Ploche ONE: Úloha DPY30 v šírení a pohyblivosti žalúdka nádorových buniek

Abstraktné

Rôzne typy Histon metylácie boli spojené s progresiou rakoviny. V závislosti na mieste metylácie v histonové proteíny, jeho účinky na transkripciu sú rôzne. DPY30 je obyčajný člen SET1 /MLL histónov H3K4 metyltransferáza komplexov. Avšak jeho expresie a úloha u karcinómu žalúdka boli zle charakterizovaná. Ak chcete zistiť, či DPY30 má patologické úloha v karcinómu žalúdka, boli skúmané jeho expresie a úloha. Imunohistochemické vyšetrenie a PCR v reálnom čase ukázala, up-regulácia expresie DPY30 v niektorých bunkových línií karcinómu žalúdka a tkanív pacientov. Jeho knockdown tým siRNA znížili proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, zatiaľ čo jeho nadmerná expresia ukázala, opačný účinok. Tieto výsledky ukazujú, že DPY30 má kľúčovú úlohu v proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, a naznačujú, DPY30 môže byť terapeutickým cieľom v karcinómu žalúdka

Citácia :. Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) Úloha DPY30 v šírení a Pohyblivosť žalúdočné rakovinové bunky. PLoS ONE 10 (7): e0131863. doi: 10,1371 /journal.pone.0131863

Editor: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, Spojené štáty

Prijaté: 3. marca 2015; Prijaté: 08.6.2015; Uverejnené: 06.07.2015

Copyright: © 2015 Lee et al. Toto je článok o otvorenej distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Data Dostupnosť: Všetky relevantné údaje sú v novinách

Financovanie :. Táto práca bola podporená Bio & Medical Technology Development Program (É2M3A9C6050213, OSO) a základná vedecká nadácia pre výskum (É2R1A1A3010521, HME) Národná nadácia pre výskum (NRF) financovaný kórejskou vládou (MEST) a grantom z Národného R &D program pre onkologický, Ministerstvo zdravotníctva, sociálnej starostlivosti a rodinné záležitosti, Kórejská republika (\0050, OSO). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Kovalentná modifikácia histónov chvostov, ako je napríklad, acetylácia, fosforylácie, ubikvitinace a metylácie, modulovať štruktúru chromatínu a hrajú kľúčovú úlohu v regulácii progresie bunkového cyklu, génovú transkripciu, opravu DNA, embryonálneho vývoja, a bunková diferenciácia [1, 2]. Kým zvýšená Acetylácia histónov je všeobecne spojená s transkripčný aktiváciu sa metylácie Histon koreluje s transkripčný aktivácie a represie. Napríklad metylácie Histon H3 na lyzínu 9, 20, alebo 27 zvyškov (H3K9, H3K20 alebo H3K27) sa podieľa na transkripčný umlčanie génu, ale na druhú stranu, metylácie na H3K4, H3K36 alebo H3K79 je spojená s otvoreným chromatínu a aktívny transkripcie génov [3].

U cicavcov, mono-, di- a tri-metyláciou H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 a H3K4me3) sa vykonáva pomocou šiestich rôznych set1 /MLL rodinných komplexov (set1, SET1B , MLL1, MLL2, MLL3 a MLL4) [4, 5]. Tieto H3K4 metyltransferáza (H3K4MT) obsahujú rôzne katalytické podjednotky a činnosti všetkých šiestich rodinných komplexy sú riadené spoločnými multi-podjednotky základné súčasti, ktorých súčasťou WDR5, RBBP5, ASH2L a DPY30, a sú tiež označované ako WRADs. [6-9]. Strata akéhokoľvek podjednotky WRAD zložitých vedie k zníženej H3K4 metylácie. WDR5 a RBBP5 majú zásadný význam pre všetky tri druhy metylácie H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 a H3K4me3), vzhľadom k tomu, ASH2L a DPY30 sú nutné predovšetkým pre H3K4me3 [6, 8, 10, 11].

DPY30 je členom všetkých set1 /MLL komplexov človeka, a je potrebný pre úplné sET1 /MLL metyltransferáza činnosti [10, 12]. DPY30 sa podieľa na diferenciáciu potenciálu embryonálnych kmeňových buniek (HSR) pozdĺž neurónov vytlačené riadky textu [10] a je dôležitý pre správnu diferenciáciu a proliferáciu hematopoetických kmeňových buniek [12]. Okrem toho, vyčerpávanie DPY30 spôsobí, že bunky zadať starnutie stav podobný a upregulate P16 (CDKN2A) a P15 (CDKN2B), ktoré sa priamo podieľajú na starnutie [13].

Karcinóm žalúdka je jedným z popredných príčinami úmrtia na nádorové ochorenie na celom svete [14]. Aj keď nedávne diagnostické a terapeutické pokroky poskytujú vynikajúce prežitie u pacientov s včasnou rakovinou žalúdka, choroba je zvyčajne diagnostikovaná v neskoršej fáze, kedy je zlá prognóza [15]. Žalúdočné karcinogenézy so sebou nesie progresívnou akumulácie rôznych genetických a epigenetických zmien, ktoré vedú k získaniu-of-funkcie onkogény a strata-of-funkcie podľa tumor supresorových génov. Okrem toho, pretože transkripcie génov silne závisí od štruktúry chromatínu, zmenená alebo abnormálne Histon metylácie je obvykle spojené s progresiou nádoru a prognózou u rakoviny [16], a aj keď sa stav histónov metylácie bola dobre popísaná u mnohých typov rakoviny, tento aspekt zostáva nejasné, u karcinómu žalúdka [16, 17].

v tejto štúdii, aby sa zistilo, či DPY30 má patologické úloha v karcinómu žalúdka, boli skúmané jeho expresie a úloha.

materiály a metódy

Bunková kultúra a transfekcia siRNA

rakovinové bunkových línií odvodených od žalúdka, SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 a NCI-N87 boli zakúpené od kórejskej bunkové línie Bank (Soul). Žalúdočné epiteliálne bunkové línie, HFE145 boli nadaný od profesora Hassan Ashktorab (Howard University). Rakovina bunkové línie žalúdka boli kultivované pri 37 ° C vo zvlhčenej 5% CO _{2/95% atmosfére vzduchu v RPMI1640 doplnenom 25 mM HEPES, 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka (FBS) (GE Healthcare Life Science, Južnej Logan , UT, USA) a 100 ug /ml penicilín /streptomycín (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). DMEM (GE Healthcare Life Science) médiu doplnenom 10% FBS a 100 ug /ml penicilínu /streptomycín bolo použité pre HFE145 kultúry. Bunky boli transfekovány s malou interferujúce RNA (siRNA) alebo obraz (SCR) za použitia siRNA DhamaFECT činidla 1 alebo 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, USA) podľa inštrukcií výrobcu. siRNA sekvencie boli nasledujúce: DPY30 siRNA duplex (ORF) (Bioneer, Daejeon, Kórea), 5'-CAC UKU GAG UAC GGU CUC A (dTdT) -3 ', 5'-CUC UGA GUA CGG CAC UKU A (dTdT) -3 ', 5'-CUC ACU UAU UKU AGG UAC U (dTdT) -3'; DPY30 siRNA duplex (3'-UTR) (Bioneer); 5 'CCG GAC AAC AGA ACC UAU UUU UGG A (dTdT) -3', 5'-GAG GCA GCU UUA auu GCC augusta AUC A (dTdT) -3 '; WDR5 siRNA duplex (Bioneer), 5 'GUC CUU Gug AAG CUC GUC U (dTdT) -3', 5'-GUC Gug AUC UCA ACA GCU U (dTdT) -3 ', 5'-CAG auu ČZU ACC UUC UUG U (dTdT) -3 '; RBBP5 siRNA duplex (Bioneer), 5 'Gug UGA AAA GGG CUC AGU A (dTdT) -3', 5'-CAG auu CUC AGG AUC UUG U (dTdT) -3 ', 5'-Gug GUU GAG auu AGU AGA U (dTdT) -3 '; ASH2L siRNA duplex (Bioneer), 5 'GUA UGA ACG GGU UUU GUU A (dTdT) -3', 5'-CUG AGA ACA CCU GAA AUC A (dTdT) -3 ', 5'-GUC UAC CUU UCA UGA CCA A (dTdT) -3 '; miešaná (SCR) siRNA (Thermo Scientific), 5 'GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3'.}

DPY30 nadmerná expresia

DPY30 cDNA bol klonovaný do pLenti6.3 -V5 /DEST vektor (lentivirový cieľový vektor) pomocou in vivo rekombinačné
na báze brány klonovacieho systému (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Vektor darcu (pDONR221) nesúci cDNA sekvenciu DPY30 bol zakúpený z najviac odporúčaných ORF klonov (Invitrogen), a recombined s protiprúdom-voliteľný ccdB
génu pLenti6.3-V5 /cieľa pomocou LR Clonas zmesi enzýmov (Invitrogen). Prázdny vektor pLenti6.3 /V5-DEST bola použitá ako falošný kontrolu. Rekombinantný lentiviry boli vyrobené v 293FT bunkách a použitý k infekcii SNU216 a SNU638 bunky, v súlade s pokynmi výrobcu (ViraPower Lentivirový Expression System; Invitrogen). DPY30-expresiou stabilné bunky boli vytvorené selekciou s blasticidin (7,5 ug /ml) (Invitrogen).

záchranných testoch sme upravili, nasledovala protokol "rušenie RNAi pomocou kolekcie Precision Lenti ORF" (http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). V stručnosti, bunky boli infikované rekombinantnými lentivirů (pLenti6.3-V5 /CIELE alebo DPY30-over konštrukty). 24 hodín po transdukciu médium, obsahujúce vírus, sa odstráni a nahradí kompletným médiom. Nasledujúci deň, blasticidin bolo pridané v koncentrácii 7,5 ug /ml. Bunky boli udržiavané v rámci výberu po dobu šiestich dní, výmena média alebo pasážováním každé 2-3 dni podľa potreby. Vybrané populácie kontrolných buniek alebo buniek, ktoré exprimujú DPY30 boli použité pre transfekční pokusy s použitím DPY30 siRNA cieli na otvorený čítací rámec (ORF) alebo 3'-nepřekládané oblasti (UTR).

Real-time PCR

vzorky tkaniva boli získané od 23 nepríbuzných kórejských primárnych pacientov s karcinómom žalúdka, ktoré podstúpili chirurgickú resekciu u Pusan ​​National University Hospital a Pusan ​​National University Hospital Yangsan a za predpokladu, písomný informovaný súhlas. Štúdia bola schválená Pusan ​​National University Hospital-Institutional Review Board (PNUH-IRB) a Pusan ​​National University Hospital Yangsan-Institutional Review Board (PNUYH-IRB). Celková RNA z tkanív a buniek boli extrahované za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen) alebo RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), podľa inštrukcií výrobcu. Kvantitatívny real-time PCR (real-time PCR) bola použitá pre kontrolu hladiny DPY30 mRNA. cDNA boli syntetizované s MMLV reverznej transkriptázy (Promega, Madison, WI, USA), dNTP, a oligo-dT primérov. Tieto sekvencie primérov boli nasledovné: DPY30, 5'-AAC GCA GGT TGC AAA AGA TCC T-3 'a 5'-TCT GAT CCA GGT CAC AGG GAG-3'; WDR5, 5'-TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 a 5'-CTG GGT TTG GAC AAG CTG TT-3 '; RBBP5, 5'-AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT-3 'a 5'TCA CAG TCG SCS GAA AGA AC -3'; ASH2L, 5'-TAC AAG AGC TGC ACG GTT TC-3 'a 5'-CCA GCC CAT GTC ACT CAT AG -3'; GAPDH, 5'-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3 'a 5'-CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3'. PCR v reálnom čase bola vykonaná za použitia real-time PCR systému LightCycler ™ 96 (Roche, Nutley, NJ) a FastStart DNA Essential Green Master (Roche), podľa inštrukcií výrobcu. GAPDH bola použitá ako vnútorná kontrola.

Imunohistochémia

Imunohistochemické farbenie s králičie anti-ľudský DPY30 polyklonálnou protilátkou (Sigma-Aldrich), bola vykonaná na tkanivá poli rakoviny žalúdka (n = 59), zakúpené od SUPER BIO CHIPS (Seoul) alebo na 4-um úsekov vzoriek parafínových. Stručne povedané, po Deparafinizace a rehydratáciu, sklíčka boli ošetrené 0,3% peroxidu vodíka po dobu 30 minút na inhibíciu endogénnej peroxidázy, a blokované 10% normálnej somárov sérum (NDS) a 1% BSA v 1 x fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Sklíčka bola potom inkubovaná cez noc pri 4 ° C v blokovacím pufri, ktorý obsahuje králičie anti-ľudskej DPY30 primárnej protilátky (1:80, Sigma-Aldrich). Sekundárne protilátka (HRP-konjugovaná) väzba bola vykonávaná pri riedení 1: 200 v blokovacom pufri po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Detekcia bola vykonávaná s HRP (Vector Laboratories) a sklíčka boli kontrastne tým, že by po dobu 1 min s hematoxylín farbiacim pufrom (Sigma-Aldrich).

testu proliferácie buniek

Jeden deň po transfekciu buniek s siRNA, sa médium nahradí 1% FBS médiu, a o štyri dni neskôr sa pridalo 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO, Soul) a inkubované po dobu 0,5 až 2 hodín. S cieľom overiť vplyv DPY30 nadmerné expresie na proliferáciu buniek, bunky boli schovať v 10% FBS médium, a po troch dňoch kultivácie bol pridaný 10 ul Ez-Cytox (ITSBIO) a inkubované po dobu 0,5 až 2 hodín. Bunkové viabilities bola stanovená meraním absorbancie pri 450 nm za použitia čítačky viac VICTOR3 (PerkinElmer, MA, USA).

Boyden komory test

Modifikovaný Boyden Transwell komora (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, USA) bol použitý. Spodná komora sa naplní 50 ul RPMI obsahujúcim 10% FBS. Skúmať účinky DPY30 známeho dole, SNU1 a SNU16 (non-adherentních buniek) boli transfekovány ORF-zacielenie siRNA. Jeden deň po transfekciu boli bunky premyté, suspendované v hustote 5 x 10 ^{5 buniek /ml v 50 ul RPMI doplnenom 0,5% FBS, a vrúbľovať do hornej komory. Na odstránenie vplyvu proliferácie, pridá sa mitomycín C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich). Bunky potom boli inkubované po dobu 24 hodín pri teplote 37 ° C s 5% CO2. Počet migrovaných buniek bola hodnotená pomocou počítania buniek v dolných jamkách. Skúmať účinky DPY30 nadmernou expresiou, že stabilné bunky (adherentní bunky; SNU216 a SNU638) boli použité. Bunky (simulované a DPY30-over) trypsinizovány a vrúbľovať v hustote 1 x 10 5 buniek /ml. Ak chcete odstrániť účinky zbraní, pridá sa mitomycín C. Bunky boli ponechané migrovať po dobu štyroch hodín, membrány boli fixované a zafarbené za použitia Diff-Quik roztoku (Sysmex, Kobe, Japonsko) a premyje sa destilovanou vodou. Počty buniek v 10 náhodne vybraných poliach boli počítané za použitia svetelného mikroskopu. Pokusy boli vykonané v troch opakovaniach.}

Matrigel invázie test

invazívne schopnosti rakovinových buniek boli stanovené za použitia 8-um pórovitý BioCote matrigelu komory vložky (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Jeden deň po transfekciu sa SCR alebo DPY30 siRNA, boli bunky trypsinizovány a suspendované v hustote 5 x 10 ^{4 buniek /ml v 500 ul RPMI doplnenom 0,5% FBS a mitomycín C (0,01 g /ml, Sigma -Aldrich). Bunky potom boli pridané do komory vložky a umiestnené do jamiek naplnených 0,7 ml médiu doplnenom 10% FBS ako chemoatraktantu. Po inkubácii po dobu 24 alebo 48 hodín, non-napadajúce bunky na hornej strane membrány sa odstránia škrabkou, a invazívnych buniek na spodnej strane membrány boli fixované a zafarbené Diff-Quik roztoku (Sysmex). Počty buniek v 10 náhodne vybraných poliach boli počítané za použitia svetelného mikroskopu. Experimenty boli vykonávané v triplikátech a najmenej 5 polí boli počítané za celý experiment.}

Štatistická analýza

Výsledky sú vyjadrené ako priemer ± štandardnej odchýlky (SDS) z troch nezávislých experimentov. Tieto významy rozdielov boli stanovené pomocou študenta t
-test pre nepárové pozorovanie. P
hodnoty < 0,05 boli považované za štatisticky významné.

Výsledky

Vyjadrenie DPY30 v žalúdočných rakovinových tkanív

Ak chcete skúmať DPY30 expresie v ľudskej rakoviny žalúdka sme vykonali imunohistochémia s použitím poľa žalúdočné rakovina tkaniva alebo archívne parafínu zaliate tkanivové rezy. V normálnej žalúdočnej tkanive, DPY30 expresie bolo ťažké detekovať (obr 1A), ale v nádorových tkanivách DPY30 proteín bol široko nadmerne exprimované (obr 1B-1D). Pozoruhodne, DPY30 bol nadmerne exprimovaný v invázii buniek karcinómu žalúdka (obr 1B-1D). Ďalej sme zistili, hladiny mRNA DPY30 v jednom zvečnil normálnej žalúdočnej epitelové bunkové línie (HFE145) a šesť rakovinou žalúdka odvodených bunkových línií (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 a NCI-N87) pomocou real-time PCR. Hladina mRNA DPY30 bol výrazne vyšší (rozkladací zmenu > 5) v SNU1 a SNU16 než v HFE145 bunky, zatiaľ čo úrovňou expresie DPY30 v SNU216, SNU620 a SNU638 bola podobná ako v HFE145 bunkách a bola nižšia (rozkladací zmenu >10) v NCI-N87 (obr 1 E). Tiež sme overovali hladiny mRNA DPY30 v žalúdočných rakovinových tkanív. DPY30 bol vysoko exprimovaný v 15 prípadoch (15/23, 65%) v porovnaní s normálnou tkanive (obr 1f). Tieto výsledky ukazujú, že DPY30 je vysoko exprimovaný v niektorých ľudských karcinómov žalúdka.

Úloha DPY30 v proliferáciu buniek karcinómu žalúdka

Na stanovenie možných rolí DPY30 v buniek karcinómu žalúdka, sme prvý zrazil dole DPY30 pomocou ORF-zacielenie DPY30 siRNA a monitorovať jeho porazený účinnosť tým, real-time PCR (obr 2A). ORF zacielenia DPY30 siRNA (100 nM) sa znížila úroveň mRNA DPY30 v HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 a SNU638 bunky v porovnaní s miešanými siRNA (SCR) o 78%, 89%, 79%, 76%, a 88%, resp. Päť dní po transfekciu buniek s SCR alebo ORF-zacielenie siRNA, sme vykonali testy proliferácie. Vyradenie DPY30 inhibuje množením HFE145, SNU1 a SNU16 v porovnaní s SCR o 31%, 69% a 71% v tomto poradí, zatiaľ čo knockdown neovplyvnilo proliferácie na SNU216 a SNU638 (obr 2b), v ktorom je hladina expresie DPY30 bola nízka (pozri obr 1 E). Ďalej sme vyrobili DPY30-nadmernou expresiou bunkových líniách (DPY30-over) pomocou HFE145, SNU216 a SNU638 bunky, a potom porovnáva hladiny mRNA DPY30 s predstieraným buniek (kontrola) a DPY30-over buniek. Real-time PCR Výsledky ukázali, že hladina expresie DPY30 4,2, 3,5 a 3,2 krát vyššia v DPY30-expresiou HFE145, SNU216 a SNU638 buniek ako falošne buniek, v danom poradí (obrázok 2A). DPY30 nadmerná expresia zvýšilo množením HFE145, SNU216 a SNU638 bunky oproti falošne buniek 1,9, 2,2 a 1,6 násobne, respektíve (obr 2B).

Ak chcete potvrdiť špecifickosť DPY30 siRNA sme vykonali záchranné experimenty. Pre záchranné experimenty sme použili DPY30 siRNA cielenie 3'-UTR namiesto ORF, pretože ORF cielenie siRNA môže tiež degradujú exogénny DPY30 ORF DNA sme zaviedli. Na zvýšenú expresiu DPY30 sme transdukovány SNU1 a SNU16 sa vírusových častíc, pLenti6.3-V5 /DEST (kontrola) alebo DPY30-ORF-viac ako konštrukty. DPY30-nadmernou expresiou SNU1 alebo SNU16 bunky vykazovali vyššiu expresiu DPY30 2,1 alebo 2,5 násobne vyššia ako falošne buniek, respektíve (obr 2c). ORF zacielenia siRNA viedla k down-regulácii hladiny DPY30 expresie vyšší ako 75%, s predstieraným i DPY30-zvýšene exprimujúcich buniek. 3'-UTR-zacielenie siRNA down-regulovaná expresia DPY30 o viac ako 85% v modelových bunkách, zatiaľ čo v bunkách DPY30-nadmernou expresiou, sa znížila DPY30 výraz na úroveň, ktorá je podobná SCR siRNA transfekciou buniek ( obr 2C). Tento výsledok ukazuje, že exogénny DPY30-ORF DNA je odolný voči 3'-UTR-zacielenie siRNA a vyjadruje sa v podobnej miere, že endogénne DPY30 mRNA. ORF cielenie siRNA inhibujú proliferáciu buniek, bez ohľadu na exogénne DPY30 expresie (obr 2D). Proliferácia bola tiež inhibovaná 3'UTR-zacielenie siRNA v modelových bunkách, však to bolo čiastočne inhibovaná DPY30-s nadmernou expresiou buniek. V DPY30-nadmerne exprimujúce bunky, ORF cielenie siRNA znížili proliferáciu SNU1 a SNU16 v porovnaní s SCR siRNA o 74% a 66%, v tomto poradí, avšak 3'-UTR-zacielenie siRNA sa znížila o 20% a 8%, v danom poradí , Tento výsledok ukazuje, že exogénny DPY30 zachráni inhibíciu proliferácie vyvolanej 3'-UTR-zacielenie siRNA, a fenotypmi spôsobené DPY30 špecifickú siRNA nie sú mimo cieľa účinky.

Vzhľadom k tomu, DPY30 je súčasť oddelenie sme sa zaoberali výrazy a úloha ostatných zložiek oddeleniach. Real-time PCR ukázali, že hladiny mRNA WDR5 a RBBP5 v SNU1, SNU16, SNU216 a SNU638 boli podobné tým HFE145. Avšak úroveň mRNA ASH2L boli významne vyššie (rozkladací zmenu > 3) v SNU1 a SNU16 než v HFE145 bunkách (obr 3A), ako je na obr DPY30 1E. S cieľom zistiť, či WRAD komponenty sú spojené s proliferáciu buniek karcinómu žalúdka, sme knockdowned každý WRAD komponent pomocou svoje špecifické siRNA a monitorovať Knockdown efektivitu práce real-time PCR (obr 3b). Každý siRNA (100 nM) sa znížil hladiny mRNA v SNU1 a SNU16 buniek v porovnaní s SCR o 65% -75%. Vyradenie WDR5 a RBBP5 inhibuje proliferáciu SNU1 a SNU16 buniek v porovnaní s SCR o 30-48% (obrázok 3C). Avšak, ASH2L inhibuje proliferáciu SNU1 a SNU16, v ktorej je hladina expresie ASH2L bola vysoká, v porovnaní s SCR o 85% a 75%, v danom poradí.

Úloha DPY30 v migrácii a invázii žalúdočných rakovinové bunky

Ďalej sme skúmali, či DPY30 reguluje migráciu buniek karcinómu žalúdka. Vyradenie DPY30 znížila FBS-indukovanej migrácie z SNU1 a SNU16 buniek oproti SCR sa o 35% a 45%, v danom poradí (obrázok 4). Na rozdiel od toho DPY30 nadmerná expresia zvýšená FBS-indukovanej migrácie sa na SNU216 a SNU638 bunky oproti falošne buniek o 2,5 a 2,2 násobne, v danom poradí (obrázok 4). Tieto výsledky nás viedli k skúmať úlohu DPY30 pri invázii rakovinových buniek žalúdka. V invázie teste Matrigel, DPY30 siRNA inhibovala FBS indukovanej invázie SNU1 a SNU16 buniek oproti SCR siRNA sa o 65% a 84% v uvedenom poradí (obr 5A a 5C). Okrem toho DPY30 nadmerná expresia zvýšila FBS indukovanej invázie SNU216 a SNU638 buniek v porovnaní falošne buniek o 3,2 a 2,9-násobne, respektíve (obr 5B a 5C). Tieto výsledky ukazujú, že DPY30 podporuje migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka.

Diskusia

Úloha DPY30 v biológii rakoviny boli zle charakterizované hoci jeho rolou v diferenciácii HSR a krvotvorných progenitorov malo boli hlásené [10, 12]. V tejto štúdii sme ukázali, nové role DPY30 v karcinómu žalúdka. DPY30 je zosilnený (dáta nie sú uvedené) a vysoko exprimovaný (viď obr 1), v niektorých žalúdočných rakovinových tkanív. Navyše jeho knockdown alebo nadmerná expresia regulovaná na proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka. Zmeny v expresii, chromozomálne translokácie a somatické mutácie génov kódujúcich podjednotky set1 /MLL komplexov boli zaznamenané v mnohých druhov rakoviny. Tieto výsledky podporujú kritické úlohy členov SET1 /MLL komplexu v progresii rakoviny.

Up-regulácia DPY30 expresie bola pozorovaná iba v SNU1 a SNU16 buniek karcinómu žalúdka medzi šesť buniek karcinómu žalúdka sme skúmali. Avšak jeho up-regulácia bola pozorovaná u viac ako polovicu žalúdočné rakovinové tkanive sme skúmali (obrázok 1). Je ťažké vysvetliť tento rozpor. Je však zrejmé, že počet žalúdočných rakovinové tkanive sme skúmali nestačí. Takže, je nutná rozsiahla výraz štúdie za použitia oveľa väčší počet tkanív zhodnotiť klinickú hodnotu v budúcnosti.

Úloha MNOŽINY1 /MLL H3K4 metyltransferáza komplex v biológii rakoviny je zložitý. Regulačné podjednotky set1 /MLL komplexov vrátane WRAD, obsahujú ako silné onkoproteínov a nádorových suppressors. Napríklad můži1 gén kóduje MužiV, integrálne podjednotku MLL1 a MLL2, a je mutovaný u pacientov s mnohopočetným endokrinné neoplázia typu 1 (můži1) [18, 19]. Okrem toho, Měnínská reguluje P18 (CDKN2C) a P27 (CDKN1B) náborom MLL1 komplex [20]. Na rozdiel od toho WDR5, komponenta WRAD komplexu, bola označená pôsobiť ako onkoproteínov v karcinómu prostaty, v ktorom je nadmerne exprimovaný a rozhodujúce pre proliferáciu androgénu vyvolanej nádorových buniek [21]. ASH2L, čo je ďalší zložkou WRAD komplexu a môže komunikovať s onkoproteínov MYC [22], je nevyhnutné, aby MYC /Ha-RAS-závislé transformáciu fibroblastov krysy embryí. Okrem toho, že je nadmerne exprimovaný v mnohých druhoch nádorov a je rozhodujúci pre proliferáciu nádorových buniek [23]. V tejto štúdii sme ukázali, role DPY30 ako onkoproteínov v rakoviny žalúdka.

Čo sú molekulárne mechanizmy, na ktorých sa zakladá role DPY30 v karcinómu žalúdka? Hoci sme neodhalilo niekoľko hypotéz môže byť navrhnutá na základe predchádzajúcich štúdií. Jeden z možných hypotéz je, že nadmerná expresia DPY30 vedie k overexpressions onkogénov prostredníctvom zvýšenej aktivity H3K4MT. Vyčerpanie DPY30 alebo ASH2L vedie k poklesu H3K4me3, zatiaľ čo WDR5 a RBBP5 majú zásadný význam pre všetky tri druhy H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 a H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Okrem toho je nadmerná expresia DPY30 sám môže zvýšiť H3K4MT aktivitu [10]. Vzhľadom k tomu, H3K4me2 /3 je aktívny značka pre prepis [3, 24], zvýšené H3K4MT môže priamo upregulate mnoho génov, ako je napríklad, onkogény, alebo alternatívne nepriamo down-reguláciu nádorové supresormi. Jeden predchádzajúca správa podporujúce túto hypotézu, že ASH2L, rozhodujúci zložkou SET1 /MLL komplexu, bolo preukázané, že hrá ako onkoproteínov [25, 26]. Ďalším predchádzajúca správa je, že DPY30 priamo aktivuje výrazy ID proteínov cez H3K4 metylácie [13, 27]. ID proteíny inhibujú aktivity ETS1 a ETS2, ktoré môžu vyvolať jednu z nádoru supresorický gén, p16. V tejto štúdii sme ukázali, že zložky (WRAD WDR5, RBBP5 a ASH2L) môže inhibovať proliferáciu buniek karcinómu žalúdka (obrázok 3), čo naznačuje, že DPY30 akt v dôsledku zvýšenej aktivity H3K4MT. Ďalšie štúdie sú potrebné na odhalenie mechanizmov základnej role DPY30 v nádorových bunkách žalúdka.

• Ploche ONE: Analýza deregulovaný mikroRNA a ich cieľových génov v žalúdočnej Cancer
• Ploche ONE: MED30 Reguluje proliferáciu a Pohyblivosť rakovina žalúdka Cells