Геномный анализ профиля диффузного типа желудочной cancers

геномного анализа профиля раковых опухолей диффузного типа желудка
Аннотация
Справочная информация
Рак желудка является третьим смертоносным среди всех раковых заболеваний во всем мире. Хотя заболеваемость раком желудка кишечного типа уменьшилась частота диффузного типа по-прежнему растет, и ее развитие, как известно, агрессивным. Там является недостаточная информация о вариациях генома рака желудка диффузного типа, потому что его клетки обычно смешивают с нормальными клетками, и этот низкий Клеточность затрудняет анализ генома.
Результаты
Мы анализируем целые геномы и соответствующие exomes рака желудка диффузного типа, с использованием согласованной опухоли и нормальные образцы из 14 диффузного типа и пять кишечного типа больных раком желудка. Соматические изменения, найденные в рака желудка диффузного типа сравнивают с таковыми кишечного типа, так и к ранее сообщенным варианты. Определим среднюю exonic соматическую частоту мутаций двух типов. Мы находим гены, связанные с драйверами кандидатов, а также определить семь новых соматических мутаций в CDH1
, которая является хорошо известный рак желудка-ассоциированный ген. Трехмерная структура анализ мутантного белка Е-кадгерина позволяет предположить, что эти новые соматические мутации могут вызвать значительные функциональные возмущения критических участков связывания кальция в EC1-2 перехода. Хромосомные анализ нестабильности показывает, что Mdm2
гена усиливается. После тщательного структурного анализа, ген TSC2 романа термоядерного
идентифицирована -RNF216
, который может одновременно нарушить опухолевые подавляющих путей и активировать туморогенез.
Выводы
Мы сообщаем о геномный профиль диффузного типа желудка рака, включая новые соматические вариации, нового гибридного гена, а также усиление и удаление некоторых участков хромосом, которые содержат онкогенов и опухолевых супрессоров.
фона
рак желудка занимает третье наиболее важной причиной глобальной смертности от рака [1]. Гистопатологически, рак желудка (GC) могут быть разделены на две категории, основанные на морфологических различий: кишечная типа GC (IGC) и диффузного типа GC (DGC) [2, 3]. IGC, как правило, ассоциируется с Helicobacter Pylori
инфекции, и особенно часто встречается в Японии и Корее [4-6]. DGC равномерно распределены географически, и включает в себя агрессивные клинические формы, такие как linitis ПЛАСТИКА, которые имеют плохой прогноз, особенно у молодых пациентов [7, 8]. Геномные модификации ДНК, приводящие к GC может произойти в результате нескольких экологических факторов риска, таких как высокое-солевой диеты и курения табака [9]. Хотя заболеваемость IGC устойчиво в течение нескольких десятилетий (снижение с 1978 по 2005 год 44%) уменьшилась, DGC резко возросло (на 62%) с 1978 до 2000, перед уменьшением немного в 2001-2005 годах [10]. Несмотря на кумулятивной доказательства того, что МСЗ и DGC развиваются с помощью различных канцерогенных путей [11, 12], подробная геномную масштаба данных для DGC которых не хватает из-за ограниченной доступности клинических образцов и низким уровнем чистоты популяции раковых клеток.
Для дата, очень немногие гены, связанные с GC подвидов были идентифицированы. В CDH1
ген, который кодирует белок E-кадгерина, являются наиболее известные гены, связанные с наследственной DGC (HDGC) [13-16]. Генетический скрининг для этих мутаций было предложено в целях диагностики раннего начала GC [17]. Е-кадгерин дисфункция, вызванная мутациями, потеря гетерозиготности и гиперметилированием промотора, является наиболее устоявшихся дефект в инициации GC и развития [18-20]. Исследование ассоциации генома показало, что полиморфизмы в стволе простаты гена клеточного антигена (ВВЦУ
) тесно связаны с предрасположенностью к DGC [21]. Метод микрочипов, однако, ограничена одиночными вариации нуклеотидных, и не может обнаружить копию нейтральной структурные вариации (SVS). Два недавних исследования сообщили о GC exomes, и показали, что мутации в гене ARID1A
часто обнаруживаются в ГХ с микросателлитных нестабильности, и в вирус Эпштейна-Барр (EBV) -положительным ШС [22, 23]. Никакой анализ GC подвидов не было выполнено, и большинство из анализируемых образцов в исследованиях были у пациентов с IGC.
Следующего поколения секвенирования (NGS) позволило исследователям обнаружить связанных с заболеванием вариаций, и помог раскрыть основные механизмы развития болезни. В частности, весь секвенирование генома (WGS) может обнаружить большинство геномных вариаций, в том числе КТС, такие как внутрихромосомные и межхромосомных перестроек. В качестве альтернативы, вся ExoME секвенирование (WES), метод секвенирования захваченный-мишень, может быть использован для высокой глубины секвенирования большого количества образцов при относительно низких затратах [24], хотя только одиночные вариации нуклеотидных (SNVs) и небольших вставках или делеции (вставкам) могут быть идентифицированы с помощью этого метода. WGS и WES у каждого есть свои преимущества и недостатки, а также ряд недавних исследований использовали оба метода [25-27].
Здесь мы приводим подробную характеристику DGC геномов из совпавшего опухоли и нормальных образцов путем создания целых геномных профилей с последующим WES , Мы использовали образцы крови в качестве нормального контроля, как и в предыдущих исследованиях [28-31]. Для того чтобы найти DGC-специфические вариации, IGC геномы были также проанализированы и сравнены с вариациями, идентифицированных в геномах РСК. Трехмерная структура белка анализ был проведен для новых соматических мутаций CDH1
гена, и это выявили критические области, которые были функционально изменены мутациями. Кроме того, мы нашли новый гибридный ген, который может быть причастен к онкогенеза.
Результаты и обсуждение
полного генома и секвенирование экзома
Опухоли и совпавших нормальных (кровь) образцов из 14 пациентов с DGC (в клинико-патологические характеристики из этих пациентов показаны в таблице S1 в дополнительном файле 1), которые были все относительно молодые (средний возраст 38 лет) корейских женщин, секвенировали с использованием Illumina HiSeq 2000, который произвел парноконцевое, 90-основания и 101-оснований ДНК читает. Кроме того, пять пар опухоли и совпадающая нормальные образцы от больных с IGC (средний возраст 42 лет) были подвергнуты секвенирования ДНК; один из этих образцов был определен позже как случай микросателлитных нестабильности (MSI) и, следовательно, был исключен из анализа мутаций. Ни один из образцов не имел семейный анамнез рака, и подтипы были подтверждены гистологически. Только опухолевые клетки собирали macrodissection после окрашивания гематоксилином.
Для всего анализа генома, в среднем, 92 gigabases (Gb) на образце было произведено приблизительно в 32 раз глубины секвенирования, достигнув 3,5 terabases (ТБ) в общей сложности, и были картирован на референсный геном (NCBI построить 37, hg19) со скоростью отображения больше, чем 94,5% (для статистики секвенирования см Дополнительный файл 1: Таблица S2). Используя окончательный 3,3 Тб сопоставляются читает, геномная база данных профиля была построена для обнаружения SNVs, копировать вариации числа (ВКК), и SVs. Поскольку сотовая чистота образца опухоли является критическим признаком в анализе генома рака, его оценивали с использованием метода расчета в доме (см Материалы и методы, см дополнительный файл 1: Таблица S3 и S1 Рисунок). Хотя мы постарались собрать только опухолевые клетки, наши образцы все еще показали высокий уровень стромальных примеси. Для повышения точности обнаружения мутаций в генных регионах даже в образцах с низким уровнем чистоты, дополнительные WES проводили при примерно в 103 раз глубины секвенирования в среднем, который произвел в общей сложности 17 Гб данных о последовательности. Захваченный WES покрыты 93,1% от генного области в 10 раз или более глубоко, и это покрытие аналогично ранее сообщенных данных ExoME на GC [22, 23].
Объединение данных WGS и Wes, мы обнаружили соматическую изменения в образцах DGC, и сравнили их с изменениями IGC (данные приведены на рисунке 1 в качестве циркового диаграммы). Чтобы проверить наши данные, мы объединили и проанализировали их с ранее сообщенным данным ExoME из двух различных исследований (24 IGC и 5 образцов DGC, не включая MSI и смешанных образцов) [22, 23] и из массива сравнительной геномной гибридизации данных (CGH) ( 16 IGC и 14 образцов DGC) [32]. Хотя эти исследования используются в основном КИГ и включал лишь небольшое количество образцов DGC, они могут дополнять друг друга нашим данным в качестве контроля (путем обеспечения увеличения количества данных, IGC и устранение тканевой специфичности). В комбинированном наборе данных, мы сравнили различия в изменениях между DGC и IGC образцов. Рисунок 1 Распределение Всего генома соматических мутаций и дублирования или удаления событий при раке диффузного типа желудка (РСК). Все соматические мутации, включая дублирование /удаления событий, которые были найдены в 14 DGC геномов, объединяются в цирковой сюжет. Снаружи внутрь, участок имеет следующие характеристики: хромосомная идеограммы, частота кумулятивных усиления или удаления событий (черный, усиления, красный, удаление), а также количество соматических, не синонимичные отдельных вариаций нуклеотидных (nsSNVs) вставки подсчитывали, и SNVs в сайтах сплайсинга для каждого гена. Черные треугольники обозначают весьма мутированные гены. Оранжевые треугольники обозначают онкогенов, и синие треугольники указывают на опухолевые супрессоры.
Идентификация SNVs диффузного типа конкретной и
вставки подсчитывали В каждой паре образцов, мы определили приблизительно 3,7 миллиона SNVs, которые были проверены с использованием одиночных нуклеотидных полиморфизма (SNP ) чипов (средняя скорость конкорданс: 99,2%; см дополнительный файл 1: Таблица S4), и приблизительно 0690000 (для вставки подсчитывали Подробности см Дополнительный файл 1: Таблица S5 и S6) Таблица. Сначала мы оценивали мутационный частоту обоих типов ГХ на одном уровне нуклеотидов (см дополнительный файл 1: Рисунок S2 а, б). Соматические мутации спектр преобладал C > T (G > A) есть переходы в обоих DGC и IGC образцов, и не было никаких существенных различий в мутационных контекстов между двумя типами GC, в соответствии с предыдущими исследованиями GC [23, 30]. Когда мы проанализировали два ранее сообщалось ExoME наборы данных, мы обнаружили, что спектр отношения нуклеотидных замен была аналогична нашим данным (см дополнительный файл 1: Рисунок S2C, д). Несмотря на то,
мутация спектр DGC подобен тому из IGC, отдельные мутации в генах пострадавших были различны. Путем вычитания мутации, найденные в нормальных геномах крови, мы идентифицировали 922 без синонимичные SNVs (nsSNVs) как соматические мутации в 18 образцах опухолей (см дополнительный файл 1: Таблица S7; см дополнительный файл 2). Средняя частота мутаций из 18 ШС (1,97 мутации /Mb) была сравнима с этим сообщалось в других исследованиях по толстой кишке, поджелудочной железы и рака печени [33-35]. Из 847 мутировавших генов, пострадавших от 922 nsSNVs, 581 были в 14 случаях DGC, 288 были в 4-х случаях IGC, и 22 (2,6%) были общими для обоих типов. Образец MSI, который был исключен из сравнительного анализа, показали примерно в шесть раз больше SNVs и вставкам, чем это делали другие образцы; Этот результат согласуется с предыдущим докладом [22]. Когда мы объединили два сообщалось ранее ExoME наборы данных, мы определили и 967 2,077 соматические nsSNVs в 19 и 28 РСК КИГ, соответственно. Соматические частота мутаций в КИГ (3,71 мутации /Mb в 28 образцах) был выше, чем у РСК (2,29 мутации /Mb в 19 образцах) (см дополнительный файл 1: Таблица S8). Ранее опубликованные исследования показали, что меланома и рак легких имеют высокую частоту мутаций, вследствие вовлечения мощных мутагенов [36]. Точно так же, вполне возможно, что МСЗ имеет такую ​​высокую частоту мутаций, так как его онкогенными механизм может быть связан с более окружающей среды и /или паразитарные мутагенов по сравнению с DGC.
Для индивидуальных вариаций, предполагаемые гены рака причинные были предсказаны расчета гена балла драйвера (см дополнительный файл 1: Таблица 1 и таблица S9). В CDH1
ген был обнаружен, чтобы быть обильно мутировали в DGC (P
= 1,29 × 10 -2), в том числе шесть соматических мутаций (три Миссенс, один нонсенс, один и рамки считывания одной мутации сайта сплайсинга) которые не были ранее сообщалось, в то время как только одна миссенс-мутации была обнаружена в образцах, IGC (таблица 2). Все семь CDH1
соматические мутации были проверены с помощью Sanger секвенирования (см дополнительный файл 1: Таблица S10 и S11 Таблица). В наших образцах DGC, 35,7% (5/14) имели CDH1
соматические мутации, и сообщалось, что частоты CDH1
соматических мутаций в спорадических РСК может варьироваться от 3% до более чем 50% [19 , 37-40]. Было подтверждено, что в странах с высоким уровнем заболеваемости спорадической GC (таких как Япония и Корея), частота мутаций зародышевой линии в семейной ШС мала по сравнению с, что в странах с низким уровнем заболеваемости [41, 42]. Таким образом, мы предполагаем, что общая частота GC также связана с частотой CDH1
соматических мутаций. Кроме того, одна мутация зародышевой (T340A) в CDH1
был найден в обеих опухолей и соответствующих геномов крови из двух образцов (D-14, DGC, M-01, MSI-типа). Хотя T340A является причинным мутация в HDGC [43], эти два пациента не было никакой истории семейной, таких как GC или очаговая рака молочной железы. Два предыдущих докладах, анализирующие ExoME данные GC не выявили CDH1
как высокоранжированных гена (только один миссенс мутации в образце MSI IGC) [22, 23]. Это несоответствие может быть из-за небольшого количества образцов DGC в этих исследованиях (2 из 22 и 3 из 15 образцов были РСК, соответственно). В настоящей работе, PIK3CA
и TP53
, известный рак гены, связанные, были наиболее часто мутируют гены в обоих DGC и ВУС смотри таблицу 1 и таблицу S9 в дополнительном файле 1. Мутации двух известных PIK3CA
горячие точки (E545K и H1047L) были обнаружены в четырех пробах DGC. Кроме того, одна мутация nsSNV (Q546K) рядом с мутацией E545K была обнаружена в одном образце DGC. В общей сложности 5 из 14 образцов DGC (приблизительно 30%) таил nsSNVs в PIK3CA
, что онкоген, чей мутантной формы проявляет повышенную активность киназы, вызывая пролиферацию раковых клеток [44]. Затем мы сравнили с низкой частотой (16-17%) от nsSNVs в PIK3CA
в докладах других работах [22, 23, 44] (которые в основном использовались образцы IGC), а также результаты нашего совместного анализа (31,5% для DGC , 14,3% для IGC) (см дополнительный файл 1: Таблица S9). Представляется, что относительно высокие темпы мутации PIK3CA
в DGC может отражать специфику мутаций в этом гене к этому типу рака. Кроме того, три образца (два DGC и один IGC) содержит как nsSNV и потери от копирования TP53
, что указывает на гомозиготный потерю функции в TP53
, как сообщалось ранее [45]. SNP в гене ВВЦУ
(rs2976329) сообщается, связано с повышенным риском развития DGC в японских и корейских населения [21]. Этот SNP также обогащены в большинстве образцов DGC в нашем исследовании, (9 из 14 пациентов), что свидетельствует о том, что наши проанализировали образцы представляют собой типичные пациенты с DGC в Восточной Азии. Кроме того, нонсенс мутации (R1446 *) в ARID1A
гена, был обнаружен в одном образце DGC (D-08). Хотя мутации в ARID1A
часто обнаруживаемых в MSI и EBV-позитивных ШС [22, 23], образец D-08 не показали EBV инфекции, и образец MSI (M-01) не было никакого ARID1A <бр> генные мутации либо. Из вариаций генов-кандидатов, водитель 88 nsSNVs, 4 маленьких вставкам и 2 SNVs в были проверены с использованием обычных Sanger секвенирования стыковочной сайта. Семь из этих мутаций не могут быть проверены из-за отказа ПЦР, а из оставшихся 87 мутаций, 96,6% были подтверждены в качестве истинных соматических мутаций (см дополнительный файл 1: Таблица S10 и S11 Таблица) .table 1 Лучшие гены-кандидаты драйверов в 14 диффузной -типа рака желудка
Gene

Образцы, п

nsSNVs, п

SNVs в сплайс-сайте, п

вставкам, п

P
-value

Driver счет гена

PIK3CA

5 страница 5 0 0

3,63 × 10 -12
9,83
CDH1

5 4
1
1
4,64 × 10-10
8,02
SNRPN
<бр> 2 страница 2 0 0

1,86 × 10-07
5,60
TP53 2
2
0
0
4,88 × 10-07
5,36
CMKLR1 2
2
0 0

5,33 × 10-07
5,36
CYP2A7 2
2
0 0

1,53 × 10-06
4,99
GUCY1B3 2
2
0
0
1,97 × 10-06
4,99
PAPOLB 2
2
0 0

2,15 × 10-06
4.99
MYH9 3
3
0 0

2,27 × 10-06
4,99
FAM71B

1
2
0 0

2,51 × 10-06
4,99
C10orf90 2
2
0 0

3,76 × 10 -06
4,86 ​​
AKAP8 2
2
0 0

4,59 × 10-06
4,81
ZC3H12B
<бр> 2 страница 2 0 0

5,87 × 10-06
4,74
SFTA3

1
1
0
0
6,86 × 10-06
4,70
SENP7 2
2
0 0

7,65 × 10-06
4,68
TMPRSS6 2
2
0 0

8,38 × 10-06
4,67
СТР.2

1

1 0
0
9,94 × 10-06
4,62
Для получения дополнительных списков генов драйвера см дополнительный файл 1:. Таблица S9
Таблица 2 CDH1 изменения в 18 рака желудка
образца <бр>
Введите

переделка

CDH1
регион

D-01 T
ХНОП
Потеря
экзоны 1 до 16 <бр> D-02 T
SNV
N256S
Экзон 6
ХНОП
Потеря
экзонов от 1 до 16
D-03 T
SNV
сайт сплайсинга
Донор сайт Интрон 4
D-04 T
CNV
Потеря
экзоны от 1 до 16
D-05 T
SNV
D257N
Экзон 6
INS
S829fs
Экзон 16
точка D-09 T
SNV
V252G
Экзон 6
SV
Перерыв
Интрон 2
D -10 T
ХНОП
Потеря
экзонов от 1 до 16
D-11 T
CNV
Потеря
экзонов от 1 до 16
D-12 T
SNV
Q23 *
экзон 2
D-13 T
CNV
Потеря
экзонов от 1 до 16
SV
Перерыв точку
интроны 2 и 10
D-14 T
SV
точка разрыва
интроны 2, 5 и 9
I-01 T
ХНОП
Потеря
экзоны 1 до 16
I -02 T
ХНОП
Потеря
экзоны 1 до 16
I-03 T
SNV
D221G
Экзон 5
SV
Перерыв точка
интроны 10 и 13
I-04 T
ХНОП
Потеря
экзоны 1 до 16
CNV, копировать изменение числа; INS, небольшой вставки; SNV, однонуклеотидным вариации; С.В., структурные различия.
Соматические изменения были затем отображаются на Киото Энциклопедии Гены и геномы (KEGG) пути прохождения базы данных. Этот анализ показал, что мутированные гены были РСК в значительной степени связано с кальциевой сигнализации пути (P
= 7,00 × 10 -5, см дополнительный файл 1: Таблица S12 и S13) Таблица. Низкое потребление кальция может способствовать развитию GC [46]. Кальций необходим для функции E-кадгерина, и потеря Е-кадгерин-опосредованной адгезии участвует в переходе от доброкачественного поражения с инвазивными метастатическим раком [47]. Кроме того, соматические мутации были тесно связаны с путями связанных с немелкоклеточного рака легкого (P
= 1,00 × 10 -6 в DGC и P
= 4,24 × 10 -2 в IGC). В частности, гены, участвующие в пути фокальных адгезии, таких как ITGA
, PIK3CA
и PTEN
, часто мутируют.
С.В. и анализ ХНОП
КТС были обнаружены на основе дискордантно отображенных чтения пары, а также любые SVs, которые присутствовали в зародышевых геномов пациентов были исключены. В среднем, мы нашли 552 соматические SVS за пару образцов DGC (211 больших вставок, 264 больших удалений, 27 инверсий, 44 внутрихромосомные транслокаций и 6 межхромосомные транслокаций). Найдено 664 соматические SVS в каждом образце пары IGC (285 больших вставок, 283 большие делеции, 34 инверсий, 38 внутрихромосомные транслокации и 24 межхромосомные транслокации) (для деталей для каждого образца, см дополнительный файл 1: Таблица S14 и рис S3). Кроме того, мы обнаружили 2,258 гены обесцененным, и 1736 из них были найдены только в образцах DGC (для данных для каждого образца, см дополнительный файл 1: Таблица S15 и увидеть дополнительный файл 3). Три гена-супрессоры FHIT
, WWOX
и MIPOL1
, о которых сообщалось в предыдущем исследовании GC [30], имели нарушения в связи с SVs (FHIT
в 11 образцах, WWOX <бр .> в 5 образцах, а также MIPOL1
в 3-х образцах)
слитых генов, генерируемых хромосомной перестройкой также были проанализированы, и были идентифицированы 19 кандидатов слитый ген (см дополнительный файл 1: Таблица S16), которое включает новый фьюжн ген, TSC2
-RNF216
, найденных в одном образце (рис 2а, б). TSC2
кодирующая белок туберин ранее был предложен в качестве ген-супрессор опухолей, участвующих в мишени рапамицина млекопитающих (МРМ), затрагивающего пути [48, 49]. Кроме того, RNF216
, кодирование E3 убиквитин-протеин лигазы участвует в функции цитокина, предотвращая устойчивую активацию ядерного фактора (NF) -κB [50]. Rap GTPase активизируя белок (Rap-GAP) домен белка TSC2, который связан с внутренней GTPase активности Ras-родственных белков RAP1A и Rab5, была нарушена этой хромосомной транслокации (рис 2С). Кроме того, цинковых пальцев домены белка RNF216 не были выражены в слитого гена, из-за рамки считывания, которое вызвало преждевременное завершение. С помощью обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с последующим анализом методом секвенирования, экспрессия этого слитого гена в ткани пациента была подтверждена. После тестирования дополнительный набор 15 GC тканей пациента, мы определили 2 пациентов, выражающих слитого гена (рис 2d, е). Эта хромосомная транслокация может привести к изменению клеточного поведения как, нарушая нормальное функционирование гена и вызывая экспрессию продукта гена слияния, который может конкурировать с нормальным геном. Слитый ген может мешать конкурентно-супрессоров опухолей путей и активации NF-kB-опосредованную передачу сигналов цитокина. Рисунок 2 TSC2 - RNF216 слитый ген поломки. (А) Эксон структура TSC2
-RNF216
слитый ген. Цифры в коробках являются экзонов числа каждого гена. Красные линии обозначают точки слияния. (Б) домен белка структура гибридного белка TSC2-RNF216. Домен Rap-GAP из TSC2 был сломан, и RNF216 была мутация, вызывающая сдвигом рамки преждевременного прекращения с помощью межхромосомной перегруппировки. (С) Структура TSC2 домена Rap-GAP. Красная область оставшаяся область домен Rap-GAP, а серая область является областью Rap-GAP, который удаляется в TSC2
-RNF216
слитого гена. Последовательность (d) РНК TSC2
-RNF216
слитый ген. Позиция 136 показан как N. либо A или G база производит кодон терминации (ТАА или TAG). (Е) проверка TSC2
-RNF216
слитого транскрипта в РНК (кДНК) с помощью ПЦР-амплификации и электрофореза.
В РСК, хромосомах 16, 17, 19, 20, 21, и 22, содержащиеся повышенное количество блоков делеций, в то время как хромосомы 3, 7, 8 и 13 показали заметно упал дупликации (рисунок 1). Многие гены-супрессоры опухолей, такие как CDH1
, PLA2G2A, RUNX3
, SMAD2
и TP53
, расположены в широко удаленных хромосомных регионах. Примечательно, что соматические мутации (nsSNV или сайт сплайсинга мутации) и копия потери количество CDH1
в целом были взаимоисключающими: четыре из пяти образцов DGC с соматической мутации не имеют потери числа копий гена, и восемь из девяти образцов с DGC CDH1
потери числа копий гена не было соматические мутации в CDH1
. Только один образец (1/18, 5.6%) имели как изменения (мутации и копировать Потеря числа) одновременно, и это наблюдение совпадает с предыдущими исследованиями, сообщая, что сопутствующее изменения в CDH1
редки [19, 40, 51, 52] , Когда мы рассматривали SVs в CDH1
вместе, мы обнаружили, что другие три образца имели мутации /копии потери номер с сопутствующим SV. Кроме того, число копий онкогена MYC
были увеличены в пяти образцах DGC (см дополнительный файл 4), а затем скопировать номера MET
были увеличены в трех образцах DGC [53]. Онкогенов MOS
и ZHX2
также показал прирост числа копий в пяти и четырех образцах DGC соответственно. Более половины образцов (10 из 18) показали снижение числа копий ARID1A
, который является движущей силой гена яичников ясном клеточной карциномы, и хроматина перемодельер в GC [22, 54, 55]. Известно, что большинство ШС с ARID1A
мутаций показывают более низкую экспрессию белка по сравнению с ШС без ARID1A
мутации [22]. Если доза эффект важен в этих раковых тканях, копия уменьшение количества ARID1A
может быть возможным рак-ассоциированный фактор
большой области хромосомы 12 был усилен в трех DGC геномов. из этих трех геномов, образцы Д-01 Т и Д-02 Т показал отчетливо большое усиление (рис 3а). Узоры дублирование немного отличались: Д-01 Т имела дублирования тандем 3 МВР, тогда как D-02 Т имели перевернутую дублирование 1 ОБМ (3б, в). В некоторой части этого дублируется области кодирует ген мышиного двойной минуты (MDM2
). Было сообщено, что в небольшом наборе данных Mdm2
гена часто усиливается [56], и что этот ген связан с несколькими рака [57]. MDM2
суперэкспрессия вызванное амплификации гена была подтверждена экспериментально с использованием количественной ОТ-ПЦР с опухолью и прилежащие ткани парных образцах нормальных, используемых для NGS анализов, и нормальные клеточные линии были включены для сравнения (Рис 3). Mdm2
избыточная экспрессия положительно коррелирует с данными анализа числа копий. Хотя ранее сообщалось массив данных CGH [32] имели относительно низкое разрешение для обнаружения CNV, мы использовали эти данные для поиска смещения в изменения гена количества копий в каждом гистопатологического типа. Прирост числа копий генов, кодирующих белки кальциевых каналов (CACNG6
, CACNG7
и CACNG8
, P = 4,24
× 10 -2) значительно чаще в образцах DGC (см Дополнительный файл 1: Таблица S17). Вся информация интегрирована изменения приведена в разделе Дополнительные файлы (см дополнительный файл 1: Таблица S18 и S19 таблице, см дополнительный файл 5). Рисунок 3 Дублирование области гена MDM2 на хромосоме 12 в образцах D-01 Т и Д-02 Т (а) глубина Картирование участков двух хромосом. (Б) Тонкие черные шипы считывали при глубине отображения ширины 2000 базы. У
Оу показывает относительную глубину. Каждый блок представляет собой примерно в 30 раз больше глубины секвенирования. (с) позиции генов и имена вокруг усиленных регионов. Черные полосы показывают расположение генов. (D) Mdm2
уровни транскриптов в опухоли и прилегающих тканей парных образцах нормальных и нормальных клеточных линий. Количественный ОТ-ПЦР использовали для измерения MDM2
уровни мРНК в образцах D-01 и D-02 (содержащие амплифицированный MDM2
регионов), D-04, D-05, D-10, I-03, и I-04 (без усиленных MDM2
областей), и три нормальные клеточные линии (HDF, HMEC и Hs 738.St/Int~~number=plural). Усы были рассчитаны из двух отдельных экспериментов в трех повторах реакций.
3D структурный анализ мутантного CDH1
Чтобы понять, как обнаруженные мутации затрагивают белковую структуру /функцию и активацию вниз по течению биологических путей влияния на канцерогенез, мы проанализировали трехмерные ( 3D) структуры мутантного белка Е-кадгерина найден в одном IGC и пять образцов DGC (см дополнительный файл 2). В CDH1
ген кодирует кальций-зависимой клеточной адгезии гликопротеин и имеет пять внеклеточных доменов кадгерина (EC1-EC5) (рис 4а). Известно, что взаимодействие между кадгерина и кальций необходим для димеризации, структурной жесткости и защиты от протеолитической деградации [58]. Мутации в EC1-2 и EC2-3 переходов, как известно, вызывают неправильную локализацию кадгерина и клеточную адгезию уменьшенную [59]. Структурный анализ проводили на четырех nsSNVs (D221G, V252G, N256S и D257N), за исключением нонсенс SNV (Q23 *), вставки со сдвигом рамки (S829fs), и сайт сплайсинга (chr16: 68842472) мутации. Все четыре nsSNVs были расположены на стыке между EC1 и EC2 (EC1-2 соединения) (рис 4, б), а также три nsSNVs (D221G, N256S и D257N) находились в области белка, который непосредственно взаимодействует с ионом кальция (рис 4г, д). Такая ситуация может привести к аномальным взаимодействий между доменами кадгерина. Сообщается, что A298t, D231K и D231A мутации, которые имеют аналогичную структурную позицию на EC1-2 перехода к соматических мутаций, обнаруженных в данном исследовании, показали потерю функции адгезии клеток [60, 61]. Другая мутация nsSNV, V252G, находится в структуре β-листа кадгерина, а его боковая цепь ориентирована внутрь. Так как β-бочонка структуры обычно содержат чередующиеся полярные и гидрофобные аминокислоты с гидрофобными остатками, ориентированных в направлении внутрь цилиндра, чтобы сформировать гидрофобную сердцевину, а полярные остатки, ориентированные по направлению к внешней стороне ствола на поверхности растворителя раскрылся, формирование гидрофобного ядра может быть затруднено из-за мутации V252G (рис 4д). Предыдущее исследование ExoME сообщили о двух CDH1
мутации, P127fs (мутация в рамки считывания с DGC) и V694I (в MSI МСЗ) [22]. Димеризация двух молекул кадгерина в любом цис
или транс-конфигурации
произошло на стыке между EC1-2 и EC1-2 [62], в то время как мутации на EC3-4 и EC4-5 перекрестки не оказывает существенного влияния клеточной адгезии [59]. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Механизмы gastroprotection метанола экстракт листьев меластома малабарская
• Более высокая частота CagA EPIYA-C сайтов фосфорилирования в хеликобактерной штаммы из первой степени родства бол…