PLOS ONE: Pyruvate Kinase M2 joue un double rôle sur le règlement du /EGFR de signalisation EGF via E-cadhérine-dépendante Manner dans le cancer gastrique Cells

Résumé

Contexte et Objectifs

activation de l'EGFR et l'expression de PKM2 sont essentielles dans la tumorigenèse. l'activation de l'EGFR régule les fonctions PKM2 d'une manière dépendante du compartiment subcellulaire et favorise la transcription du gène et la croissance tumorale. En outre, PKM2 est régulée positivement dans les voies induites par l'EGFR dans les tumeurs malignes de gliome. Cependant, nous avons constaté que PKM2 pourrait également réguler l'activité de la /EGFR voie de signalisation de l'EGF dans les cellules cancéreuses gastriques. Nous avons cherché à définir les mécanismes biologiques pour PKM2 dans la régulation de la motilité et l'invasion cellulaire.

Méthodes

Nous avons utilisé une transfection stable avec de l'ARN en épingle à cheveux court pour faire taire de manière stable l'expression de PKM2 dans le BGC823, SGC7901 et des lignées cellulaires de cancer gastrique AGS. Les effets de la PKM2 in vitro ont été déterminés en évaluant la migration cellulaire et l'invasion. L'analyse immunohistochimique a été utilisé pour explorer la relation entre les PKM2 et d'autres protéines.

Résultats

Nos résultats indiquent que le knockdown de PKM2 a diminué l'activité de E-cadhérine et amélioré la voie de signalisation /EGFR EGF dans les lignées de cellules gastriques et BGC823 SGC7901 qui étaient positifs pour l'expression de la E-cadhérine. Toutefois, dans la lignée cellulaire gastrique de carcinome indifférencié AGS, qui est dépourvue d'expression E-cadhérine, PKM2 favorisé la migration cellulaire et l'invasion. Les analyses immunohistochimiques ont montré que les niveaux d'expression E-cadhérine, ERK1 /2 phosphorylation, et l'expression de PKM2 cytoplasmique ont été corrélés entre eux

Conclusion:.

PKM2 peut jouer des rôles différents dans l'estomac différemment différenciée cellule cancéreuse des types, et cette conclusion serait compatible avec la recherche clinique précédente. Les résultats de notre étude révèlent un lien important entre PKM2 et E-cadhérine pendant gastrique motilité et l'invasion des cellules cancéreuses de l'EGFR stimulée

Citation:. Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et al. (2013) Pyruvate Kinase M2 joue un double rôle sur le règlement du /EGFR de signalisation EGF via Manner E-cadhérine-dépendante dans les cellules du cancer gastrique. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10.1371 /journal.pone.0067542

Editeur: Hiromu Suzuki, Université médicale de Sapporo, Japon

Reçu 7 Février, 2013; Accepté: 20 mai 2013; Publié le 28 Juin, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Wang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine (n ° 30971362, 81072013 & 91229201), les fonds de la recherche fondamentale pour les universités centrales en Chine (n ° 2010111082) et le ministère de la Santé de la Fondation pour Key State Département clinique. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

pyruvate kinase (PK) médie la dernière étape cinétiquement limitante de la glycolyse en catalysant la déphosphorylation de phosphoénolpyruvate (PEP) de pyruvate pour donner une molécule d'ATP. des cellules mammaliennes ont quatre isoenzymes pyruvate kinase (M1, M2, L et R), qui sont exprimés sélectivement dans différents types de cellules et de tissus [1]. Chez les mammifères, l'isoforme M1 (PKM1) est exprimée dans la plupart des tissus adultes. L'isoforme M2 (PKM2), une variante épissage alternatif de M1, est exprimé pendant le développement embryonnaire [2]. Des études ont montré que les cellules cancéreuses expriment exclusivement PKM2 [3], [4]. PKM2 a été montré comme essentiel pour la glycolyse aérobie dans des tumeurs (effet Warburg). Au fil des années, des progrès significatifs ont été réalisés dans la compréhension de la fonction et la régulation des PKM2 comme une pyruvate kinase et la protéine kinase dans les cellules cancéreuses [5]. Une étude récente a confirmé que la PKM2 induite par le facteur de croissance épidermique (EGF) est transloqué dans le noyau des cellules de glioblastome, interagit avec la β-caténine et conduit à l'expression cyclinD1, ce qui favorise la prolifération cellulaire et la tumorigenèse [6]. Ces résultats révèlent un nouveau rôle pour PKM2 comme un coactivateur transcriptionnel. Cependant, il existe des controverses quant à la spécificité et le potentiel de PKM2 comme une cible anti-cancéreux dans le traitement du cancer. Une découverte récente a révélé que l'expression de PKM2 est fortement corrélée avec la différenciation du cancer gastrique. types de cancers différenciés expriment plus de protéines PKM2 que ne le font ceux indifférenciées. PKM2 était un facteur pronostique défavorable dans le cancer gastrique de cellules chevalière [7]. Le rôle biologique de PKM2 dans les différentes phases de différenciation et le développement d'un cancer gastrique doit encore être élucidé.

Des études antérieures concernant PKM2 se sont concentrés sur le métabolisme de la tumeur et la croissance tumorale. Il y a eu quelques rapports sur les métastases tumorales. E-cadhérine joue un rôle essentiel dans le maintien de l'intégrité de l'épithélium, et la perte de la E-cadhérine affecte le répertoire de l'adhésif d'une cellule [8]. Des études antérieures [9] in vitro ont montré que la perte de la E-cadhérine dans des lignées cellulaires de carcinome humain est associée à une mauvaise différenciation et une morphologie fibroblastoïde. L'activation de l'EGF dépendante de l'EGFR a été rapportée être inhibée de manière E-cadhérine adhérence dépendant, qui inhibe l'activation dépendante du ligand des diverses tyrosine kinases du récepteur [10]. Nos recherches ont démontré que le knock-down de PKM2 a diminué l'activité de la E-cadhérine et a amélioré la /EGFR voie de signalisation de l'EGF dans les lignées cellulaires et BGC823 SGC7901 qui étaient positifs pour l'expression de la E-cadhérine. Toutefois, dans la lignée cellulaire gastrique de carcinome indifférencié AGS, qui est dépourvue d'expression E-cadhérine, PKM2 favorisé la migration cellulaire et l'invasion. Le but de cette étude était d'élucider la fonction et le mécanisme de PKM2 à l'égard de la motilité cellulaire dans les lignées cellulaires différemment différenciées.

Matériel et méthodes

Culture cellulaire, Conditions et Transfection

les lignées cellulaires de cancer gastrique humains BGC823 (peu différenciés, selon le fournisseur) et SGC7901 (modérément différencié) ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Hyclone, Logan, UT, USA). La lignée cellulaire AGS (indifférencié) a été cultivé dans un milieu F12K. Toutes les cellules ont été cultivées dans un milieu contenant 10% de sérum de veau fœtal (FBS) (Gibco, Detroit, MI, USA) et 100 UI /mL de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans un CO 5% _{2 atmosphère humidifiée. La gastrique lignée cellulaire de cancer humain AGS a été commandé auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC, USA), et les lignées cellulaires de cancer gastrique humains SGC7901 et BGC823 ont été obtenus à partir de Centre chinois de Type Culture Collection (Shanghai, Chine). SGC7901 cellules, et BGC823 AGS ont été transfectées avec le siPKM2 (pcPUR + U6 siPKM2) ou PU6 (pcPUR + U6 siRenilla) HD plasmide en utilisant FuGENE (Roche, Indianapolis, IN). Puromycine (0,1 pg /ml) a été utilisé pour cribler les clones stablement transfectés. L'expression de la protéine de PKM2 a été examinée par une analyse par transfert de Western en utilisant un anticorps contre PKM2 pour valider la capacité des constructions à inhiber l'expression d'un gène cible; Ces expériences ont été répétées trois fois. Les cultures de cellules ont été rendues quiescentes par leur culture jusqu'à la confluence et le milieu a été remplacé par du milieu frais contenant 0,5% de sérum pendant 1 jour. EGF à une concentration finale de 100 ng /ml a été utilisée pour la stimulation cellulaire. EGF a été obtenu à partir de Cell Signaling Technology.}

Knockdown stable de PKM2 et surexpression de PKM2

Un plasmide contenant une séquence d'ARN interférence qui a ciblé le gène PKM2 dans BGC823, les cellules SGC7901 et AGS était construit. L'oligonucléotide sens pour la séquence siPKM2 était 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 'et l'oligonucléotide anti-sens était 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. BGC-823, CGS-7901 et les cellules ont été transfectées avec AGS pcPUR + U6 + siPKM2 ou pcPUR U6 siRenilla (témoin) et sélectionnés en tant que clones résistants à la puromycine. L'analyse Western blot a été réalisée pour confirmer la suppression PKM2. Un plasmide contenant la séquence PKM2 ADNc a été obtenu auprès d'Invitrogen. Le BGC-823, SGC-7901 et les cellules AGS ont été transfectées avec pcDNA6.0-PKM2 ou pcDNA6.0-maquette (contrôle) et sélectionné en tant que clones résistants blasticidine. L'analyse Western blot a été effectuée pour confirmer l'expression PKM2.

Extraction des protéines et analyse par Western Blot

Les cellules ont été remises en suspension dans du tampon de lyse contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase, et les protéines extraites ont été séparés en utilisant 8-10% de gels de SDS-PAGE. ß-tubuline a été utilisé comme un contrôle de chargement. Les anticorps dirigés contre la E-cadhérine et le p-E-cadhérine ont été obtenus à partir Epitomics. Le phospho-EGFR (Tyr1068),,, /2 anticorps phospho-PLCγ1 (Tyr783) phospho-AKT (Ser473) phospho-Gab1 (Tyr627), phospho-c-cbl (Tyr700) et phospho-ERK1 (Thr202 /Tyr204) ont été obtenus à partir de Cell Signaling Technology.

Extraction de l'ARN, transcription inverse et en temps réel
PCR

l'ARN total a été extrait en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen, CA, USA). Les échantillons ont ensuite été traités avec de la DNase pendant 15 min à température ambiante, et l'ARN a été purifié en outre l'utilisation d'un kit de nettoyage ARN (Qiagen, CA, USA). La réaction de transcription inverse (RT) pour la synthèse du premier brin d'ADNc a été effectuée en utilisant la transcriptase inverse (Bio-Rad) avec 2 pg d'ARN total. L'analyse quantitative par RT-PCR a été réalisée avec l'ABI 7500 (Applied Biosystems), et les niveaux d'expression de gène pour chaque échantillon a été étalonnée par rapport à la GAPDH. L'expression génique moyenne relative a été déterminée et les différences ont été calculées en utilisant le 2 ^{-ΔΔCt méthode d'électrophorèse sur gel d'agarose. Les séquences d'amorce de RT-PCR étaient les suivantes: sens 5'- TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'et anti-sens 5'- GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' pour la N-cadhérine; sens 5'CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'et antisens 5'AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3' E-cadhérine; TGTATGGGGAACTGCTGACA sens 5'-3 'et anti-sens 5'- GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3' pour MMP7; sens 5'CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'et antisens 5'-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' pour GAPDH.}

Cellule Essai de prolifération

La prolifération cellulaire a été mesurée à l'aide de la cellule de comptage Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki gun, Kumamoto, Japan) selon les instructions du fabricant. En bref, les cellules ont été ensemencées dans quatre plaques de 96 puits à une densité de 2 x 10 ^{3 cellules /puits. Une plaque a été prise à la même heure chaque jour après que les cellules avaient adhéré aux puits. L'absorbance a été mesurée avec un lecteur de microplaques à une longueur d'onde de 450 nm. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.}

Transwell Invasion et Wound Healing Assays

Le Transwell essais d'invasion ont été réalisées avec des inserts de 8,0 um-pores dans un puits 24 Transwell plaque. La membrane basale a été hydraté avec 500 pl de milieu RPMI 1640 exempt de sérum ou F12K 30 min avant utilisation. Pour l'essai d'invasion, les lignées cellulaires de cancer gastrique ont été ajoutés à la chambre supérieure d'un Transwell avec 0,5 mg /ml de collagène de type l (BD Biosciences, San Jose, CA) doté d'un revêtement de filtres. Du RPMI 1640 ou F12K milieu avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de chaque antibiotique a été ajouté à la chambre inférieure. BGC et 7901 cellules ont été incubées pendant 36 heures. Les cellules AGS ont été incubées pendant 24 heures. Les cellules envahissantes ont été quantifiées après coloration de violet de gentiane. Chaque expérience a été réalisée en triple exemplaire, et les données ont été exprimées sous forme de valeurs moyennes. L'essai de cicatrisation a été réalisée dans des plaques à 6 puits. Les cellules tumorales dans un milieu contenant 10% de SBF ont été ensemencées dans des plaques 6 puits (Corning, CA). Les cultures de cellules ont été rendues quiescentes par leur culture jusqu'à la confluence et le milieu a été remplacé par du milieu frais contenant 0,5% de sérum pendant 1 jour. Plaies dans la monocouche ont été faites avec des embouts de pipette stériles. Ensuite, l'EGF avec une concentration finale de 100 ng /ml a été utilisée pour la stimulation cellulaire. Les cellules ont ensuite été lavées avec du PBS et rafraîchi avec un milieu contenant 10% de FBS. Les photographies ont été prises à 0 et 24 h. Toutes les expériences ont été réalisées en triple

Ethique Déclaration

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique (No: 20081012). À l'hôpital Zhongshan affilié à l'Université de Xiamen, Xiamen, province du Fujian, en Chine, et nous avons obtenu des déclarations de consentement écrit de tous les participants impliqués dans cette étude.

Préparation des échantillons
tissulaires

échantillons de tissus de la tumeur ont été recueillies auprès de 15 patients différents de cancer gastrique qui ont subi une résection curative à l'hôpital Zhongshan, Université de Xiamen, Xiamen, en Chine. Une série indépendante de tissus noncancerous adjacents de 15 des mêmes patients correspondant a été recueilli dans le même temps. Tous les échantillons de tissus ont été recueillis et divisés en deux parties immédiatement après la résection de la tumeur. Une partie a été recueilli dans de l'azote liquide et stocké à -80 ° C jusqu'à l'extraction d'ARN et de protéines. L'autre partie a été fixé à 4% de formaldéhyde et inclus dans de la paraffine pour l'analyse histologique (hématoxyline éosine et coloration IHC). Tous les échantillons ont été confirmés par un diagnostic pathologique (le diagnostic histopathologique a été fondée sur des critères de l'OMS). Tous les cas expérimentaux ont été regroupés à l'Union Internationale Contre-Node-Metastasis Tumor (TNM) système de stadification du cancer (révisée en 2002) ing accord.

immunohistochimie

sections de paraffine à quatre microns d'épaisseur ont été soit colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H & E), soit analysé pour PKM2, le p-ERK1 /2 et E-cadhérine expression par immunohistochimie. L'immunohistochimie a été réalisée selon les procédures recommandées par le fabricant. Les réactions ont été visualisées en utilisant de la diaminobenzidine en tant que substrat chromogène. Les sections ont été colorées en utilisant hématoxyline puis effacés et montés. La densité moyenne (IOD /région) a été détectée dans les différents domaines positifs des 15 spécimens de cancer gastrique humain en utilisant Image-Pro Plus logiciels.

Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant SPSS v13. 0 (SPSS, Inc.) logiciel. Les échantillons indépendants T essai et d'analyse de corrélation ont été utilisés pour comparer les données. Toutes les valeurs sont exprimées en tant que moyen ± SD. Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à P
<. 0.05

Appauvrissement de PKM2 Promu la migration cellulaire et l'invasion de

Résultats dans BGC823 et SGC7901 cellules avec EGF Stimulation

l'expression de la protéine dans les lignées PKM2 gastriques de cellules cancéreuses BGC823, SGC7901 AGS a été évaluée en utilisant une analyse par transfert de Western. Ces lignées cellulaires ont montré un haut niveau d'expression PKM2. Ensuite, gastriques lignées cellulaires cancéreuses stables avec une expression modifiée PKM2 ont été établies en utilisant l'interférence de l'ARN (PKM2 de knock-down) dans les cellules BGC823, SGC7901 et AGS. Comme on le voit sur la Fig. 1A, les lignées cellulaires BGC823, et SGC7901 AGS avec PKM2 knockdown ont été établies. Nous avons observé que la prolifération a été diminuée dans les cellules BGC823 et AGS après PKM2 a été épuisée (Fig. 1B). Ces résultats sont en accord avec les études précédentes.

Pour examiner l'effet de PKM2 sur la migration et l'invasion cellulaire, nous avons employé bien établi la guérison des plaies et Transwell essais pour caractériser la réponse de la motilité cellulaire dans la BGC823 et SGC7901 cellules . Une couche confluente de cellules a été incubée d'abord pendant une nuit dans un milieu, une blessure à la rayure a été introduite, un milieu contenant la dose la plus appropriée de l'EGF (100 ng /ml) ont été ajoutés pour stimuler la migration et le pourcentage de la plaie d'étanchéité a été observée après 24 h ( La figure S1). Les cellules ont été quantifiés envahissants 36 h après l'EGF (100 ng /ml) a été ajouté à la chambre inférieure. Les résultats indiquent que le traitement des BGC823-sipk et les cellules avec EGF SGC7901-sipk suite à une blessure à la rayure et à l'Transwell a augmenté de manière significative la vitesse de cicatrisation (Fig. 1 C, D) et de l'invasion (Fig. 1 E, F) par rapport à celle des cellules témoins.

Appauvrissement de PKM2 Diminué E-cadhérine expression et amélioré les activités du FEM /EGFR de signalisation en aval Pathways PLC-γ1 et ERK1 /2

Pour étudier la mécanisme de l'évolution de la migration et l'invasion cellulaire après le knockdown de PKM2, nous avons analysé l'expression des membres de la Ca ^{2 + adhésion cellulaire dépendante des molécules famille et métalloprotéinases. Nous avons constaté que les niveaux d'expression de la protéine E-cadhérine ont été diminuées dans BGC823 et SGC7901 cellules quand l'expression de PKM2 a été réduit (fig. 2A).}

Le niveau de E-cadhérine ARNm et la phosphorylation de la E-cadhérine ont été déterminées BGC823 et SGC7901 cellules avec PKM2 déplétion pour déterminer si la différence observée dans l'expression E-cadhérine a eu lieu avant ou post-traductionnelle. Nous avons observé la régulation négative de la E-cadhérine et une phosphorylation accrue de l'ARNm, ce qui induit l'endocytose de la E-cadhérine dans les cellules PKM2 appauvrie (Fig. 2A, B). Nous avons également constaté que le niveau de la protéine N-cadhérine expression a été augmentée dans les lignées cellulaires BGC823 et SGC7901 lorsque PKM2 était épuisé (Fig. 2A).

La migration cellulaire et l'invasion sont largement réglementées par l'activité de l'EGFR. Afin d'analyser si l'EGFR est impliquée dans la migration et l'invasion des cellules BGC823 et SGC7901, ces cellules ont été traitées avec l'EGF, qui se lie à l'EGFR et active les voies de signalisation en aval. Le traitement à l'EGF a entraîné la phosphorylation de l'EGFR et l'activation subséquente de l'PLCγ1, AKT et de ERK1 /2 voies (Fig. 2C). Nous avons constaté que PLC γ1 avait un niveau d'activité plus élevé dans les cellules PKM2 appauvri que dans les cellules de l'ONU appauvri après soit un (24 h) incubation courte ou longue avec EGF. Cependant, il n'y avait pas de différence marquée de l'activité de AKT entre les cellules PKM2 appauvri et des cellules non épuisées. PLCy est un régulateur clé de la migration cellulaire en aval de RTK de signalisation [11]. Phosphorylation sur tyrosine résidu 783 de PLCγ1 est essentielle à son activation [12]. l'activation PLCγ1 améliorée motilité cellulaire, et cet effet a été observé dans la plaie et gratter les dosages transwell, comme on l'observe sur la Fig. 1C.

Nous avons ensuite étudié l'effet d'un ligand de l'EGFR sur l'expression des MMPs à l'aide de RT-PCR dans BGC823-sipk et les cellules SGC7901-sipk par rapport à leurs cellules témoins respectifs. Le traitement avec le ligand de l'EGFR, EGF, amélioré l'expression de MMP au niveau de la transcription dans BGC823 et SGC7901 cellules. Cependant, il n'y avait pas de différence évidente entre les niveaux de MMP-2 et MMP9 entre les cellules PKM2 appauvrie et leurs cellules de contrôle d'expression (données non présentées). expression MMP7 a été régulée à la hausse dans les cellules PKM2 appauvri avec traitement à l'EGF (Fig. 2D). Les voies ERK /MAPK jouent un rôle critique dans l'EGFR induite par le ligand MMP7 expression. En outre, une augmentation évidente de ERK1 activité /2 a été observée après 0 h et 24 h de traitement avec EGF dans les cellules PKM2 appauvri.

Appauvrissement de PKM2 Atténuée la motilité des cellules AGS et les changements fonctionnels après Secourir PKM2 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique

l'expression de la protéine E-cadhérine dans les lignées cellulaires de cancer gastrique BGC823, SGC7901 et AGS a été évaluée par analyse par Western blot. Les lignées cellulaires expriment SGC7901 BGC823 et E-cadhérine. En revanche, les cellules AGS manquent E-cadhérine expression (Fig. 3A).

Pour examiner l'effet de PKM2 knockdown sur la migration et l'invasion cellulaire dans les cellules AGS, nous avons employé bien établi la guérison des plaies et Transwell essais à caractériser la motilité cellulaire. Une couche confluente de cellules a été mis en incubation pendant une nuit dans un milieu première, une égratignure de la plaie a été introduit un milieu contenant l'EGF (100 ng /ml) ont été ajoutés pour stimuler la migration et le pourcentage de la plaie d'étanchéité a été observée après 24 h. Les cellules qui envahissent dans l'essai transwell ont été quantifiés 24 h après l'EGF (100 ng /ml) a été ajouté à la chambre inférieure. A notre grande surprise, nous avons constaté que le traitement des cellules AGS-sipk avec EGF suivant le scratch de la plaie et dans le Transwell a diminué de manière significative le taux de blessure d'étanchéité et de l'invasion par rapport à celle des cellules témoins (Fig. 3B, C). Il y avait des différences évidentes entre les BGC823 /SGC7901 et les cellules AGS.

Pour illustrer davantage le rôle de PKM2 dans la motilité cellulaire, nous avons fait le PKM2 sauvetage des expériences. Nous taked de manière stable méthode transfectées en utilisant surexpression vecteur plasmidique pcDNA6.0-mock et pcDNA6.0-PKM2 pour faire face à BGC823 et AGS cellules qui knockdown stable PKM2. L'expression de p-EGFR, E-cadhérine ont été montrés dans les PKM2 sauvetage des expériences (Fig. 3D). Nous avons observé que lorsque l'expression de PKM2 récupéré, la phosphorylation de l'EGFR a considérablement réduit dans BGC823 cellules et a augmenté dans les cellules AGS. En outre, la motilité cellulaire des cellules BGC823 a diminué et les cellules AGS ont diminué après PKM2 sauvetage (Fig. 3E). Pour clarifier le mécanisme de ces différences, nous avons ensuite analysé l'activité du /EGFR voie de signalisation EGF.

PKM2 amélioré les activités du FEM /EGFR voies de signalisation en aval des cellules AGS et a été corrélée avec ERK activité dans gastrique des spécimens de cancer

pour analyser si l'EGFR peut être impliquée dans la migration et l'invasion des cellules AGS, ces cellules ont été traitées avec l'EGF, qui se lie à l'EGFR et active les voies de signalisation en aval. traitement à l'EGF a entraîné la phosphorylation de l'EGFR et l'activation subséquente des voies de l'EGFR en aval, y compris le PLCγ1 et ERK1 /2 voies (Fig. 4A). Nous avons constaté que les activités de PLCγ1 et ERK1 /2 étaient supérieures dans les cellules où PKM2 n'a pas été épuisée que dans les cellules PKM2 appauvri après un nombre (24 h) l'incubation de courte ou longue avec de l'EGF. Ce résultat est à l'opposé de ce qui a été observé avec le BGC823 et SGC7901 cellules; dans les cellules AGS, PKM2 est entré en jeu comme un stimulant et promu la migration cellulaire et l'invasion. Nous avons ensuite étudié l'expression de MMP7 par RT-PCR dans les cellules AGS sipk et les cellules témoins. Traitement avec une expression accrue de l'EGF MMP7 au niveau de la transcription dans les cellules AGS PU6 mais pas dans les cellules AGS sipk (Fig. 4B). L'activité de ERK1 /2 est évidemment plus élevée dans les cellules AGS-PU6 par rapport aux cellules AGS-sipk après 0 h et 24 h traitement avec EGF (Fig. 4A).

Nous avons ensuite effectué immunohistochimique (IHC) analyse à examiner l'expression E-cadhérine, PKM2 localisation et ERK1 /2 phosphorylation dans les sections en série de 15 échantillons de cancer gastrique humains en utilisant des anticorps avec des spécificités validées. La figure 4C montre que les niveaux d'expression de la E-cadhérine, ERK1 /2 phosphorylation, et l'expression cytoplasmique PKM2 sont corrélées entre elles. En outre, on a observé un niveau élevé de ERK1 /2 phosphorylation dans le noyau des cellules cancéreuses sans expression de la E-cadhérine. Dans les zones de ERK1 /2 phosphorylation, nous avons aussi trouvé des niveaux plus élevés d'expression de PKM2. Cependant, on n'a pas trouvé la phosphorylation de ERK1 /2 dans les zones positives pour l'expression E-cadhérine (Fig. 4C). Une analyse de corrélation entre les PKM2, E-cadhérine et P-ERK1 /2 a été réalisée à l'aide Image-Pro Plus logiciels (Fig. 4D). La densité moyenne (IOD /surface) a été enregistré dans les différentes zones positives de 15 spécimens de cancer gastrique humain. Nous avons trouvé une corrélation significative entre PKM2 et E-cadhérine dans les zones E-cadhérine-positive. De plus, il y avait une corrélation significative entre PKM2 et p-ERK1 /2 dans les zones E-cadhérine-négatif.

Discussion

Le stade invasif et métastatique de la progression du cancer est corrélée à un mauvais pronostic clinique et représente l'obstacle le plus redoutable à la réussite du traitement. Motilité cellulaire et l'invasivité sont les caractéristiques déterminantes des tumeurs malignes, qui permettent aux cellules tumorales de migrer dans les tissus adjacents ou en limitant les membranes basales et des matrices extracellulaires. Motilité cellulaire est nécessaire pour les processus physiologiques de réparation de la plaie et l'organogenèse et pour le processus pathologique de l'invasion tumorale [13]. les cellules tumorales invasives sont caractérisées par la motilité cellulaire dérégulée, en réponse à des signaux extracellulaires de facteurs de croissance et cytokines. Les tumeurs humaines expriment des niveaux élevés de facteurs de croissance et leurs récepteurs, et de nombreux types de cellules malignes semblent présenter une croissance autocrine- ou paracrine stimulée. Parmi les systèmes de récepteurs du facteur de croissance des plus bien étudiées est la famille des récepteurs d'EGF [14]. Les signaux provenant du milieu extracellulaire dictent la motilité cellulaire. De nombreux facteurs de croissance, y compris les ligands qui agissent par l'intermédiaire du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), d'améliorer la motilité cellulaire [15]. Au moins deux voies de signalisation intracellulaire distincts sont nécessaires pour la motilité cellulaire médiée par EGFR: les voies en utilisant γ PLC et de la voie de la MAP kinase. l'activité γ PLC a été proposé d'améliorer la mobilité cellulaire par la mobilisation des protéines d'actine de modification à partir d'une localisation associée à la membrane inactive à une cytosquelettique sous la membrane locale active [16]. Les MAP kinases Erk transmettent des signaux vers le noyau ainsi que des signaux qui régulent les connexions cellule-matrice.

Cadherins comprennent une grande famille de molécules d'adhésion cellule-cellule qui incluent le classique, desmosomal et cadhérines atypiques. E-cadhérine, qui est exprimée principalement dans les cellules épithéliales, est une protéine d'adhésion qui est codée par le gène et les fonctions CDH1 dans plusieurs processus, y compris le développement, l'intégrité des tissus, la migration cellulaire, la morphologie et la polarité [17], [18], [19]. E-cadhérine est également un suppresseur de tumeur dont l'expression est souvent réduit ou réduit au silence, et sa ré-expression peut induire la réversion morphologique [20], [21]. L'activation de l'EGF dépendante de l'EGFR a été rapportée être inhibée de manière E-cadhérine adhérence dépendant, qui inhibe l'activation dépendante du ligand des diverses tyrosine kinases de récepteur. La N-cadhérine, en tant que promoteur d'invasion, est souvent régulé à la hausse. L'expression de N-cadhérine dans les cellules épithéliales induit des changements dans la morphologie d'un phénotype fibroblastique, ce qui rend les cellules plus mobiles et invasive. Des études récentes indiquent que les cellules cancéreuses ont régulé à la hausse la N-cadhérine, en plus de la perte de la E-cadhérine. Ce changement dans l'expression de cadhérine est appelé le "switch cadhérine".

Nous avons observé une régulation de la E-cadhérine ARNm et une phosphorylation accrue, ce qui induit l'endocytose de la E-cadhérine, dans les cellules PKM2 appauvri. Nous avons également constaté que le niveau d'expression de la protéine N-cadhérine a été augmentée dans la lignée cellulaire BGC823 lorsque PKM2 a été déchargée. Le knockdown de PKM2 promu la migration cellulaire et l'invasion en BGC823 et SGC7901 cellules avec EGF stimulation. Une activité accrue de l'EGFR est le facteur critique dans la détermination de la motilité cellulaire et l'invasivité des cellules BGC823 et SGC7901. Nous avons émis l'hypothèse que la régulation négative de l'expression de la E-cadhérine a amélioré la phosphorylation de l'EGFR et activé les voies de signalisation en aval, qui comprennent PLCγ1 et ERK1 /2. activation de γ PLC améliore la motilité cellulaire et ERK1 2 activité /joue un rôle essentiel dans l'expression de MMP7.

Matrice métalloprotéinases (MMP) ont été impliqués dans l'invasion du cancer et des métastases en raison de leur matrice extracellulaire (ECM) activité -proteolytic [22]. MMP-7 a été rapportée comme étant produite par des cellules de carcinome gastrique et est significativement associée à des phénotypes pathologiques agressives du cancer gastrique [23]. MMP-7 peut activer pro-MMP-1, a une activité de stromélysine-like forte et dégrade l'élastine insoluble, collagène de type IV, la laminine-1, fibronectine, protéoglycanes et gélatines [24]. Les voies ERK /MAPK jouent un rôle crucial dans MMP7 expression induite par l'EGF [25].

E-cadhérine est une glycoprotéine d'adhésion cellulaire caractérisée pour la première fois dans les lignées cellulaires humaines par Shimoyama et al [26]. Son rôle dans le développement du cancer de l'estomac a été défini par Guilford et al [27]. Il existe une corrélation significative entre le degré d'expression de la E-cadhérine et le degré de différenciation de la tumeur, ainsi que le type histologique selon la Laurén et la classification de l'OMS. Les patients atteints de tumeurs E-cadhérine-positifs ont nettement meilleurs 3 et 5 ans le taux de survie que les patients avec E-cadhérine négatif tumeurs [28]. cancer gastrique héréditaire diffuse (HDGC) est un syndrome autosomique dominante rare qui est en grande partie attribuable à des mutations germinales et délétions dans le gène CDH1 associé à un début précoce, le cancer, chevalière type de cellule histologiquement diffus gastrique [29], [30].

Lim JY et al ont rapporté que l'expression de PKM2 était fortement corrélée avec la différenciation du cancer gastrique. types de cancers différenciés expriment plus de protéines PKM2 que les types indifférenciées; en revanche, plus l'expression de PKM2 est corrélée avec plus courte survie globale indépendante de l'étape dans les cancers de cellules chevalière. expression PKM2 pourrait être un facteur pronostique défavorable pour les carcinomes chevalière, qui manquent de E-cadhérine [7]. Ces résultats sont en accord avec nos travaux de recherche dans les cellules cancéreuses gastriques. Le BGC-823, SGC-7901 et des lignées de cellules AGS sont différemment types différenciés. E-cadhérine expression existe dans les lignées cellulaires SGC-7901 et BGC-823; En revanche, les cellules AGS ont été obtenues à partir du tissu malin adénocarcinome gastrique et le manque d'adhérence cellulaire E-cadhérine à médiation [31]. Nous avons observé que le knockdown de PKM2 a favorisé la migration et l'invasion des lignées cellulaires SGC-7901 et BGC-823, mais supprimé ces propriétés dans la lignée de cellules AGS. Un autre groupe a rapporté que la pyruvate kinase de type M2 est régulée positivement dans le cancer colorectal et le knock-down de PKM2 supprimé la prolifération et la migration des cellules cancéreuses du côlon RKO [32]. Nous savons que les cellules RKO manque l'expression de la E-cadhérine [33]. Immunohistochimie (IHC) L'analyse montre que les niveaux d'expression de la E-cadhérine, ERK1 /2 phosphorylation, et l'expression cytoplasmique PKM2 sont corrélées entre elles. Nous avons trouvé un niveau élevé de ERK1 /2 phosphorylation dans le noyau des cellules cancéreuses sans expression E-cadhérine, mais avec un haut niveau d'expression de PKM2.

Nous présumons que PKM2 atténue la motilité et l'invasion cellulaire lorsque la E-cadhérine est présent. Cette nouvelle fonction de PKM2 peut jouer un rôle dans l'inhibition réversible de la motilité et l'invasion cellulaire dans les premiers stades du cancer de l'estomac lorsque les cellules sont positives pour l'expression de la E-cadhérine. Au cours de la progression de la tumeur, l'absence ou très faible expression de la E-cadhérine induit une fonction agressive de PKM2 dans la tumeur. Le rôle biologique de PKM2 dans le développement de ces tumeurs doit encore être élucidé.

Informations complémentaires
Figure S1. The expression de la protéine d'EGFR dans les lignées cellulaires de cancer gastrique BGC823, et SGC7901 AGS a été évaluée en utilisant une analyse par transfert de Western. les cellules AGS ont montré un niveau d'expression de l'EGFR plus élevé que les deux autres lignées cellulaires. Il n'y a pas de différence significative entre BGC823 et SGC7901 cellules (Figure S1A). BGC cellules et cellules-PU6 BGC-sipk ont ​​été traitées avec différentes doses de l'EGF. Après 40 minutes, nous avons détecté le niveau de phosphorylation de l'EGFR. Nous avons trouvé que le plus haut niveau de phosphorylation de la dose de 100 ng /ml (figure S1B). Par conséquent, nous avons choisi la dose de 100 ng /ml comme le candidat le plus approprié. L'expérience Transwell a également montré la capacité plus forte à pénétrer le martrigel dans BGC823 cellules (Figure S1C)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0067542.s001
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