Фон и цели
<р> активации EGFR и экспрессия PKM2 играют важную роль в онкогенеза. активации EGFR регулирует функции PKM2 в субклеточных купе-зависимым образом и способствует транскрипции генов и рост опухоли. Кроме того, PKM2 позитивно регулируется рСКФ-индуцированных путей в глиомы злокачественных опухолей. Тем не менее, мы обнаружили, что PKM2 может также регулировать активность /EGFR сигнального пути EGF в клетках рака желудка. Нашей целью было определить биологические механизмы PKM2 в регуляции моторики клеток и вторжения.
Вывод:.
<Р> PKM2 могут играть разные роли в по-разному дифференцированной желудка рак типов, и этот вывод будет соответствовать предыдущим клиническим исследованиям. Результаты нашего исследования показывают важную связь между PKM2 и Е-кадгерина в ходе EGFR-стимулированной моторики желудка раковых клеток и инвазии
<р> Образец цитирования:. Ван LY, Лю Ю.П., Чэнь LG, Чэнь Ю.Л., Тан L, Лю JJ и др. (2013) пируваткиназа M2 играет двойную роль по регулированию /EGFR сигнализации EGF с помощью E-кадгерин-зависимым образом в клетках рака желудка. PLoS ONE 8 (6): e67542. DOI: 10.1371 /journal.pone.0067542
<р> Редактор: Хирому Suzuki, Саппоро медицинский университет, Япония
<р> Поступило: 7 февраля 2013; Принято: 20 мая 2013 года; Опубликовано: 28 июня 2013
<р> Copyright: © 2013 Wang и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
Финансирование:. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 30971362, 81072013 &Amp; 91229201), фундаментальных научных фондов для Центральной университетов в Китае (№ 2010111082) и Министерства здравоохранения Фонда государственного Key клинического отдела. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> Пируват киназа (PK) опосредует стадию окончательной ограничивающую скорость гликолиза по катализировать дефосфорилирование фосфоенолпируват (PEP) в пируват с образованием одной молекулы АТФ. Клетки млекопитающих, имеют четыре пируваткиназа изоферментов (M1, M2, L, и R), которые селективно экспрессируется в различных типах клеток и тканей [1]. У млекопитающих изоформа М1 (PKM1) выражается в большинстве тканей взрослого. Изоформы М2 (PKM2), альтернативно сращены вариант M1, экспрессируется во время эмбрионального развития [2]. Исследования показали, что раковые клетки исключительно выражают PKM2 [3], [4]. PKM2 было показано, что важно для аэробного гликолиза в опухолях (Варбург эффект). На протяжении многих лет значительные достижения были сделаны в понимании функции и регулирование PKM2 как пируват-киназы и протеинкиназу в раковых клетках [5]. Недавнее исследование подтвердило, что PKM2 индуцированный эпидермальный фактор роста (ЭФР) транслоцирует в ядро клетки глиобластомы, взаимодействует с бета-катенина и приводит к выражению cyclinD1, который способствует пролиферации клеток и онкогенеза [6]. Эти результаты показывают новую роль PKM2 как транскрипционный коактиватора. Тем не менее, есть некоторые противоречия, касающиеся специфики и потенциала PKM2 в качестве мишени противораковое в терапии рака. Недавнее открытие показало, что экспрессия PKM2 сильно коррелирует с желудочным дифференцировки рака. Дифференцированные типы рака выражают больше PKM2 белка, чем сделать недифференцированные из них. PKM2 был неблагоприятным прогностическим фактором при перстневидно клеточного рака желудка [7]. Биологическая роль PKM2 в различных фазах дифференциации и в развитии рака желудка необходимо дополнительно выяснены.
<Р> Предыдущие исследования относительно PKM2 были сосредоточены на метаболизм опухоли и рост опухоли. Там было всего несколько сообщений о метастазирование опухоли. Е-кадгерин играет критическую роль в поддержании целостности эпителиальной, а потеря Е-кадгерина влияет на клейкую репертуар в [8] ячейке. Предыдущие исследования [9] в пробирке показали, что потеря Е-кадгерина в линиях клеток карциномы человека ассоциируется с плохим дифференциации и fibroblastoid морфологии. ЭФР-зависимой активации EGFR, как сообщается, ингибируется в Е-кадгерина адгезии-зависимым образом, котора ингибирует лиганд-зависимой активации различных рецепторных тирозинкиназ [10]. Наши исследования показали, что нокдаун PKM2 снижало активность Е-кадгерина и повысило /EGFR сигнального пути EGF в клеточных линиях BGC823 и SGC7901, которые были положительными для экспрессии E-кадгерина. Тем не менее, в недифференцированной карциномы желудка клеточной линии AGS, которая испытывает недостаток экспрессии Е-кадгерина, PKM2 способствует миграции клеток и инвазии. Целью данного исследования было выяснение функции и механизм PKM2 в отношении подвижности клеток в по-разному дифференцированных клеточных линий.
Культура клеток, условия и Трансфекция
<р> линии клеток желудка человека BGC823 (слабо дифференцированы, в зависимости от поставщика) и SGC7901 (умеренно дифференцированная) культивировали в среде RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, USA). Клеточная линия AGS (недифференцированные) культивировали в F12K среде. Все клетки культивировали в среде, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Гибко, Детройт, Мичиган, США) и 100 МЕ /мл пенициллина-стрептомицина, при 37 ° С в 5% CO <суб> 2 увлажненной атмосфере с. Желудка человека линии клеток рака АГС был заказан из Американской коллекции типовых культур (АТСС, США), и линии клеток желудка человека SGC7901 и BGC823 были получены из Китая Центра коллекции типовых культур (Shanghai, China). SGC7901, BGC823 и AGS клетки трансфицировали с siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) или PU6 плазмиды (pcPUR + U6-siRenilla) с использованием Fugene HD (Roche, Indianapolis, IN). Пуромицин (0,1 мкг /мл) использовали для скрининга для стабильно трансфицированных клонов. Экспрессия белка PKM2 исследовали с Вестерн-блот-анализа с использованием антитела против PKM2 для проверки способности конструкций, чтобы ингибировать экспрессию гена-мишени; эти опыты были повторены три раза. Клеточные культуры были сделаны в состоянии покоя путем выращивания их до слияния, и среду заменяли свежей средой, содержащей 0,5% сыворотки в течение 1 дня. ЭФР с 100 нг /мл конечной концентрации использовали для стимуляции клеток. EGF был получен из Cell Signaling Technology.
Экстракция РНК, обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени пролиферации клеток Анализ Этика Заявление Получение образцов тканей Четыре микронной толщины парафиновых срезов были либо окрашивали гематоксилином и эозином (H &Amp; E) или анализировали на содержание PKM2, п-ERK1 /2 и Е-кадгерина экспрессии с помощью иммуногистохимии. Иммуногистохимическое проводили в соответствии с методиками, которые были рекомендованы производителем. Реакции визуализировали с использованием диаминобензидина в качестве хромогенного субстрата. Срезы контрастировали с использованием гематоксилин, а затем очищается и устанавливается. Средняя плотность (IOD /область) была обнаружена в различных положительных областях 15 образцов рака желудка человека с использованием Image-Pro Plus программное обеспечение. Истощение PKM2 продвигаемых миграции клеток и вторжения в BGC823 и SGC7901 Клетки с EGF стимуляции Истощение PKM2 Снижение E-кадгерина Expression и Enhanced с деятельностью EGF /EGFR Downstream путей передачи сигналов PLC-Г1 и ERK1 /2 Матричные металлопротеиназы (ММР) вовлечены в инвазии и метастазирования рака из-за их внеклеточного матрикса (ECM) -proteolytic активность [22]. ММР-7 было сообщено быть получен желудочных клеток карциномы и значительно связан с агрессивным фенотипы рака желудка [23]. ММР-7 может активировать про-ММР-1, имеет сильную стромелизин-подобную активность и деградирует нерастворимый эластин, коллаген типа IV, ламинин-1, фибронектин, протеогликанов и желатины [24]. Пути ERK /MAPK играют решающую роль в EGF-индуцированной экспрессии MMP7 [25].
<р> Суммарную РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, CA, USA). Образцы затем обрабатывали ДНКазой в течение 15 мин при комнатной температуре, а РНК дополнительно очищали с использованием РНК очистки (Qiagen, Калифорния, США). Реакцию обратной транскрипции (RT) для синтеза первой цепи кДНК синтеза проводили с использованием обратной транскриптазы (Bio-Rad) с 2 мкг тотальной РНК. Анализ количественной ОТ-ПЦР проводили с ABI 7500 (Applied Biosystems), а уровни экспрессии генов для каждого отдельного образца были нормированы на GAPDH. Выражение средний относительный ген определяли и различия были рассчитаны с использованием 2 -ΔΔCt методом электрофореза в агарозном геле. Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР были следующими: смысл 5'- TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'и антисмысловой 5'- GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' для N-кадгерин; Чувство 5'- CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'и антисмысловой 5'- AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3' для Е-кадгерин; Чувство 5'- TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'и антисмысловой 5'- GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3' для MMP7; чувство 5'- CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'и 5'-антисмысловой CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' для GAPDH.
<р> пролиферации клеток измеряли с использованием клеточной Counting Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki -gun, Кумамото, Япония) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, клетки были высеяны в четырех 96-луночные планшеты при плотности 2 × 10 3 клеток /лунку. Одна пластина вынимали в то же время каждый день после того, как клетки были приклеены к скважинам. Оптическую плотность измеряли при помощи микропланшет-ридере при длине волны 450 нм. Все эксперименты проводились в трех экземплярах.
Transwell Invasion и заживлении ран
Assays <р> Transwell нашествие анализы проводили с 8,0-мкм порами вставок в 24-луночного Transwell пластины. Базальная мембрана гидратируют с 500 мкл бессывороточной среды RPMI 1640 или F12K среде 30 мин перед использованием. Для анализа вторжения, клетку рака желудка линии были добавлены к верхней камере Transwell с 0,5 мг /мл коллагена типа л (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния) -покрытие фильтры. Среду RPMI 1640 или F12K среде с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% каждого антибиотика добавляли в нижнюю камеру. КУП и 7901 клетки инкубировали в течение 36 часов. Клетки AGS инкубировали в течение 24 часов. Захватчики клетки были количественно определены после генцианвиолету окрашивания. Каждый эксперимент проводили в трех повторах, и данные выражали в виде средних значений. Ранозаживляющие анализ проводили в 6-луночных планшетах. Опухолевые клетки в среде, содержащей 10% FBS, высевали в 6-луночные планшеты (Corning, Калифорния). Клеточные культуры были сделаны в состоянии покоя путем выращивания их до слияния, и среду заменяли свежей средой, содержащей 0,5% сыворотки в течение 1 дня. Раны в монослое были сделаны с стерильные наконечники пипеток. Затем ЭФР с 100 нг /мл конечной концентрации использовали для стимуляции клеток. Затем клетки промывали ФСБ и обновляется средой, содержащей 10% FBS. Фотографии были сделаны при 0 и 24 ч. Все эксперименты проводились в трех экземплярах
<р> Это исследование было одобрено Комитетом по этике (№: 20081012) мимо. В больнице Чжуншань аффилированной с Xiamen University, Сямэнь, провинция Фуцзянь, Китай, и мы получили письменные заявления согласие от всех участников, участвующих в данном исследовании.
<р> образцы опухолевой ткани были собраны из 15 различных больных раком желудка, перенесших резекцию целебное в больнице Чжуншань, Xiamen университет, Сямынь, Китай. Независимая серия соответствующими смежными нераковых тканей от 15 того же пациентов собирали в то же время. Все образцы ткани были собраны и разделены на две части сразу после резекции опухоли. Одна часть была собрана в жидкий азот и хранили при -80 ° С до тех пор, РНК и белка экстракции. Другая часть фиксировали в 4% -ном формалине и заливали в парафин для гистологического анализа (гематоксилин эозином и IHC окрашивание). Все образцы были подтверждены патологический диагноз (Гистопатологическая диагноз был основан на критериях ВОЗ). Все экспериментальные случаи группировались Аккорд-ING Международного союза против рака Опухоли-Node-(TNM метастазы) постановка системы (пересмотренной в 2002 году).
Immunohistochemistry
Статистический анализ
<р> Статистический анализ проводили с помощью программы SPSS V13. 0 (SPSS, Inc.) программное обеспечение. Независимые-T Образцы испытаний и корреляционный анализ использовали для сравнения данных. Все величины выражены как среднее значение ± SD. Различия считались статистически значимыми при P
&л;. 0,05
Результаты
<р> экспрессия белка PKM2 в желудочном линиях раковых клеток BGC823, SGC7901 и АГС оценивали с помощью вестерн-блот анализ. Эти клеточные линии показали высокий уровень экспрессии PKM2. Затем были созданы стабильные желудочные линии раковых клеток с измененным выражением PKM2 с помощью РНК-интерференции (PKM2 нокдаун) в клетках BGC823, SGC7901 и AGS. Как показано на рис. 1А, были созданы клеточные линии BGC823, SGC7901 и AGS с PKM2 нокдаун. Мы наблюдали, что распространение было снижено в клетках BGC823 и AGS после PKM2 истощалась (рис. 1В). Эти результаты согласуются с предыдущими исследованиями.
<Р> Для изучения влияния PKM2 на миграцию клеток и вторжения, мы использовали устоявшихся ранозаживляющие и Transwell анализы, чтобы характеризующие реакцию подвижности клеток в BGC823 и SGC7901 клеток , Сливающийся слой клеток сначала инкубировали в течение ночи в среде, царапина рана была введена, среда, содержащая наиболее подходящую дозу EGF (100 нг /мл) был добавлен, чтобы стимулировать миграцию, и наблюдали через 24 ч (процент герметизации раны Рисунок S1). Захватчики клетки были количественно 36 ч после того, как EGF (100 нг /мл) добавляли в нижнюю камеру. Полученные результаты свидетельствуют о том, что лечение BGC823-sipk и SGC7901-sipk клеток с EGF после скретч раны и в Transwell значительно увеличивает скорость заживления ран (рис. 1 С, D) и инвазии (рис. 1 E, F) сравнению с контрольными клетками.
<р> Для того, чтобы исследовать механизм изменений в клеточной миграции и инвазии после нокдауна PKM2, мы проанализировали экспрессию членов Ca 2 + -зависимая адгезию клеток молекулы семьи и металлопротеиназы. Мы обнаружили, что уровни экспрессии E-кадгерина белка были снижены в BGC823 и SGC7901 клетки, когда экспрессия PKM2 была снижена (рис. 2А).
<Р> Уровень Е-кадгерин мРНК и фосфорилирования Е-кадгерина были определены в BGC823 и SGC7901 клетки с истощением PKM2 оценить, произошло ли наблюдаемая разница в экспрессии Е-кадгерина до или после поступательно. Мы наблюдали понижающую регуляцию E-кадгерина мРНК и увеличение фосфорилирования, которое индуцирует эндоцитоз Е-кадгерина, в PKM2 обедненного клетки (рис. 2А, В). Мы также обнаружили, что уровень экспрессии белка N-кадгерин был увеличен в клеточных линиях BGC823 и SGC7901 когда PKM2 истощалась (рис. 2А).
<Р> Миграция клеток и вторжение в значительной степени регулируются EGFR активностью. Чтобы проанализировать, будет ли EGFR участвует в миграции и инвазии BGC823 и SGC7901 клеток, эти клетки обрабатывали EGF, который связывается с EGFR и активирует сигнальные пути вниз по течению. Лечение ЭФР привело к фосфорилирования EGFR и последующей активации PLCγ1, АКТ и ERK1 /2 путей (рис. 2С). Мы обнаружили, что PLC γ1 имели более высокий уровень активности в PKM2 обедненного клеток, чем в не-обедненного клетки после любого короткого или длительного (24 ч) инкубации с EGF. Тем не менее, не было никакой заметной разницы в активности AKT между PKM2 обедненного клеток и не-истощенных клеток. PLCγ является ключевым регулятором клеточного миграции вниз по течению РТК сигнализации [11]. Фосфорилирование на остаток тирозина 783 из PLCγ1 имеет решающее значение для его активации [12]. активация PLCγ1 усиливается подвижность клеток, и этот эффект наблюдался в ране скретч и Transwell анализов, как это наблюдается на рис. 1С.
<Р> Далее мы исследовали влияние на EGFR лиганда на экспрессию ММР с использованием RT-PCR в BGC823-sipk и SGC7901-sipk клеток по сравнению с соответствующими контрольными клетками. Лечение с EGFR лиганда, EGF, усиливал экспрессию ММР на уровне транскрипции в BGC823 и SGC7901 клеток. Тем не менее, не было никаких очевидных различий в уровне экспрессии ММР2 и ММР9 между PKM2 обедненного клетками и их контрольными клетками (данные не показаны). Выражение MMP7 было повышающей регуляции в PKM2 обедненного клетки с EGF обработки (фиг. 2D). Пути ERK /MAPK играют решающую роль в экспрессии MMP7 лиганд-индуцированной EGFR. Кроме того, было отмечено очевидное увеличение ERK1 /2 активности после 0 ч и 24 ч лечения с EGF в PKM2 обедненного клетки.
Истощение PKM2 уменьшал Подвижность AGS клеток и функциональных изменений после Спасая PKM2 в рак желудка клеточных линий
<р> экспрессия белка Е-кадгерина в желудочном линиях раковых клеток BGC823, SGC7901 и AGS оценивали с Вестерн-блот-анализа. Клеточные линии BGC823 и SGC7901 выразить Е-кадгерина. В противоположность этому, AGS клетки лишены экспрессии E-кадгерина (рис. 3А).
<Р> Для изучения влияния PKM2 нокдаун на клеточной миграции и инвазии в AGS клетках, мы использовали устоявшихся ранозаживляющие и Transwell анализы на характеризуют подвижность клеток. Сливающийся слой клеток сначала инкубировали в течение ночи в среде, рана царапина была введена, среда, содержащая EGF (100 нг /мл) был добавлен, чтобы стимулировать миграцию, и наблюдали через 24 ч процент герметизации раны. Захватчики клетки в анализе Transwell количественно определяли через 24 ч после того, как EGF (100 нг /мл) добавляли в нижнюю камеру. К нашему удивлению, мы обнаружили, что лечение АГС-sipk клеток с EGF после раны нуля и в Transwell значительно снижало скорость герметизации раны и инвазии сравнению с контрольными клетками (рис. 3б, в). Были заметные различия между BGC823 /SGC7901 и AGS клеток.
<Р> Для дальнейшей иллюстрации роли PKM2 в подвижности клеток, мы сделали PKM2 спасения экспериментов. Мы taked стабильно трансфицировали метод с помощью сверхэкспрессии вектор плазмиды pcDNA6.0-насмешка и pcDNA6.0-PKM2 иметь дело с BGC823 и AGS клеток, которые стабильны нокдаун PKM2. Выражение п-EGFR, E-кадгерина были показаны в PKM2 спасении экспериментов (фиг. 3D). Мы заметили, что, когда выражение PKM2 выздоровел, фосфорилирование EGFR значительно снижается в BGC823 клеток и увеличение в AGS клетках. Кроме того, была снижена подвижность клеток из клеток BGC823 и AGS клетки снизился после PKM2 спасения (рис. 3е). Для выяснения механизма этих различий, мы затем анализировали активность /EGFR сигнального пути EGF.
PKM2 Улучшены деятельности нижестоящего путей передачи сигналов EGF /EGFR в AGS клетках и коррелировала с ERK активность в желудочном Рак Особи
<р> чтобы проанализировать, может ли быть задействована EGFR в миграции и инвазии AGS клеток, эти клетки обрабатывали EGF, который связывается с EGFR и активирует сигнальные пути вниз по течению. Лечение ЭФР привело к фосфорилирования EGFR и последующей активации нисходящих путей EGFR, в том числе PLCγ1 и ERK1 /2 путей (рис. 4, а). Мы обнаружили, что деятельность PLCγ1 и ERK1 /2 было больше в клетках, где PKM2 не истощенных, чем в PKM2 обедненного клетки после любого короткого или длительного (24 ч) инкубации с EGF. Этот результат является противоположным тому, что наблюдалось с BGC823 и SGC7901 клеток; в AGS клетках, PKM2 вступил в игру в качестве стимула и способствует миграции клеток и вторжения. Затем мы исследовали экспрессию MMP7 с помощью ОТ-ПЦР в АГС-sipk клеток и контрольных клеток. Лечение с помощью EGF усиливает экспрессию MMP7 на уровне транскрипции в АГС-pu6 клетках, но не в AGS-sipk клетках (фиг. 4B). Активность ERK1 /2 был явно выше в АГС-pu6 клеток по сравнению с АГС-sipk клеток после 0 ч и 24 ч лечения с EGF (рис. 4А).
<Р> Затем мы проводили иммуногистохимическое (IHC) анализы изучить экспрессию Е-кадгерина, локализация PKM2 и ERK1 /2 фосфорилирования в серийных срезов 15 образцов рака желудка человека с использованием антител с валидированных специфичностью. Рисунок 4C показывает, что уровни экспрессии Е-кадгерина, ERK1 /2 фосфорилирования и цитоплазматической экспрессии PKM2 коррелировали друг с другом. Кроме того, мы наблюдали высокий уровень ERK1 /2 фосфорилирования в ядрах раковых клеток без экспрессии Е-кадгерина. В районах ERK1 /2 фосфорилирования, мы также обнаружили более высокие уровни экспрессии PKM2. Тем не менее, мы не нашли фосфорилирование ERK1 /2 в областях положительных для Е-кадгерина выражении (рис. 4в). Анализ корреляции между PKM2, Е-кадгерина и P-ERK1 /2 проводили с использованием Image-Pro Plus программного обеспечения (рис. 4). Средняя плотность (IOD /область) был зафиксирован в различных положительных областях 15 образцов рака желудка человека. Мы обнаружили значительную корреляцию между PKM2 и Е-кадгерина в Е-кадгерин-позитивных областях. Кроме того, существует значительная корреляция между PKM2 и п-ERK1 /2 в Е-кадгерин-отрицательных областей.
Обсуждение
<р> инвазивной и метастатической стадии прогрессирования рака коррелирует с плохим клиническим прогнозом и представляет собой наиболее серьезное препятствие для успешного лечения. Подвижность клеток и инвазии являются определяющими характеристиками злокачественных опухолей, которые дают возможность опухолевым клеткам мигрировать в соседние ткани или через ограничение базальные мембраны и внеклеточной матрицы. Подвижность клеток необходима для физиологических процессов заживления ран и органогенеза и для патологического процесса инвазии опухоли [13]. Инвазивные опухолевые клетки характеризуются дизрегуляции подвижности клеток в ответ на внеклеточные сигналы от факторов роста и цитокинов. Опухолей человека экспрессируют высокие уровни факторов роста и их рецепторов, а также многих типов злокачественных клеток, по-видимому, проявляют autocrine- или паракринной-стимулируемого роста. Среди наиболее хорошо изученных систем рецептора фактора роста является рецептор EGF семейство [14]. Сигналы от внеклеточную среду диктуют подвижность клеток. Многие факторы роста, в том числе лигандов, которые действуют через рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), усиливают подвижность клеток [15]. По крайней мере два различных внутриклеточных сигнальных путей необходимы для EGFR-опосредованной клеточной подвижности: тропы, использующие PLC Г и MAP киназы. γ активность PLC, было предложено повысить подвижность клеток за счет мобилизации актином модификации белков из неактивного ассоциированных с мембранами локализации к активной суб-мембрана цитоскелета местности [16]. В MAP киназ Эрк передают сигналы к ядру, а также сигналы, которые регулируют клеточно-матричные соединения.
<Р> Кадгерины содержат большое семейство молекул межклеточной адгезии, которые включают классическую, десмосом и атипичные Кадгерины. Е-кадгерин, которая выражается прежде всего в эпителиальных клетках, представляет собой белок адгезии, который кодируется геном и функции CDH1 в нескольких процессов, в том числе развитие, целостность тканей, миграции клеток, морфологии и полярности [17], [18], [19]. Е-кадгерин также является супрессоров опухоли, экспрессия которого часто снижается или немоты, и его повторное выражение может вызвать морфологическую реверсии [20], [21]. ЭФР-зависимой активации EGFR, как сообщается, ингибируется в Е-кадгерина адгезии-зависимым образом, котора ингибирует лиганд-зависимой активации различных рецепторных тирозинкиназ. N-кадгерина, как вторжение промотора, часто повышающей регуляции. Выражение N-кадгерина в эпителиальных клетках вызывает изменения в морфологии к фибробластического фенотипа, что делает клетки более подвижны и инвазивными. Недавние исследования указывают на то, что раковые клетки имеют повышающей регуляции N-кадгерина в дополнение к потере Е-кадгерина. Это изменение в выражении кадгеринового называется "кадгерин переключатель".
<Р> Мы наблюдали понижающую регуляцию Е-кадгерин мРНК, так и повышенной фосфорилирования, который вызывает эндоцитоз Е-кадгерина, в PKM2 обедненного клетки. Мы также обнаружили, что уровень экспрессии белка N-кадгерин был увеличен в клеточной линии BGC823 когда PKM2 был исчерпан. Нокдаун PKM2 способствует миграции клеток и вторжения в BGC823 и SGC7901 клетки с EGF стимуляции. Повышенная активность EGFR является критическим фактором при определении моторику клеток и инвазивность BGC823 и SGC7901 клеток. Мы предположили, что понижающая регуляция экспрессии E-кадгерина усиливает фосфорилирование EGFR и активировали вниз по течению сигнальных путей, которые включают PLCγ1 и ERK1 /2. PLC активации γ улучшает подвижность клеток, и ERK1 2 активность /играет критическую роль в выражении MMP7.
<Р> Е-кадгерин является клеточной адгезии гликопротеин характеризуется впервые в клеточных линиях человека с помощью Shimoyama и др [26]. Его роль в развитии рака желудка была впервые определена Гилфорд и др [27]. Существует значительная корреляция между степенью экспрессии Е-кадгерина и степени дифференцировки опухоли, а также гистологического типа в соответствии с Lauren и классификации ВОЗ. У больных с Е-кадгерин-позитивных опухолей имеют значительно лучшие показатели выживаемости 3- и 5-летних, чем у больных с Е-кадгерин-негативных опухолей [28]. Наследственные диффузный рак желудка (HDGC) является редким аутосомно-доминантный синдром, который в значительной степени объясняется зародышевые мутации и делеции в гене CDH1, связанной с ранним началом, гистологическое диффузный, печатка кольцо типа клеток рака желудка [29], [30].
<р> Лим JY и др сообщили, что экспрессия PKM2 сильно коррелирует с желудочным дифференцировки рака. Дифференцированные типы рака выражают больше белка, чем PKM2 недифференцированных типов; в отличие от этого, выше выражение PKM2 коррелирует с более короткой общей выживаемости независимой стадии рака перстень клеток. Выражение PKM2 может быть неблагоприятным прогностическим фактором для клеточных карцином перстень, которые испытывают недостаток Е-кадгерина [7]. Эти результаты находятся в соответствии с нашим исследований в области клеток рака желудка. КУП-823, SGC-7901 и линии AGS клеточные типы дифференцированных по-разному. Выражение Е-кадгерин существует в SGC-7901 и КУП-823 клеточных линий; В противоположность этому, клетки AGS были получены из злокачественной ткани аденокарциномы желудка и отсутствие клеточной адгезии Е-кадгерин-опосредованной [31]. Мы наблюдали, что нокдаун PKM2 способствовали миграции и вторжения в SGC-7901 и КУП-823 клеточных линий, но подавил эти свойства в клеточной линии AGS. Другая группа сообщила, что пируват киназы типа М2 усиливается в колоректального рака, а нокдаун PKM2 подавлял пролиферацию и миграцию рака толстой кишки РКО клеток [32]. Мы знаем, что РКО клетки лишены экспрессии Е-кадгерина [33]. Иммуногистохимическое (IHC) анализ показывает, что уровни экспрессии Е-кадгерина, ERK1 /2 фосфорилирования и цитоплазматической экспрессии PKM2 коррелировали друг с другом. Мы обнаружили высокий уровень ERK1 /2 фосфорилирования в ядре раковых клеток без экспрессии Е-кадгерина, но с высоким уровнем экспрессии PKM2.
<Р> Мы предполагаем, что PKM2 ослабляется подвижность клеток и инвазии, когда Е-кадгерин настоящее время. Эта новая функция PKM2 может играть определенную роль в обратимого ингибирования клеточной подвижности и инвазии на ранних стадиях рака желудка, когда клетки являются положительными для экспрессии Е-кадгерина. В ходе прогрессии опухоли, отсутствие или очень низкой экспрессии Е-кадгерина вызывает агрессивную функцию PKM2 в опухоли. Биологическая роль PKM2 в развитии этих опухолей должны быть дополнительно выяснены.
Поддержка Информация рис S1
.
Экспрессия белка EGFR в желудочном линиях раковых клеток BGC823, SGC7901 и AGS оценивали с помощью вестерн-блот анализ. AGS клетки показали более высокий уровень экспрессии EGFR, чем в двух других клеточных линий. Там нет существенной разницы между BGC823 и SGC7901 клетками (рис S1a). КУП-pu6 клетки и КУП-sipk клетки обрабатывали различными дозами EGF. Через 40 минут мы обнаружили уровень фосфорилирования для EGFR. Мы нашли самый высокий уровень фосфорилирования в дозе 100 нг /мл (рис s1b). Поэтому мы выбрали дозу 100ng /мл в качестве наиболее подходящего кандидата. Эксперимент Transwell также показали более высокую способность проникать в martrigel в BGC823 клетках (Рисунок S1c)
DOI:. 10,1371 /journal.pone.0067542.s001
(TIF)
Растительная диета может вылечить ревматоидный артрит
Бактериальные изменения кишечника влияют на результаты лечения волчанки во время беременности
Пациенты с СРК могут получить пользу от добавок витамина D,
Исследование предполагает связь между употреблением пробиотиков и «затуманенностью мозга».
Новый метод компьютерного моделирования предсказывает, как микробы кишечника меняются с течением времени
Математическая модель выявляет риск заражения SARS-CoV-2 после трансплантации фекальной микробиоты
Микробиота кишечника может предсказать тяжесть COVID-19
Пандемия COVID-19 распространяется во все уголки мира. Но не все заболевают одинаково. Новое исследование опубликовано на сервере препринтов medRxiv в апреле 2020 года предполагает, что состав микро
Новое исследование определяет связь между микробиомом кишечника и инсультами.
Недавнее исследование, проведенное в клинике Кливленда, демонстрирует влияние диеты с высоким содержанием холина, который часто содержится в большом количестве в красном мясе и яичных желтках, и триме
Устойчивость к антибиотикам удвоится всего за два десятилетия
Устойчивость к антибиотикам представляет собой серьезную проблему для многих ранее излечимых инфекционных заболеваний. В настоящий момент, Доказано, что устойчивость к антибиотикам растет гораздо быст