. Nezávislá séria zodpovedajúce priľahlé nenádorové tkaniva z 15 z týchto pacientov bola zhromaždená v rovnakom čase. Všetky vzorky tkaniva boli odobraté a rozdelený do dvoch častí bezprostredne po resekcii nádoru. Jedna časť bola zhromaždená do tekutého dusíka a skladované pri -80 ° C až do extrakcie RNA a proteín. Druhá časť bola stanovená v 4% formaldehydu a vložené do parafínu pre histologické analýzy (hematoxylín eozín a IHC farbenie). Všetky vzorky boli potvrdené patologické diagnózy (histopatologické diagnóza bola založená na kritériách WHO). Všetky experimentálne prípady boli združené accord-ing International Union Against Cancer Tumor-Node-metastázy (TNM) staging systém (revidovaný v roku 2002).

Imunohistochémia

Štvor-mikrónov silné parafínové rezy boli buď zafarbené hematoxylínom a eosínu (H &E) a analyzované na PKM2, p-ERK1 /2 a E-cadherin expresie imunohistochémia. Imunohistochémia bola vykonaná v súlade s postupmi, ktoré boli podľa odporúčania výrobcu. Tieto reakcie boli vizualizované za použitia Diaminobenzidine ako chromogénneho substrátu. Rezy boli kontrastne použitím hematoxylínu a potom zrušené a namontovať. Priemerná hustota (Iod /oblasť) bola zistená v rôznych kladných oblastiach 15 ľudských jedincov s karcinómom žalúdka s použitím Image-Pro Plus softvér.

Štatistické analýzy

Štatistické analýzy boli vykonané pomocou SPSS V13. 0 (SPSS, Inc.) softvér. Nezávislá-T Vzorky pre testovanie a korelačný analýzy boli použité na porovnanie dát. Všetky hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± SD. Rozdiely boli považované za štatisticky významné pri P Hotel <0,05.

Výsledky

Vyčerpanie PKM2 sponzorovaných Cell migrácie a invázie do BGC823 a SGC7901 Bunky s EGF stimulácie

expresie PKM2 proteínu v žalúdočných bunkových línií karcinómu BGC823, SGC7901 a AGS bola hodnotená pomocou analýzy westernového prenosu. Tieto bunkové línie vykazovali vysokú úroveň expresie PKM2. Potom, stajňa žalúdočné rakovina bunkové línie so zmenenou PKM2 výrazu boli vytvorené pomocou RNA interferencie (PKM2 Knockdown) v bunkách BGC823, SGC7901 a AGS. Ako je znázornené na Obr. 1A, vznikli bunkové línie BGC823, SGC7901 a AGS s PKM2 porazený. Pozorovali sme, že proliferácia bola znížená v bunkách BGC823 a AGS po PKM2 bol vyčerpaný (Obr. 1B). Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi štúdiami.

Ak chcete skúmať účinok PKM2 o migrácii a invázii buniek, sme pracujúcich dobre zavedené hojenie rán a transjamkových testy sa charakterizujú odozvu pohyblivosť buniek v BGC823 a SGC7901 buniek , Konfluentní vrstva buniek bola najprv inkubovaná cez noc v médiu, škrabnutia rana bola zavedená, pridané médium obsahujúce najvhodnejšiu dávku EGF (100 ng /ml), k stimulácii migrácie, a percento utesnenie rany bol pozorovaný po 24 hodinách ( obrázok S1). Invázne Bunky boli kvantifikované 36 hodín po EGF (100 ng /ml), bol pridaný do dolnej komory. Výsledky ukazujú, že liečba BGC823-šípky a SGC7901-Šípky buniek s EGF po poškriabaniu rany a v Transwell výrazne zvýšil rýchlosť hojenia rán (obr. 1 C, D) a invázie (obr. 1 E, F) porovnávaná s kontrolnými bunkami.

Vyčerpanie PKM2 Zníženie E-cadherinu prejavu a Enhanced činnostiach EGF /EGFR Downstream signálnej dráhy PLC-γ1 a ERK1 /2

vyšetrovať mechanizmus zmeny v migrácii a invázii buniek po Vyradenie PKM2 sme analyzovali expresiu členov Ca ^{2 + -dependentní bunkovej adhézie molekúl rodiny a metaloproteinázy. Bolo zistené, že hladiny expresie E-cadherin proteín boli znížené v BGC823 a SGC7901 buniek, kedy bolo PKM2 expresie znížená (obr. 2A).}

Úroveň E-cadherinu mRNA a fosforylácie E-cadherinu boli stanovené v BGC823 a SGC7901 bunky s vyčerpaním PKM2 posúdiť, či je pozorovaný rozdiel v E-cadherin vyjadrenie došlo k pre- alebo post-translačný. Sledovali sme down-reguláciu E-cadherinu mRNA a zvýšenú fosforylácii, ktorá spôsobuje endocytózu E-cadherinu, v PKM2 zbavenú buniek (Obr. 2A, B). Tiež sme zistili, že hladina expresie N-cadherinu proteínu bola zvýšená v bunkových líniách a BGC823 SGC7901, kedy bol vyčerpaný PKM2 (obr. 2A).

migráciu a inváziu buniek sú z veľkej časti regulované EGFR aktivitou. Analyzovať, či EGFR sa zúčastňuje migrácie a invázie a BGC823 SGC7901 buniek, tieto bunky boli ošetrené s EGF, ktorý sa viaže k EGFR a aktivuje následné signálnych dráh. Liečba EGF viedla k fosforyláciu EGFR a následnú aktiváciou PLCγ1, AKT a ERK1 /2 dráh (obr. 2C). Zistili sme, že PLC γ1 mali vyššiu úroveň aktivity v bunkách PKM2 ochudobnené ako v un-ochudobnený buniek po buď kratšie alebo dlhšie (24 h) inkubácii s EGF. Avšak, tam nebol žiadny výrazný rozdiel v aktivite medzi AKT PKM2 ochudobnené buniek a un-vyčerpaných buniek. PLCγ je kľúčovým regulátorom bunkovej migrácie po prúde RTK signalizácie [11]. Fosforylácie na zvyšok tyrozínu 783 z PLCγ1 je kritická pre jeho aktiváciu [12]. Aktivácia PLCγ1 lepšiu pohyblivosť buniek, a tento účinok bol pozorovaný v rane a stieracie transwell testov, ako bolo pozorované na obr. 1C.

Ďalej sme sledovali vplyv EGFR ligandu na expresiu MMP za použitia RT-PCR v BGC823-Šípky a SGC7901-Šípky buniek v porovnaní s ich príslušnými kontrolnými bunkami. Liečba EGFR ligandom, EGF, zvýšenú expresiu MMP na úrovni transkripcie v BGC823 a SGC7901 buniek. Avšak neboli zaznamenané žiadne zjavné rozdiely v expresných hladín MMP2 a MMP9 medzi PKM2 zbavenú buniek a ich kontrolné bunky (dáta nie sú ukázaná). MMP7 expresie bola up-regulovaná v PKM2 zbavenú buniek liečenie EGF (obr. 2D). EKR /MAPK cesty zohrávajú kľúčovú úlohu v EGFR ligandom-indukovanej expresie MMP7. Ďalej bol pozorovaný zrejmý nárast ERK1 /2 aktivity po 0 h a 24 h liečby EGF v bunkách PKM2 ochudobnený.

Vyčerpanie PKM2 tlmí Pohyblivosť AGS buniek a funkčné zmeny potom, čo zachránil PKM2 v žalúdku nádorových bunkových línií

expresie E-cadherinu proteínu v rakovinových bunkových líniách žalúdočných BGC823, SGC7901 a AGS bola hodnotená pomocou analýzy Western blot. Bunkové línie BGC823 a SGC7901 expresiu E-cadherin. Na rozdiel od toho AGS bunky postrádajú E-cadherinu expresiu (Obr. 3A).

Ak chcete skúmať účinok PKM2 Knockdown o migrácii buniek a invázie v roku AGS bunkách, sme pracujúcich dobre zavedené hojenie rán a transjamkových testy na charakterizujú pohyblivosť buniek. Konfluentní vrstva buniek bola najprv inkubovaná cez noc v médiu, rany poškriabaniu bola zavedená, pridané médium obsahujúce EGF (100 ng /ml), k stimulácii migrácie, a percento utesnenie rany bol pozorovaný po 24 hodinách. Invazívne bunky v teste transwell boli kvantifikované 24 hodín po EGF (100 ng /ml), bol pridaný do dolnej komory. K nášmu prekvapeniu sme zistili, že zaobchádzanie s AGS-šípku buniek EGF po rany nuly a v Transwell významne znížila rýchlosť utesnenie rany a invázie porovnaní s kontrolnými bunkami (obr. 3B, C). Bolo nápadné rozdiely medzi BGC823 /SGC7901 a AGS buniek.

Pre ďalšie objasnenie role PKM2 v bunkovej motility, sme urobili PKM2 záchranu experimenty. Takeda máme stabilne transfekované metódu pomocou nadmernou expresiou plazmidovej vektor pcDNA6.0-mock a pcDNA6.0-PKM2 sa vysporiadať s BGC823 a AGS buniek, ktoré stabilný porazený PKM2. Expresie p-EGFR, E-cadherin boli uvedené v PKM2 záchranu experimenty (obr. 3D). Pozorovali sme, že keď je expresia PKM2 späť, fosforylácie EGFR výrazne znížila v BGC823 buniek a zvýšenej v AGS bunkách. Okrem toho, pohyblivosti buniek z BGC823 buniek bola znížená a AGS bunky boli klesala po PKM2 záchranu (obr. 3E). Na objasnenie mechanizmu týchto rozdielov, potom sme analyzovali aktivitu EGF /EGFR signálnej dráhy.

PKM2 Enhanced činnostiach EGF /EGFR Následný signálnych dráh v bunkách AGS a korelovala s EQF aktivitu v žalúdočnej rakovina Vzorky

aby bolo možné analyzovať, či EGFR môžu byť zapojené do migráciu a inváziu buniek AGS, tieto bunky boli ošetrené s EGF, ktorý sa viaže k EGFR a aktivuje následné signálnych dráh. Liečba EGF viedlo k fosforyláciu EGFR a následnej aktivácii nadväzujúcich dráh EGFR, vrátane PLCγ1 a ERK1 /2 dráh (obr. 4A). Zistili sme, že činnosť PLCγ1 a ERK1 /2 bolo vyššie u buniek, kde bol PKM2 nie je ochudobneného než v PKM2 ochudobnené bunky buď po kratšej alebo dlhšej (24 h) inkubácie s EGF. Tento výsledok je opak toho, čo bolo pozorované s BGC823 a SGC7901 buniek; V AGS bunkách, PKM2 prišiel do hry ako stimul a podporoval migráciu a inváziu buniek. Ďalej sme skúmali MMP7 expresie pomocou RT-PCR v AGS-Šípky bunky a kontrolné bunky. Liečba EGF zvýšenú MMP7 expresie na úrovni transkripcie v AGS-pu6 buniek, ale nie v AGS-šípky buniek (obr. 4B). Aktivita ERK1 /2 bola zrejme vyššia u AGS-pu6 buniek v porovnaní s AGS-šípku buniek po 0 h a 24 h liečby EGF (obr. 4a).

Ďalej sme vykonané imunohistochemické (IHC) analýzy, ktoré preskúmať E-cadherinu výraz, PKM2 lokalizáciu a ERK1 /2 fosforyláciu v sériových sekcií 15 ľudských jedincov s karcinómom žalúdka s použitím protilátok s overenými špecifikám. Obrázok 4C ukazuje, že hladiny E-cadherin prejavu, ERK1 /2 fosforylácie a cytoplazmatickú PKM2 prejavu boli korelované so sebou. Okrem toho sme pozorovali vysokej úrovne ERK1 /2 fosforylácie v jadre nádorových buniek bez E-cadherinu expresie. V oblastiach ERK1 /2 fosforylácie, tiež zistené, vyššie hladiny expresie PKM2. Avšak sme nenašli fosforylácii ERK1 /2 v oblastiach pozitívnych na E-cadherin výrazu (obr. 4C). Analýza korelácie medzi PKM2, E-cadherinu a P-ERK1 /2 bola vykonaná s použitím Image-Pro Plus software (obr. 4d). Priemerná hustota (Iod /oblasť) bol zaznamenaný v rôznych oblastiach pozitívnych 15 ľudských jedincov s rakovinou žalúdka. Našli sme významnú koreláciu medzi PKM2 a E-cadherinu v E-cadherinu pozitívnych oblastí. Okrem toho bola významná korelácia medzi PKM2 a p-ERK1 /2 v E-kadherinu negatívne oblastiach.

Diskusia

invazívne a metastatické fáza progresie rakoviny koreluje so zlou klinickou prognózou a predstavuje najpôsobivejšie prekážku pre úspešnú liečbu. Pohyblivosti buniek a invázie sú rozhodujúce prvky zhubných nádorov, ktoré umožňujú nádorových buniek migrovať do priľahlých tkanív alebo prostredníctvom obmedzenia základných membrán a extracelulárnej matrice. Pohyblivosti buniek je na fyziologické procesy opravy a organogenézy rán a patologického procesu invázie tumoru [13] nutná. Invazívne nádorové bunky sú charakterizované porušenú reguláciou bunkovej motility v reakcii na extracelulárnej signály z rastových faktorov a cytokínov. Ľudské nádory exprimujú vysoké hladiny rastových faktorov a ich receptorov, a mnoho typov malígnych buniek sa zdá vykazovať autocrine- alebo parakrinný stimulovanej rast. Medzi dobre študovaných systémov receptoru rastového faktora je receptor EGF rodiny [14]. Signály z extracelulárneho prostredia diktovať pohyblivosť buniek. Mnoho rastových faktorov, vrátane ligandov, ktoré pôsobia cez receptor epidermálneho rastového faktora (EGFR), zvýšila pohyblivosť buniek [15]. Najmenej dva odlišné intracelulárnej signálnej dráhy sú vyžadované pre EGFR-sprostredkovanú bunkovú pohyblivosť: chodníky využívajúce PLC y a cesty kinázy MAP. γ činnosť PLC bolo navrhnuté zvýšiť pohyblivosť buniek prostredníctvom mobilizácie aktínu modifikáciu proteínov z neaktívneho membránou asociované lokalizácia na aktívny sub-membrána cytoskeletu národné prostredie [16]. EKR MAP kinázy vysielanie signálov do jadra, ako aj signály, ktoré regulujú bunkové matrice pripojenie.

kadheriny zahŕňajú veľkú rodinu bunkových adhéznych molekúl-buniek, ktoré zahŕňajú klasickú, desmosomální a atypické kadheriny. E-cadherin, ktorý je exprimovaný primárne v epiteliálnych bunkách, je adhézny proteín, ktorý je kódovaný génom a funkcie CDH1 v mnohých procesoch, vrátane vývoja, integritu tkaniva, migrácia buniek, morfológie, a polarity [17], [18], [19]. E-cadherin je tiež nádorový supresor, ktorého expresia je často znížená alebo umlčaný a jeho re-expresie môže vyvolávať morfologické reverziu [20], [21]. aktivácia EGF-závislé na EGFR bola označená byť inhibovaná v spôsobe E-cadherin adhézie závislé, ktorá inhibuje aktiváciu ligand-dependentný z rôznych receptorové tyrozínkinázy. N-cadherin, ako promótor invázia, je často up-regulovaná. Expresie N-cadherinu v epitelových bunkách vyvoláva zmeny v morfológii na fibroblastickou fenotypu, čím sa bunky viac pohyblivých a invazívne. Nedávne štúdie ukazujú, že rakovinové bunky sú up-regulované N-cadherin okrem straty E-cadherinu. Táto zmena v cadherinu výrazu je nazývaný "switch cadherin".

sme pozorovali down-reguláciu E-cadherinu mRNA a zvýšenou fosforyláciou, ktorá spôsobuje endocytózu E-cadherinu v bunkách PKM2-vyčerpané. Tiež sme zistili, že sa N-cadherin úrovne expresie proteínu bola zvýšená v bunkovej línii, kedy bol BGC823 PKM2 vyčerpaná. Porazený z PKM2 podporoval migráciu buniek a invázie v BGC823 a SGC7901 bunky s stimulácii EGF. Zvýšenú aktivitou EGFR je kritickým faktorom pri určovaní pohyblivosť buniek a invazivitu BGC823 a SGC7901 buniek. Predpokladali sme, že down-regulácia E-cadherin prejavu zvýšenú fosforyláciu EGFR a aktivoval následné signálnych dráh, ktoré zahŕňajú PLCγ1 a ERK1 /2. Aktivácia PLC γ zvyšuje pohyblivosť buniek a ERK1 /2 aktivita hrá rozhodujúcu úlohu v MMP7 výrazu.

matrixu metaloproteinázy (MMP) sú zapojené do rakoviny invázie a metastáz, pretože ich extracelulárnej matrix (ECM) -proteolytic aktivitu [22]. MMP-7 bolo hlásené, že je produkovaný buniek karcinómu žalúdka a je významne spojená s agresívnym patologické fenotypy karcinómu žalúdka [23]. MMP-7 môžu aktivovať pre-MMP-1, má silnú stromelysin-podobnú aktivitu a degraduje nerozpustný elastín, kolagén typu IV, laminínu-1, fibronektín, proteoglykánov a želatíny [24]. EKR /MAPK cesty zohrávajú kľúčovú úlohu v EGF-indukovaná expresia MMP7 [25].

E-cadherin je bunková adhézny glykoproteín vyznačujúci sa prvýkrát v ľudských bunkových líniách podľa Shimoyama et al [26]. Jeho úloha v rozvoji rakoviny žalúdka bol prvýkrát definovaný Guilford et al [27]. Existuje významná korelácia medzi stupňom E-cadherinu prejavu a stupňom diferenciácie nádoru, rovnako ako histologický typ podľa Lauren a klasifikácie WHO. Pacienti s E-cadherinu-pozitívnymi nádormi majú výrazne lepšiu mieru prežitia 3 a 5 rokov, ako u pacientov s E-cadherinu-negatívne nádory [28]. Dedičný rozptýlená žalúdočné rakovina (HDGC) je zriedkavé autozomálne dominantný syndróm, ktorý je z veľkej časti pripísať zárodočné mutácie a delécie v géne CDH1 spojené s skorým nástupom, histologicky difúzna, Signet-ring bunkový typ rakoviny žalúdka [29], [30].

Lim JY et al uvádzajú, že PKM2 expresia bola silne korelované s žalúdočnej diferenciáciu rakoviny. Diferencované typy rakoviny odsávať viac PKM2 bielkovín ako na nediferencovaných typov; Naproti tomu vyšší expresie PKM2 koreluje so zníženou celkovou prežitie nezávisle na štádiu rakoviny Signet-bunka prsteňa. PKM2 expresia by mohla byť nežiaduce prognostický faktor pre karcinóm Signet-ring buniek, ktoré nemajú E-cadherin [7]. Tieto výsledky sú v súlade s naším výskumu buniek karcinómu žalúdka. BGC-823, SGC-7901 a bunkové línie AGS sú rôzne diferencované typy. E-cadherin výraz existuje v SGC-7901 a BGC-823 bunkových línií; Naproti tomu AGS bunky boli odvodené z malígne tkaniva adenokarcinómu žalúdka a postrádajú E-cadherinu sprostredkovanú adhéziu buniek [31]. Pozorovali sme, že Vyradenie PKM2 podporoval migráciu a inváziu SGC-7901 a BGC-823 bunkových línií, ale potlačil tieto vlastnosti v bunkovej línii AGS. Ďalšia skupina uviedla, že pyruvát kináza typu M2 je up-regulovaná v kolorektálneho karcinómu, a Vyradenie PKM2 potlačiť proliferáciu a migráciu buniek karcinómu hrubého čreva RKO [32]. Vieme, že RKO bunky postrádajú expresiu E-cadherinu [33]. Imunohistochemické (IHC) analýza ukazuje, že hladiny E-cadherin prejavu, ERK1 /2 fosforylácie a cytoplazmatickú PKM2 prejavu boli korelované so sebou. Zistili sme, vysokej úrovne ERK1 /2 fosforylácie v jadre nádorových buniek bez toho, aby E-cadherin expresie, ale s vysokou úrovňou expresie PKM2.

sme hypotézu, že PKM2 tlmí pohyblivosť buniek a inváziu, keď E-cadherin je prítomný. Táto nová funkcia PKM2 môže hrať úlohu v reverzibilné inhibíciu bunkovej motility a inváziu v skorých štádiách rakoviny žalúdka, kedy bunky sú pozitívne na E-cadherinu expresie. V priebehu progresie nádoru, absencia alebo veľmi nízka expresia E-cadherinu vyvoláva agresívne funkciu PKM2 v nádoru. Biologická úloha PKM2 na vývoji týchto nádorov, musí byť ďalej objasnený.

podporné informácie
obr S1.
expresie EGFR proteínu v bunkových línií karcinómu žalúdka BGC823, SGC7901 a AGS bola hodnotená pomocou analýzy Westernového prenosu. AGS bunky vykazovali vyššiu úroveň expresie EGFR ako ostatné dve bunkové línie. Neexistuje žiadny významný rozdiel medzi BGC823 a SGC7901 buniek (obr S1A). BGC-pu6 bunky a BGC-Šípky bunky boli ošetrené rôznymi dávkami EGF. Po 40 minútach sme zistili úroveň fosforylácie pre EGFR. Zistili sme, najvyššiu úroveň fosforylácie v dávke 100 ng /ml (obr S1B). Preto sme zvolili dávku 100 ng /ml ako najvhodnejšieho kandidáta. Transwell experiment tiež ukázal väčšiu schopnosť preniknúť na martrigel v BGC823 bunkách (obr S1C)
doi :. 10,1371 /journal.pone.0067542.s001
(TIF)

• Ploche ONE: Genetické Varianty receptor epidermálneho rastového faktora dráhy génov a riziko pažeráka Spinocelulárny karcinóm a rakoviny žalúdka v čínskej populácie
• Ploche ONE: malá molekula R1498 ako dobre tolerovaná a orálne aktívny kinázy inhibítorom hepatocelulárneho karcinómu a žalúdka liečby rakoviny prostredníctvom Targeting angiogenézy a mitó…