PLoS ONE: Роли DPY30 в распространении и моторики рака желудка Cells

Абстрактный

Различные типы метилирования гистонов были связаны с развитием рака. В зависимости от места метилирования в белков гистонов, его влияние на разные транскрипции. DPY30 является общим членом SET1 /MLL гистонов H3K4 метилтрансферазы комплексов. Тем не менее, его экспрессия и роли при раке желудка были плохо охарактеризованы. Для того, чтобы определить, есть ли DPY30 патофизиологические роли в раке желудка, исследовали его выражение и роли. Иммуногистохимия и ПЦР в реальном времени обнаружились-регуляции экспрессии DPY30 в некоторых желудочных линий раковых клеток и тканей пациентов. Ее нокдаун путем миРНК уменьшало пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака желудка, в то время как его избыточная экспрессия показал противоположный эффект. Эти результаты указывают на то, что DPY30 имеет решающую роль в пролиферации, миграции и вторжения клеток рака желудка, и предложить DPY30 может быть терапевтической мишенью при раке желудка
<р> Образец цитирования:. Ли YJ, Хан ME, Пэк SJ, Ким С.Ю., Oh So (2015) Роль DPY30 в пролиферации и Подвижность клеток рака желудка. PLoS ONE 10 (7): e0131863. DOI: 10.1371 /journal.pone.0131863
<р> Редактор: Аамир Ahmad, Wayne State University школы медицины, Соединенные Штаты
<р> Поступило: 3 марта 2015 года; Принято: 8 Июня, 2015 года; Опубликовано: 6 июля 2015
<р> Copyright: © 2015 Lee и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в работе
<р> Финансирование:. Эта работа была поддержана Bio &Amp; Программа Medical Technology Development (É2M3A9C6050213, OSO) и фундаментальных исследований научный фонд (É2R1A1A3010521, HME) Национального исследовательского фонда (СИФ), финансируемый правительством Кореи (МЭПВ), а также за счет гранта Национального R &Amp; D Программа Контроль рака, Министерство здравоохранения, социального обеспечения и по делам семьи, Республика Корея (\0050, OSO). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> ковалентные модификации гистонов, например, ацетилирование, фосфорилирование, убихитинизация и метилирование, модулируют структуру хроматина и играют центральную роль в регуляции клеточного цикла, транскрипции генов, репарации ДНК, эмбрионального развития, и клеточная дифференцировка [1, 2]. Хотя рост ацетилирование гистонов, как правило, связано с активацией транскрипции, метилирование гистонов коррелирует с транскрипционной активации и репрессии. Например, метилирование гистона H3 по лизину 9, 20 или 27 остатков (H3K9, H3K20 или H3K27) участвует в транскрипционной молчанием генов, но с другой стороны, метилирование H3K4, H3K36 или H3K79 ассоциируется с открытой хроматина и активный транскрипцию генов [3].
<р> У млекопитающих, моно-, ди- и три-метилирования H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 и H3K4me3) выполняются шесть различных Set1 семейных /MLL комплексов (SET1A, SET1B , MLL1, MLL2, MLL3 и MLL4) [4, 5]. Эти H3K4 метилтрансферазами (H3K4MT) содержат различные каталитические субъединицы, а также деятельность всех шести семейных комплексов находятся под контролем общих основных компонентов мульти-субъединиц, которые включают WDR5, RBBP5, ASH2L и DPY30, а также упоминаются как WRADs. [6-9]. Потеря любого субъединицей WRAD комплекса приводит к снижению H3K4 метилирования. WDR5 и RBBP5 имеют решающее значение для всех трех видов метилирования H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 и H3K4me3), в то время как ASH2L и DPY30 в основном требуется для H3K4me3 [6, 8, 10, 11].
<Р> DPY30 является членом всех Set1 /MLL комплексы человека, и требуется для полного SET1 /MLL метилтрансферазы активности [10, 12]. DPY30 участвует в дифференцировке эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) вдоль нейронного построчная оплата [10] и имеет важное значение для правильной дифференцировки и пролиферации гемопоэтических клеток-предшественников [12]. Кроме того, истощение DPY30 заставляет клетки ввести стареющих, как государство и апрегулируются p16 (CDKN2A) и P15 (CDKN2B), которые непосредственно участвуют в старении [13].
<Р> Рак желудка является одним из ведущих причины, связанной с раком смерти во всем мире [14]. Хотя недавние диагностические и терапевтические средства, обеспечивают отличную выживаемость больных с ранними стадиями рака желудка, заболевание обычно диагностируется на поздней стадии, когда прогноз неблагоприятный [15]. Желудочный канцерогенез влечет за собой прогрессивные скопления различных генетических и эпигенетических изменений, которые приводят к амплитудно-оф-функции онкогенами и с потерей функции генов-супрессоров опухолей. Кроме того, поскольку транскрипция генов сильно зависит от структуры хроматина, искаженных или ненормальное метилирования гистонов был обычно связан с опухолевой прогрессии и прогноза при раке [16], и хотя статус метилирования гистонов была хорошо описана во многих типах рака, этот аспект остается неясным, при раке желудка [16, 17].
<р> в этом исследовании, чтобы определить, имеет ли DPY30 патофизиологические роли в раке желудка, исследовали его выражение и роли.

материалы и методы <бр>

культура клеток и трансфекция миРНК

рака желудка полученные клеточные линии, SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 и NCI-N87 были приобретены у корейской клеточной линии Bank (Сеул). Желудочный эпителиальной клеточная линия, HFE145 были подарены от профессора Хасана Ashktorab (Howard University). Желудочные линии раковых клеток культивировали при 37 ° С в увлажненной 5% CO <к югу> 2/95% атмосфере воздуха в RPMI1640, дополненной 25 мМ HEPES, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (GE Healthcare Life Science, South Logan , Юта, США) и 100 мкг /мл пенициллина /стрептомицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США). DMEM (GE Healthcare Life Science) среде с добавлением 10% FBS и 100 мкг /мл пенициллина /стрептомицина использовался для HFE145 культуры. Клетки трансфицировали малых интерферирующих РНК (миРНК) или омлет (SCR) миРНК с помощью DhamaFECT реагента 1 или 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. миРНК последовательности были следующими: DPY30 миРНК дуплекса (ORF) (Bioneer, Тэджон, Корея), 5'-CAC УКУ GAG GGU CUC контроля учетных записей A (dTdT) -3 ', 5'- CUC УЗА GUA CGG УКУ CAC A (dTdT) -3 ', 5'- CUC ACU UAU УКУ AGG UAC U (dTdT) -3'; DPY30 миРНК дуплекса (3'-UTR) (Bioneer); 5'- CCG GAC AAC AGA ACC UAU УУУ UGG A (dTdT) -3 ', 5'- GAG GCA ГПА UUA AUU НКУ августу АУК A (dTdT) -3'; WDR5 миРНК дуплекс (Bioneer), 5'- GUC CUU GUG AAG CUC GUC U (dTdT) -3 ', 5'- GUC GUG АУК УСА ACA ГПА U (dTdT) -3', 5'- CAG AUU АПЗ ACC UUC УУГ U (dTdT) -3 '; RBBP5 миРНК дуплекс (Bioneer), 5'- GUG УЗА AAA GGG CUC AGU A (dTdT) -3 ', 5'- CAG AUU CUC AGG АУК УУГ U (dTdT) -3', 5'- GUG ГУУ GAG AUU AGU AGA U (dTdT) -3 '; ASH2L миРНК дуплекс (Bioneer), 5'- GUA УЗА ACG GGU УУУ ГУУ A (dTdT) -3 ', 5'- ЗГП AGA ACA CCU GAA АУК A (dTdT) -3', 5'- GUC UAC CUU УСА УЗА CCA А (dTdT) -3 '; закодирован (SCR) миРНК (Thermo Scientific), 5'- ГАУ CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 '.

DPY30 суперэкспрессия
<р> DPY30 кДНК клонировали в pLenti6.3 -V5 /DEST вектор (лентивирусов вектор назначения), используя в естественных условиях
рекомбинации на основе шлюза клонирования системы (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Вектор донор (pDONR221) укрывает последовательности кДНК DPY30 был приобретен от окончательного ORF Clones (Invitrogen), и рекомбинируют с противотоком выбираемые БДКК
гена pLenti6.3-В5 /DEST с использованием LR Clonase смеси ферментов (Invitrogen). Пустой вектор pLenti6.3 /V5-НАЗН использовали в качестве контроля макете. Рекомбинантные лентивирусов были произведены в 293FT клеток, и использовали для заражения SNU216 и SNU638 клетки, в соответствии с инструкциями изготовителя (ViraPower Лентивирусов Expression System; Invitrogen). DPY30-гиперэкспрессией стабильные клетки были созданы путем селекции с бластицидин (7,5 мкг /мл) (Invitrogen).
<Р> Для спасательных анализов, мы модифицировали, а затем протокол 'RNAi помех с помощью коллекции Precision Ленти ORF' (http://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). Вкратце, клетки были инфицированы рекомбинантными лентивирусах (pLenti6.3-В5 /DEST или DPY30-над конструкциями). Через 24 ч после трансдукции, средства массовой информации, содержащие вирус были удалены и заменены на полной культуральной среде. На следующий день, бластицидин был добавлен в концентрации 7,5 мкг /мл. Клетки выдерживали при отборе в течение шести дней, заменяя среду или пересева каждые 2-3 дня по мере необходимости. Отобранные популяции контрольных клеток или клеток, экспрессирующих DPY30 использовали для экспериментов с использованием трансфекции DPY30 миРНК ориентации на открытую рамку считывания (ORF) или 3'-нетранслируемую область (UTR).

ПЦР в реальном времени
<р> образцы тканей были получены из 23 неродственных корейских первичных больных раком желудка, которые подверглись хирургической резекции в Пусане Национального госпиталя университета и Национального Пусане Yangsan университетской больницы и дали письменное информированное согласие. Исследование было одобрено Национальным советом Пусана университета Больница-Institutional Review (PNUH-IRB) и Национального совета Yangsan Пусана университета Больница-Institutional Review (PNUYH-IRB). Суммарную РНК из тканей и клеток извлекали с помощью Trizol реагента (Invitrogen) или набору RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, США), в соответствии с инструкциями производителя. Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР в реальном времени) использовали для проверки уровня DPY30 мРНК. кДНК синтезировали с ММЛЖ обратной транскриптазы (Promega, Madison, WI, США), дНТФ и олиго-дТ грунтовки. Последовательности праймеров были использованы следующим образом: DPY30, 5'- AAC ВКА ГГТ ТГК АГА ААА ТСС Т-3 'и 5'- ТСТ GAT CCA GGT AGG САС ГАГ -3'; WDR5, 5'- TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 и 5'- CTG TTG GGT GAC AAG CTG TT-3 '; RBBP5, 5'- AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT-3 'и 5'- TCA CAG TCG ССТ GAA AGA AC-3'; ASH2L, 5'- TAC AAG AGC ТГК ACG GTT TC-3 'и 5'- CCA НКУ CAT GTC ACT CAT AG -3'; GAPDH, 5'- TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3 'и 5'- CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG-3'. ПЦР в реальном времени проводили с использованием ПЦР в реальном времени системы LightCycler ™ 96 (Roche, Nutley, штат Нью-Джерси) и FastStart Essential ДНК Green Master (Roche), в соответствии с инструкциями изготовителя. GAPDH, был использован в качестве внутреннего контроля.

Иммуногистохимия
<р> проводили Иммуногистохимическое окрашивание с кроличьей анти-человеческого DPY30 поликлональных антител (Sigma-Aldrich) в массиве ткани от рака желудка (п = 59), приобретенным от SUPER BIO микросхемах (Сеул) или на 4-мкм секций залитых парафином образцов. Если коротко, то после того, как депарафинизации и повторной гидратации, предметные стекла обрабатывали 0,3% перекиси водорода в течение 30 мин, чтобы ингибировать эндогенную активность пероксидазы, и блокировали 10% нормальной сыворотки осла (NDS) и 1% БСА в 1 х фосфатно-буферным раствором (PBS). Срезы затем инкубировали в течение ночи при 4 ° С в блокирующем буфере, содержащем кролика против человеческого DPY30 первичное антитело (1:80, Sigma-Aldrich). Вторичное антитело (HRP-конъюгированные) связывание проводили при разведении 1: 200 в блокирующем буфере в течение 2 час при комнатной температуре. Обнаружение проводили с HRP (Vector Laboratories), и предметные стекла контрастному путем обработки их в течение 1 мин с гематоксилином окрашивания буфера (Sigma-Aldrich).

Пролиферация клеток для анализа
<р> На следующий день после трансфекции клеток с миРНК, среду заменяли на 1% FBS средой, а через четыре дня, добавляли 10 мкл Ez-Cytox (ITSBIO, Сеул) и инкубировали в течение от 0,5 до 2 часов. Для того, чтобы проверить эффект DPY30 избыточной экспрессии на клеточной пролиферации, клетки высевают в 10% FBS среде, и после трех дней культивирования, и инкубируют в течение 0,5 до 2 ч 10 мкл эз-Cytox (ITSBIO) был. Клеточные viabilities определяли путем измерения оптической плотности при длине волны 450 нм с использованием VICTOR3 нескольких читателей (PerkinElmer, Массачусетс, США).

Бойден камеры анализ
<р> Модифицированный Бойден Transwell камера (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, США) был использован. Нижняя камера была заполнена 50 мкл среды RPMI, содержащей 10% FBS. Для изучения влияния DPY30 известного вниз, SNU1 и SNU16 (не прилипшие клетки) были трансфицированы с ORF-таргетинга миРНК. Через день после трансфекции клетки промывали, суспендировали при плотности 5 × 10 5 клеток /мл в 50 мкл среды RPMI, дополненной 0,5% FBS, и засевали в верхнюю часть камеры. Для того, чтобы устранить последствия распространения, добавляли митомицин С (0,01 мкг /мл, Sigma-Aldrich). Клетки затем инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 ° С с 5% СО2. Количество мигрировавших клеток оценивали путем подсчета клеток в нижних лунках. Для изучения влияния DPY30 избыточной экспрессии, стабильные клетки (адгезивные клетки; SNU216 и SNU638) были использованы. Клетки (фиктивные и DPY30 кадром) трипсином и высевали при плотности 1 × 10 5 клеток /мл. Для устранения эффекта пролиферации, митомицин С был добавлен. Клетки давали возможность мигрировать в течение четырех часов, мембраны фиксировали и окрашивали с помощью Diff-Quik раствора (Sysmex, Кобе, Япония) и промывают дистиллированной водой. Количество клеток в 10 случайным образом выбранных полей подсчитывали с помощью светового микроскопа. Эксперименты проводились в трех экземплярах.

Матригель нашествие анализ
<р> Инвазивные способности раковых клеток оценивали с использованием 8-мкм пористых Biocoat Матригель камеры вставки (BD Bioscience, Сан-Хосе, штат Калифорния, США). Через день после трансфекции с SCR или DPY30 миРНК, клетки обрабатывали трипсином и суспендировали при плотности 5 × 10 4 клеток /мл в 500 мкл среды RPMI, дополненной 0,5% FBS и митомицином С (0,01 мкг /мл, Sigma -Aldrich). Клетки затем добавляют к камере вставок и помещали в лунки, заполненные 0,7 мл среды, дополненной 10% FBS, как хемоаттрактанту. После инкубации в течение 24 или 48 часов, не вторгаясь клетки на верхней стороне мембраны были удалены путем соскабливания и инвазивные клетки на нижней стороне мембраны, фиксировали и окрашивали Diff-Quik раствором (Sysmex). Количество клеток в 10 случайным образом выбранных полей подсчитывали с помощью светового микроскопа. Эксперименты проводились в трех экземплярах и по крайней мере 5 полей подсчитывались на эксперимент.

Статистический анализ

Результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD) трех независимых экспериментов. Значимостей различий определяли с помощью Стьюдента т
-test для непарных наблюдений. P
значения &л; 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Выражение DPY30 в желудочном раковых тканей
<р> Чтобы исследовать экспрессию DPY30 при раке желудка человека, мы провели иммуногистохимии с помощью желудочного массива тканей рака или архивный парафин срезы ткани. В нормальных тканях желудка, экспрессия DPY30 было трудно обнаружить (Фиг.1А), но в раковых тканях DPY30 белок широко избыточно экспрессируется (фиг.1В-1D). Примечательно, что DPY30 был избыточно экспрессируется при вторжении клеток рака желудка (рис 1B-1D). Кроме того, мы определили уровни мРНК DPY30 в одном увековечена нормальной эпители желудка клеточной линии (HFE145) и шести рака желудка, полученных клеточных линий (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 и NCI-N87) с использованием ПЦР в реальном времени. Уровень мРНК DPY30 был значительно выше (складка изменение &GТ; 5) в SNU1 и SNU16 чем в HFE145 клетках, в то время как уровень экспрессии DPY30 в SNU216, SNU620 и SNU638 был похож на те, в HFE145 клетках и была ниже (складка изменение &ГТ; 10) в NCI-N87 (рис 1E). Мы также проверили уровни мРНК DPY30 в желудочном раковых тканей. DPY30 была высоко выражена в 15 случаях (15/23, 65%) по сравнению с нормальными тканями (рис 1F). Эти результаты указывают на то, что DPY30 сильно выражено в некоторых видов рака желудка человека.

Роль DPY30 в пролиферации клеток рака желудка
<р> Для того, чтобы определить возможные роли DPY30 в желудочном раковых клеток, мы первый разобранном DPY30 с использованием ORF-DPY30 таргетирования миРНК и контролировать его эффективность за счет нокдаун ПЦР в реальном времени (рис 2А). ORF-нацеливание DPY30 миРНК (100 нМ), снижало уровень мРНК DPY30 в HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 и SNU638 клеток по сравнению с зашифрованным миРНК (SCR) на 78%, 89%, 79%, 76%, и 88%, соответственно. Через пять дней после того, как трансфекции клеток с SCR или ORF-таргетинга миРНК, мы провели анализ на пролиферацию. Нокдаун DPY30 тормозил пролифераций из HFE145, SNU1 и SNU16 по сравнению с SCR на 31%, 69% и 71% соответственно, в то время как нокдаун не влияет на пролифераций из SNU216 и SNU638 (рис 2В), в которых уровень экспрессии DPY30 была низкой (рис 1E). Затем мы изготовили DPY30 сверхэкспрессией клеточных линий (DPY30-Over) с использованием HFE145, SNU216 и SNU638 клеток, а затем сравнили уровни DPY30 мРНК в ложном клетках (контроль) и DPY30-над клетками. В режиме реального времени результаты ПЦР показали, что уровень экспрессии DPY30 было 4,2, 3,5 и 3,2 раза выше, в DPY30-гиперэкспрессией HFE145, SNU216 и SNU638 клеток, чем фиктивных клеток соответственно (Фиг.2А). DPY30 избыточная экспрессия усиливал пролифераций из HFE145, SNU216 и SNU638 клеток в сравнении фиктивных клеток на 1,9, 2,2 и 1,6 раза соответственно (рис 2В).
<Р> Для подтверждения специфичности DPY30 миРНК, мы провели эксперименты по спасению. Для проведения экспериментов по спасению, мы использовали DPY30 миРНК ориентации 3'-UTR вместо ORF, потому что ORF-таргетинга миРНК также может ухудшить экзогенный DPY30 ORF ДНК мы ввели. Для гиперэкспрессией DPY30, мы трансдуцированная SNU1 и SNU16 с вирусными частицами, pLenti6.3-V5 /DEST (контроль) или DPY30-ORF-над конструкциями. DPY30 сверхэкспрессией SNU1 или SNU16 клетки показали более высокую экспрессию DPY30 2,1 или 2,5 раза выше, чем фиктивных ячеек, соответственно (рис 2С). ORF-таргетинга миРНК привело к понижающей регуляции уровней экспрессии DPY30 больше чем на 75% в ложном, а также DPY30 сверхэкспрессией клеток. 3'-UTR-таргетинга миРНК вниз регулирует экспрессию DPY30 более чем на 85% в фиктивных ячеек, в то время как, в DPY30-гиперэкспрессией клеток, он уменьшил экспрессию DPY30 до уровня, аналогичную SCR миРНК-трансфицированных клеток ( фиг.2С). Этот результат указывает на то, что экзогенный DPY30-ORF ДНК устойчив к 3'-UTR-таргетинга миРНК и выражается на том же уровне, что эндогенной мРНК DPY30. ORF таргетирования миРНК подавлял пролиферацию клеток независимо от экзогенной экспрессии DPY30 (рис 2D). Пролиферацию также тормозится 3'UTR-таргетинга миРНК в фиктивных клетках, однако он был частично ингибируется в DPY30 сверхэкспрессией клетках. В DPY30-гиперэкспрессией клетки, то ORF таргетирования миРНК уменьшил пролиферацию SNU1 и SNU16 по сравнению с SCR миРНК на 74% и 66% соответственно, однако 3'-UTR-таргетинга миРНК снизился на 20% и 8%, соответственно , Этот результат указывает на то, что экзогенный DPY30 спасает ингибирование пролиферации, индуцированной 3'-UTR-таргетинга миРНК и фенотипы, вызванные DPY30 специфической миРНК не являются офф-мишени эффектов.
<Р> Поскольку DPY30 является компонентом подопечными , мы исследовали выражения и роль других компонентов подопечными. ПЦР в реальном времени показали, что уровни мРНК WDR5 и RBBP5 в SNU1, SNU16, SNU216 и SNU638 были аналогичны HFE145. Тем не менее, уровень мРНК ASH2L были значительно выше (раза изменение &GТ; 3) в SNU1 и SNU16 чем в HFE145 клетках (рис 3А) как DPY30 на рис 1E. Для того чтобы исследовать ли компоненты WRAD связаны с распространением раковых клеток желудка, мы knockdowned каждый компонент WRAD с использованием их специфической миРНК и мониторинг эффективности нокдаун от ПЦР в реальном времени (рис 3B). Каждый миРНК (100 нМ), снижал уровни мРНК в SNU1 и SNU16 клетках по сравнению с SCR на 65% -75%. Нокдаун WDR5 и RBBP5 ингибирует пролиферацию SNU1 и SNU16 клеток по сравнению с СКВ 30-48% (рис 3C). Однако ASH2L ингибирует пролиферацию SNU1 и SNU16, в котором уровень экспрессии ASH2L был высоким, по сравнению с SCR на 85% и 75%, соответственно.

Роли DPY30 в миграции и инвазии желудка раковые клетки
<р> Затем мы исследовали, регулирует ли DPY30 миграцию клеток рака желудка. Нокдаун DPY30 уменьшил FBS-индуцированные миграции SNU1 и SNU16 клеток по сравнению с SCR на 35% и 45%, соответственно (рис 4). В противоположность этому, DPY30 избыточная экспрессия увеличил FBS-индуцированные миграции SNU216 и SNU638 клеток в сравнении фиктивных ячеек на 2,5 и 2,2 раза соответственно (рис 4). Эти результаты привели нас исследовать роль DPY30 во вторжении клеток рака желудка. В анализе вторжения Матригель, DPY30 миРНК ингибирует FBS-индуцированные нашествий SNU1 и SNU16 клеток по сравнению с SCR миРНК на 65% и 84%, соответственно (рис 5А и 5С). Кроме того, избыточная экспрессия DPY30 увеличила FBS-индуцированные нашествий SNU216 и SNU638 клеток по сравнению с клетками фиктивных на 3,2 и 2,9 раза соответственно (рис 5В и 5С). Эти результаты показывают, что DPY30 способствует миграции и инвазии клеток рака желудка.

Обсуждение
<р> Роль DPY30 в биологии рака были плохо характеризуется хотя его роль в дифференцировке ЭСК и гемопоэтических клеток-предшественников, имели сообщалось [10, 12]. В настоящем исследовании мы показали новые роли DPY30 при раке желудка. DPY30 усиливается (данные не показаны) и экспрессируется на высоком уровне (рис 1) в некоторых желудочных раковых тканей. Кроме того, его нокдаун или избыточная экспрессия регулирует пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака желудка. Изменения в экспрессии, хромосомные транслокации и соматические мутации генов, кодирующих субъединицы Set1 /MLL комплексов было зарегистрировано во многих видов рака. Эти результаты подтверждают критическое значение роли членов SET1 /MLL комплекса в опухолевой прогрессии.
<Р> повышающая регуляция экспрессии DPY30 наблюдалась только в SNU1 и SNU16 клеток рака желудка среди шести клеток рака желудка мы рассмотрели. Однако его повышающая регуляция наблюдался более чем в половине желудка раковых тканей мы исследовали (рис 1). Трудно объяснить это несоответствие. Тем не менее, очевидно, что количество желудочного рака тканей мы исследовали недостаточно. Таким образом, обширное исследование, используя выражение гораздо большее количество тканей требуется оценить клиническую ценность в будущем.
<Р> Роль ТАБЛИЦЕ1 /MLL H3K4 метилтрансфераза комплекс в биологии рака является сложным. Регулирующие субъединиц Set1 /MLL комплексов, в том числе WRAD, содержат как мощные онкобелках и опухолевых супрессоров. Например, MEN1 ген кодирует Менинские, интегральный субъединицу MLL1 и MLL2 и мутирует у пациентов с множественной эндокринной неоплазии типа 1 (MEN1) [18, 19]. Кроме того, Менинские регулирует p18 (CDKN2C) и Р27 (cdkn1b) путем набора MLL1 комплекса [20]. В противоположность этому, WDR5, компонент комплекса WRAD, как сообщалось, действуют в качестве онкогена при раке предстательной железы, в котором она сверхэкспрессируется и решающий для андроген-индуцированной пролиферации опухолевых клеток [21]. ASH2L, что является еще одним компонентом WRAD комплекса и может взаимодействовать с онкобелку MYC [22], имеет решающее значение для MYC /Ha-RAS-зависимой трансформации крысы эмбриона фибробластов. Кроме того, он избыточно экспрессируется во многих видах опухолей и является критическим для пролиферации опухолевых клеток [23]. В настоящем исследовании мы показали роль DPY30 как онкогена в рак желудка.
<Р> Каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе роли DPY30 при раке желудка? Хотя мы не выявили, несколько гипотез могут быть предложены на основе предыдущих исследований. Одна из возможных гипотез является то, что DPY30 избыточная экспрессия приводит к overexpressions онкогенов за счет увеличения активности H3K4MT. Истощение DPY30 или ASH2L приводит к уменьшению H3K4me3, в то время как WDR5 и RBBP5 имеют решающее значение для всех трех видов H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 и H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Кроме того, повышенная экспрессия DPY30 только может увеличить H3K4MT активность [10]. Так как H3K4me2 /3 является активным метка для транскрипции [3, 24], увеличение H3K4MT может непосредственно апрегулируются много генов, такие как, онкогены, или в качестве альтернативы косвенно понижающей регуляции супрессоров опухолей. Один предыдущий доклад поддерживает эту гипотезу в том, что ASH2L, одним из важнейших компонентов SET1 /MLL комплекса, было показано, чтобы играть как онкогена [25, 26]. Другой предыдущий отчет в том, что DPY30 непосредственно активирует выражения ID белков с помощью H3K4 метилирования [13, 27]. ID белки ингибируют деятельность ETS1 и ETS2, которые могут индуцировать один из гена-супрессора опухоли, p16. В настоящем исследовании мы показали, что компоненты WRAD (WDR5, RBBP5 и ASH2L) могут ингибировать пролиферацию клеток рака желудка (рис 3), предполагая, что DPY30 действовать через повышенную активность H3K4MT. Дополнительные исследования необходимы, чтобы выявить механизмы, лежащие в основе роли DPY30 в желудочном раковых клеток.

• PLoS ONE: Анализ дерегулируемых микроРНК и их генов-мишеней в желудочном раке
• PLoS ONE: MED30 Регламентирует пролиферации и моторики желудочных клеток рака