Genomische profiel analyse van diffuse-type maag cancers

genomische profiel analyse van diffuse-type maagkanker
Abstracte achtergrond
Maagkanker is de derde deadliest van alle vormen van kanker wereldwijd. Hoewel incidentie van de intestinale type maagkanker is afgenomen, is de incidentie van diffuse type nog steeds toe en de progressie is berucht agressief. Er onvoldoende gegevens over genoomvariaties diffuse type maagkanker omdat de cellen gewoonlijk gemengd met normale cellen, en dit lage cellulariteit heeft het moeilijk gemaakt om het genoom analyseren.
Resultaten
Wij analyseren geheel genomen en bijbehorende exoom diffuse type maagkanker, middels afgestemd tumor en normale monsters van 14 diffuse type en vijf intestinale type maagkanker patiënten. Somatische wijzigingen in het diffuse type maagkanker vergeleken met die van de intestinale-type en met eerder gerapporteerde varianten. We bepalen de gemiddelde exon somatische mutatie snelheid van de twee soorten. We vinden geassocieerde kandidaat-bestuurder genen, en identificeren van zeven nieuwe somatische mutaties in CDH1
, dat is een bekende maag-kanker-geassocieerde gen. Driedimensionale structuuranalyse van het gemuteerde E-cadherine eiwit suggereert dat deze nieuwe somatische mutaties functioneel significante verstoringen van kritieke calcium bindingsplaatsen in de EC1-2 splitsing kan veroorzaken. Instabiliteit van chromosomen analyse blijkt dat de MDM2
gen wordt versterkt. Na een grondige structurele analyse, een nieuw fusiegen TSC2
-RNF216
is geïdentificeerd, die tegelijkertijd kunnen verstoren tumor-onderdrukkende paden en het ontstaan ​​van tumoren te activeren.
Conclusies
Wij rapporteren de genomische profiel van diffuse-type maag kankers met inbegrip van nieuwe somatische varianten, een nieuwe fusie-gen en amplificatie en schrapping van bepaalde chromosomale regio's die oncogenen en tumor suppressors bevatten. achtergrond
Maagkanker geldt als de op twee na belangrijkste oorzaak van de wereldwijde sterfte kanker [1]. Histopathologisch, kan maagkanker (GC) in twee categorieën worden ingedeeld op basis van morfologische verschillen: intestinaal-type GC (IGC) en diffuse-type GC (DGC) [2, 3]. IGC wordt doorgaans geassocieerd met Helicobacter pylori
infectie, en is vooral veel voor in Japan en Korea [4-6]. DGC gelijkmatig verdeeld geografisch en bevat agressieve klinische vormen, zoals Linitis Plastica, die een slechte prognose, vooral bij jonge patiënten [7, 8]. Genomisch DNA modificaties waardoor GC kan gebeuren als gevolg van een aantal milieurisicofactoren zoals een hoog-zout dieet en roken [9]. Hoewel de incidentie van IGC gestaag tientallen jaren (44% reductie 1978-2005) is afgenomen, DGC snel gestegen (met 62%) van 1978 tot 2000, voordat een lichte daling in 2001-2005 [10]. Ondanks de cumulatieve bewijs dat IGC DGC ontwikkelen via verschillende wegen carcinogene [11, 12], gedetailleerde genomische schaal gegevens DGC ontbreken vanwege de beperkte beschikbaarheid van klinische monsters en een geringe zuiverheid van de celpopulatie kanker. Belgique Om heden zijn zeer weinig genen geassocieerd met GC subtypes geïdentificeerd. De CDH1
gen, dat de E-cadherine eiwit codeert, zijn de meest bekende genen geassocieerd met erfelijke DGC (HDGC) [13-16]. Genetische screening voor deze mutaties is met het oog op de diagnose van vroege-onset GC [17] voorgesteld. E-cadherine disfunctie veroorzaakt door mutaties, verlies van heterozygositeit en promotor hypermethylatie, is de gevestigde defect in GC initiatie en ontwikkeling [18-20]. Een genoom-brede associatie studie toonde aan dat polymorfismen in de prostaat stamcel antigen (PSCA
) sterk geassocieerd met gevoeligheid voor DGC [21]. De microarray gebaseerde methode is echter beperkt tot single nucleotide variaties, en kan geen copy-neutraal structurele variaties (SV's) op te sporen. Twee recente studies van GC exoom, en toonde aan dat mutaties in het gen ARID1A
vaak waargenomen in GC met microsatelliet instabiliteit, en Epstein-Barr virus (EBV) -positieve GC [22, 23]. Geen analyse van GC subtypes werd uitgevoerd, en de meerderheid van de in de studies geanalyseerde monsters waren van patiënten met IGC.
Next-generation sequencing (NGS) heeft toegestaan ​​onderzoekers om ziekte-geassocieerde variaties op te sporen, en hielp ontdekken de onderliggende mechanismen van ziekteontwikkeling. In het bijzonder kan whole genome sequencing (WGS) detecteren meeste genetische varianten, zoals SV's, zoals intrachromosomale interchromosomal en herschikkingen. Alternatief exoom sequencing (WES), een gevangen doelsoorten sequencing methode kan worden gebruikt voor high-diepte sequentiebepaling van een groot aantal monsters bij een relatief lage kostprijs [24], hoewel slechts enkele nucleotide veranderingen (SNVs) en kleine inserties of deleties (indels) kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze methode. WGS en WES hebben elk voor- en nadelen, en een aantal recente studies hebben beide methoden [25-27] gebruikt.
Hier presenteren wij gedetailleerde karakterisering van DGC genomen uit geëvenaard tumor en normale monsters door het genereren van hele genoom profielen, gevolgd door WES . We gebruikten bloedmonsters als een normale controle, net als in eerdere studies [28-31]. Om DGC-specifieke variaties vinden, werden IGC genoom geanalyseerd en vergeleken met variaties geïdentificeerd in genoom van DGCs. Driedimensionale eiwitstructuur analyse werd uitgevoerd voor nieuwe somatische mutaties van het CDH1
gen en deze geïdentificeerde kritische gebieden die functioneel zijn gewijzigd door de mutaties. Daarnaast vonden we een nieuwe fusie gen dat betrokken zou zijn bij het ontstaan ​​van tumoren.
Resultaten en discussie
hele genoom en exome sequencing
Tumor en afgestemd normaal (bloed) monsters van 14 patiënten met DGC (de klinisch-pathologische kenmerken deze patiënten zijn in tabel S1 aanvullende bestandsinformatie 1), die allemaal relatief jong (gemiddelde leeftijd 38 jaar waren) Koreaanse vrouwen, werden gesequenced met behulp van een Illumina HiSeq 2000, die gepaard einde 90 basen en 101 basen DNA geproduceerd leest. Bovendien, vijf paar tumor en gekoppeld normale monsters van patiënten met IGC (gemiddelde leeftijd 42 jaar) werden onderworpen aan DNA-sequentiebepaling; één van deze monsters werd later geïdentificeerd als een geval van microsatelliet instabiliteit (MSI) en daardoor uitgesloten van de mutatieanalyse. Geen van de monsters had geen familiale voorgeschiedenis van kanker, en de subtypen werden histopathologisch bevestigd. Slechts tumorcellen werden afgefil- macrodissection na hematoxyline kleuring.
Voor het volledig genoomanalyse gemiddeld 92 gigabases (Gb) per monster werden geproduceerd op ongeveer 32 maal sequencing diepte, tot 3,5 terabases (Tb) in totaal, en waren toegewezen aan de referentie-genoom (NCBI bouwen 37, hg19) op een kaart brengen van meer dan 94,5% (voor sequencing statistieken, zie Extra file 1: Tabel S2). Met behulp van de laatste 3,3 TB aan in kaart gebracht leest, een genomische profiel databank werd gebouwd voor het opsporen van SNVs, copy number variations (CNV) en, en SV. Omdat de cellulaire zuiverheid van een tumor monster is een kritische functie bij kanker genoomanalyse, werd geëvalueerd met behulp van een in-house berekeningsmethode (zie materialen en werkwijzen, zie Extra file 1: Tabel S3 en figuur S1). Hoewel we hebben geprobeerd om alleen tumorcellen verzamelen, toonden onze nog een hoog stromale mengsel. Om de nauwkeurigheid van de mutatie detectie in gene regio's, zelfs in monsters lage zuiverheid te verhogen, werd extra WES uitgevoerd bij ongeveer 103 keer sequencing diepte gemiddeld, wat een totaal van 17 Gb sequence data geproduceerd. De gemaakte WES onder 93,1% van de gene gebied aan 10 maal of meer diepte en deze dekking is vergelijkbaar met die van eerder gerapporteerde exome gegevens van GC [22, 23].
Combineren de WGS Wes data gedetecteerd we somatische veranderingen in de DGC monsters, en vergeleken ze met de IGC wijzigingen (de gegevens worden samengevat in figuur 1 als een circus diagram). Om onze gegevens te controleren, we gecombineerd en ze geanalyseerd met eerder gerapporteerde exome gegevens uit twee verschillende onderzoeken (24 IGC en 5 DGC monsters, niet met inbegrip van MSI en gemengde monsters) [22, 23] en uit scala comparatieve genoom hybridisatie (CGH) data ( 16 IGC en 14 DGC monsters) [32]. Hoewel deze studies hoofdzakelijk IGC en omvatte slechts een klein aantal monsters DGC, kunnen ze complementair aan onze gegevens als controle worden (door een verhoogd aantal IGC data en eliminatie van weefselspecificiteit). In de gecombineerde dataset, vergeleken we de verschillen in veranderingen tussen de DGC en IGC samples. Figuur 1 Hele genoom distributie van somatische mutaties en duplicatie of deletie gebeurtenissen in diffuse-type maagkanker (DGCs). Alle somatische mutaties, inclusief duplicatie /deletie gebeurtenissen, die werden gevonden in de 14 DGC genomen, worden samengevoegd in het circus plot. Van buiten naar binnen, de plot geeft de volgende kenmerken: chromosoom ideogrammen, de frequentie van de cumulatieve versterking of verwijdering evenementen (zwart, versterking, rood, schrapping), en het aantal somatische niet synoniem single nucleotide variaties (nsSNVs), indels, en SNVs in splitsingsplaatsen voor elk gen. Zwarte driehoekjes geven sterk gemuteerde genen. Oranje driehoeken duiden oncogenen en blauwe driehoeken geven de tumor onderdrukkers.
Identificatie van diffuse-type-specifieke SNVs en indels
In elk monster paar, identificeerden we ongeveer 3,7 miljoen SNVs, die werden gecontroleerd met behulp van single nucleotide polymorfismen (SNP ) chips (gemiddeld concordantie tarief: 99,2%, zie Extra file 1: Tabel S4), en ongeveer 0.690.000 indels (voor details, zie Extra file 1: Table S5 en Tabel S6). We hebben eerst onderzocht mutatie frequentie van beide typen GC op nucleotide niveau (zie aanvullende bestand 1: Figuur S2 a, b). De somatische mutatie spectrum werd gedomineerd door C > T (G > A) overgangen in zowel de DGC en IGC monsters, en er waren geen significante verschillen in mutationele verbanden tussen de twee GC, in overeenstemming met eerdere studies van GC [23, 30]. Als we geanalyseerd twee eerder gemeld exome datasets, vonden we dat het spectrum van de nucleotide substitutie verhouding vergelijkbaar met onze gegevens (zie aanvullende bestand 1: Figuur S2c, d).
Hoewel mutatiespectrum van DGC is vergelijkbaar met die van IGC, individuele mutaties in genen die betrokken waren anders. Door het aftrekken van mutaties gevonden in normaal bloed genomen, we geïdentificeerd 922 niet-synoniem SNVs (nsSNVs) als somatische mutaties in de 18 tumor monsters (zie Extra file 1: Table S7, zie Extra file 2). De gemiddelde mutatie snelheid van de 18 GC (1,97 mutaties /Mb) was vergelijkbaar met die gerapporteerd in andere studies over de dikke darm, alvleesklier en lever kanker [33-35]. Van 847 gemuteerde genen beïnvloed door de nsSNVs 922, 581 waren 14 DGC gevallen, 288 waren 4 gevallen IGC en 22 (2,6%) waren beide soorten gemeen. De MSI monster, die zich uit de vergelijkende analyse werd uitgesloten, toonden ongeveer zes keer meer SNVs en indels dan heeft de andere monsters; Dit resultaat is in overeenstemming met een vorige verslag [22]. Toen we combineerden de twee eerder gerapporteerde exome datasets, identificeerden we 967 en 2077 somatische nsSNVs in 19 DGCs en 28 IGC's, respectievelijk. De somatische mutatie koers van de IGC (3,71 mutaties /Mb in de 28 monsters) was hoger dan die van de DGCs (2,29 mutaties /Mb in de 19 monsters) (zie Extra file 1: Tabel S8). Eerder verschenen onderzoek suggereert dat melanoom en longkanker hebben hoge mutatie tarieven, als gevolg van de betrokkenheid van de potente mutagene stoffen [36]. Ook is het mogelijk dat de IGC heeft deze hoge mutatie snelheid, omdat de tumorigene mechanisme kan worden geassocieerd meer met het milieu en /of parasitaire mutagene vergelijking met DGC.
Voor individuele variaties werden vermeende kanker-veroorzakende genen voorspeld door de bestuurder gen score berekening (zie Extra file 1: Tabel 1 en Tabel S9). De CDH1
gen werd gevonden overvloedig worden gemuteerd in DGC (P
= 1,29 × 10 -2), waaronder zes somatische mutaties (drie missense, een onzin, een frameshift, en één splitsingsplaats mutaties) die niet eerder gerapporteerd, terwijl slechts één missense mutatie werd gevonden in de IGC monsters (Tabel 2). Alle zeven CDH1
somatische mutaties werden geverifieerd door Sanger sequencing (zie Extra file 1: Tafel S10 en tabel S11). In onze DGC monsters, 35,7% (5/14) was CDH1
somatische mutaties, en het is gerapporteerd dat de frequentie van CDH1
somatische mutaties in sporadische DGCs kan variëren van 3% tot meer dan 50% [19 , 37-40]. Er werd vastgesteld dat in landen met een hoge incidentie van sporadische GC (zoals Japan en Korea), de frequentie van de kiemlijn mutaties in familiaire GC is laag in vergelijking met die in een lage incidentie landen [41, 42]. Derhalve speculeren wij dat de totale incidentie GC ook gerelateerd aan de frequentie van CDH1
somatische mutaties. Daarnaast is een kiembaanmutatie (T340A) in CDH1
werd gevonden in zowel de tumor en de bijbehorende bloed genomen van twee monsters (D-14, DGC; M-01, MSI-type). Hoewel T340A is een oorzakelijke mutatie in HDGC [43], hebben deze twee patiënten geen familiale geschiedenis zoals GC of lobulair borstkanker. Twee eerdere rapporten analyseren exome gegevens van GC niet identificeren CDH1
als een hoog aangeschreven gen (slechts één missense mutatie in een MSI IGC monster) [22, 23]. Dit verschil kan worden veroorzaakt door het kleine aantal monsters DGC in deze studies (2 van 22 en 3 van de 15 monsters werden DGCs respectievelijk). In het huidige werk, PIK3CA
en TP53
, bekende kanker-geassocieerde genen, waren de meest frequent gemuteerde genen in zowel DGC en IGC zie Tabel 1 en Tabel S9 in Extra file 1. Mutaties in twee bekende PIK3CA
hotspots (E545K en H1047L) werden gevonden in vier DGC monsters. Daarnaast is een nsSNV mutatie (Q546K) nabij de E545K-mutatie werd gevonden in een DGC monster. In totaal 5 van 14 DGC monsters (ongeveer 30%) vertoonden nsSNVs in PIK3CA
, die een oncogen waarvan de gemuteerde vorm vertoont verhoogde kinaseactiviteit, waardoor de proliferatie van kankercellen [44]. We vergeleken de lage frequenties (16-17%) van de in nsSNVs PIK3CA
in rapporten door anderen [22, 23, 44] (die meest gebruikte IGC monsters) en de resultaten van gecombineerde analyse (31,5% voor DGC , 14,3% voor de IGC) (zie Extra file 1: Tabel S9). Het blijkt dat de relatief hoge mutatiesnelheden van PIK3CA
in DGC de specificiteit van mutaties in dit gen kunnen weerspiegelen dit type kanker. Bovendien, drie monsters (twee DGC en één IGC) bevatte zowel nsSNV en een kopie verlies van TP53
, hetgeen een homozygoot functieverlies in TP53
, zoals eerder beschreven [45]. Een SNP in het PSCA
gen (rs2976329) is gemeld te worden geassocieerd met een verhoogd risico van DGC in Japanse en Koreaanse bevolking [21]. Dit SNP is verrijkt in de meeste DGC monsters in ons onderzoek (9 van de 14 patiënten), wat aangeeft dat onze analyse representeren typische patiënten met DGC in Azië. Daarnaast is er een nonsense mutatie (R1446 *) in de ARID1A
gen, werd gevonden in een DGC monster (D-08). Hoewel mutaties in ARID1A
worden vaak aangetroffen in MSI en in EBV-positieve GC [22, 23], de D-08 steekproef toonde geen EBV-infectie, en een MSI monster (M-01) had geen ARID1A
genmutaties niet. Van variaties in de kandidaat-bestuurder-genen, 88 nsSNVs, 4 kleine indels en 2 SNVs in een splice site zijn geverifieerd met behulp van conventionele Sanger sequencing. Zeven van deze mutaties niet konden worden getest in verband met PCR falen, en van de resterende 87 mutaties, werden 96,6% bevestigd als ware somatische mutaties (zie Extra file 1: Tafel S10 en tabel S11) .table 1 top kandidaat-bestuurder-genen in 14 diffuse -type maagkanker
Gene
Samples, n
nsSNVs, n
SNVs in splice site, n
indels, n

P
-waarde
Driver gen score
PIK3CA
5
5
0
0
3,63 × 10 -12
9.83
CDH1
5 verhuur 4
1 1
4.64 × 10-10
8,02
SNRPN

2 2
0
0
1.86 × 10-07
5,60
TP53 kopen van 2 2
0
0
4.88 × 10-07
5,36
CMKLR1
2 2
0
0
5.33 × 10-07
5.36
CYP2A7 het kopen van 2 2
0
0
1,53 × 10-06
4.99
GUCY1B3 kopen van 2 2
0
0
1.97 × 10-06
4.99
PAPOLB
2 2
0
0
2.15 × 10-06
4.99
MYH9
3
3
0
0
2.27 × 10-06
4.99
FAM71B
1
2
0
0
2.51 × 10-06
4.99
C10orf90 kopen van 2 2
0
0
3,76 × 10 -06
4,86 ​​
AKAP8 kopen van 2 2
0
0
4,59 × 10-06
4,81
ZC3H12B

2 2
0
0
5,87 × 10-06
4,74
SFTA3
1 1
0
0
6,86 × 10-06
4.70
SENP7 kopen van 2 2
0
0
7.65 × 10-06
4,68
TMPRSS6 het kopen van 2 2
0
0
8.38 × 10-06
4,67
PAGE2
1 1
0
0
9,94 × 10-06
4,62
Voor extra bestuurder gen lijsten, zie extra file 1:. Tabel S9
Tabel 2 CDH1 veranderingen in 18 maagkanker
Sample

Type
Wijziging
CDH1
regio
D-01 T Shirts CNV
Loss
Exons 1-16
D-02 T Shirts SNV
N256S
Exon 6
CNV
Loss
Exons 1-16
D-03 T Shirts SNV
Splice site
Donor plaats van Intron 4
D-04 T Shirts CNV
Loss
Exons 1-16
D-05 T Shirts SNV
D257N
Exon 6
INS
S829fs
Exon 16
D-09 T Shirts SNV
V252G
Exon 6
SV
Break punt
Intron 2
D -10 T Shirts CNV
Loss
Exons 1-16
D-11 T Shirts CNV
Loss
Exons 1-16
D12 T Shirts SNV
Q23 *
Exon 2
D-13 T Shirts CNV
Loss
Exons 1-16
SV
breekpunt
Introns 2 en 10
D-14 T Shirts SV
Break punt
Introns 2, 5 en 9
I-01 T Shirts CNV
Loss
Exons 1-16
I -02 T Shirts CNV
Loss
Exons 1-16
I-03 T Shirts SNV
D221G
Exon 5
SV
breekpunt
introns 10 en 13
I-04 T Shirts CNV
Loss
Exons 1-16
CNV, copy number variation; INS, kleine inbrengen; SNV, single nucleotide variatie; SV, structurele variatie. Ondernemingen De somatische varianten werden vervolgens in kaart gebracht op het Kyoto-Encyclopedie van genen en genomen (KEGG) banen database. Uit deze analyse bleek dat de gemuteerde genen van DGCs significant geassocieerd waren met de calcium signaleringsroute (P
= 7.00 x 10 -5, zie Extra file 1: Tafel S12 en tabel S13). Lage calciuminname kan bijdragen aan GC ontwikkeling [46]. Calcium is essentieel voor de functie van E-cadherine, en een verlies van E-cadherine-gemedieerde adhesie is betrokken bij de overgang van een goedaardige laesie invasieve metastatische kanker [47]. Verder werden de somatische mutaties sterk geassocieerd met paden die verband houden met kleincellige longkanker (P
= 1.00 x 10 -6 in DGC en P
= 4,24 × 10 -2 in IGC). In het bijzonder genen die betrokken zijn bij focale adhesie trajecten, zoals ITGA
, PIK3CA
en PTEN
, werden vaak gemuteerd.
SV en CNV analyse
SVs werden gedetecteerd op basis van discordantly kaart gebracht gelezen paren en eventuele SVs dat kiemlijn genoom van de patiënt aanwezig waren werden uitgesloten. Gemiddeld vonden we 552 somatische SVs per DGC monster paar (211 grote toevoegingen, 264 grote deleties, 27 inversies, 44 intrachromosomale translocaties, en 6 interchromosomal translocaties). We vonden 664 somatische SVs in elk IGC monster paar (285 grote toevoegingen, 283 grote deleties, 34 inversies, 38 intrachromosomale translocaties en 24 interchromosomal translocaties) (voor details voor elk monster, zie Extra file 1: Tafel S14 en Figuur S3). Daarnaast vonden we 2258 genen worden aangetast, en 1.736 van deze waren alleen te vinden in de DGC monsters (voor gegevens voor elk monster, zie Extra file 1: Tafel S15, en zie Aanvullende bestandsinformatie 3). Drie tumorsuppressorgenen FHIT
, WWOX
en MIPOL1
, die werden gerapporteerd in een eerdere GC studie [30], moest waardeverminderingen als gevolg van SVS (FHIT
in 11 monsters, WWOX
in 5 monsters en MIPOL1
van 3 monsters)
Fusion genen gegenereerd door chromosomale afwijkingen werden ook geanalyseerd en 19 fusiegen kandidaten geïdentificeerd (zie aanvullende bestand 1: Table S16), waaronder een nieuwe fusie gen, TSC2
-RNF216
, gevonden in een monster (Figuur 2a, b). TSC2
dat codeert voor het eiwit tuberine was eerder voorgesteld als een tumor suppressor gen dat betrokken is bij de zoogdieren doelwit van rapamycin (mTOR) route [48, 49]. Bovendien wordt RNF216
, codeert E3 ubiquitine-eiwit ligase, betrokken bij cytokine functie van het voorkomen van de aanhoudende activatie van de nucleaire factor (NF) -κB [50]. De Rap GTPase activerend eiwit (Rap-GAP) domein van de TSC2 eiwit, dat is gerelateerd aan de intrinsieke GTPase activiteit van de Ras-gerelateerde eiwitten RAP1A en Rab5 werd gebroken door deze translocatie (figuur 2c). Bovendien zijn de zinkvingerdomeinen van de RNF216 eiwit niet tot expressie gebracht in het fusiegen, omdat een frameshift, dat voortijdige beëindiging veroorzaakt. Met behulp van reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR), gevolgd door sequentieanalyse, de expressie van het fusiegen in weefsel van de patiënt bevestigd. Na het testen van een extra set van 15 GC patiënt weefsels, identificeerden we 2 patiënten expressie brengen van het fusie-gen (Figuur 2d, e). Deze translocatie leidt tot veranderde cellulaire gedrag van zowel het verstoren van de normale werking van het gen en het veroorzaken van expressie van het fusiegen product, dat kan concurreren met het normale gen. Het fusiegen kan competitief interfereren met tumor suppressor paden en activeert NF-KB gemedieerde cytokine signalering. Figuur 2 TSC2 - RNF216 fusiegen breuk. (A) Exon structuur van de TSC2
-RNF216
fusiegen. De getallen in de dozen de exon nummers van elk gen. Rode lijnen geven de fusiepunten. (B) eiwit domeinstructuur van de TSC2-RNF216 fusieproteïne. De Rap-GAP domein van TSC2 was gebroken, en RNF216 had een leesraamverschuiving veroorzaakt voortijdige beëindiging door de interchromosomal omlegging. (C) Structuur van de TSC2 Rap-GAP domein. Het rode gebied is de resterende Rap-GAP domein gebied, en het grijze gebied is de Rap-GAP domein dat wordt geschrapt in het TSC2
-RNF216
fusiegen. (D) RNA-sequentie van de TSC2
-RNF216
fusiegen. Positie 136 wordt getoond als N. Ofwel een A of G base produceert een terminatiecodon (TAA of TAG). (E) Verificatie van de TSC2
-RNF216
fusie transcript in RNA (cDNA) door middel van PCR-amplificatie en elektroforese.
In DGCs, chromosomen 16, 17, 19, 20, 21, en 22 bevatte een verhoogde hoeveelheid blok deleties, terwijl chromosomen 3, 7, 8, en 13 vertoonden aanzienlijk gestegen verdubbelingen (figuur 1). Veel tumor suppressor genen, zoals CDH1
, PLA2G2A, RUNX3
, SMAD2
en TP53
, bevinden zich in uitvoerig verwijderd chromosomale regio's. Met name somatische mutatie (nsSNV of splitsingsplaats mutatie) en het aantal kopieën verlies van CDH1
waren over het algemeen elkaar uit: vier van de vijf DGC monsters met een somatische mutatie had geen gen aantal kopieën verliezen, en acht van de negen DGC monsters met een CDH1
genkopienummer verlies leverde geen somatische mutaties in CDH1
hebben. Slechts één monster (1/18, 5,6%) had zowel veranderingen (mutatie en kopienummer verlies) gelijktijdig, en deze waarneming komt overeen met eerdere studies melden dat daarmee gepaard gaande veranderingen in CDH1 Wat zijn zeldzaam [19, 40, 51, 52] . Toen we overwogen SVs in CDH1
samen, vonden we dat de andere drie monsters had een mutatie /copy number verlies gelijktijdig met SV. Daarnaast is de kopie-aantallen van het oncogen MYC
in vijf DGC monsters werden verhoogd (zie Extra file 4), en kopieer het aantal BMO
in drie DGC monsters [53] werden verhoogd. De oncogenen MOS Kopen en ZHX2
toonde ook een copy number winst in vijf en vier DGC monsters, respectievelijk. Meer dan de helft van de monsters (10 van de 18) vertoonden een verlaging van kopieaantal ARID1A
, wat ook bijdraagt ​​gen voor ovariële clear cell carcinoma, en een chromatine remodeler GC [22, 54, 55]. Het is bekend dat de meeste GC met ARID1A
mutaties vertonen lagere eiwitexpressie in vergelijking met GC zonder ARID1A
mutatie [22]. Als de dosis-effect belangrijk is in deze kanker weefsels, aantal kopieën vermindering van ARID1A
zou een mogelijke kanker-geassocieerde factor
Een groot gebied van chromosoom 12 werd versterkt in drie DGC genomen.; van de drie genomen monsters D-01 en D-T 02 T vertoonden opvallend grote versterking (figuur 3a). Overlapping patronen waren enigszins verschillend: D-01 T had een tandem duplicatie van 3 Mbp, terwijl D-02 T een omgekeerde herhaling van 1 Mbp hadden (Figuur 3b, c). Een deel van deze gedupliceerde regio codeert voor het muizen dubbele minuut (MDM2
) gen. Er werd gemeld dat in een kleine dataset, de
MDM2-gen werd geamplificeerd vaak [56], en dat dit gen is geassocieerd met verschillende kankers [57]. MDM2
overexpressie veroorzaakt door genamplificatie werd experimenteel bevestigd met behulp van kwantitatieve RT-PCR met de tumor en aangrenzend normaal weefsel gepaarde voor NGS analyses en normale cellijnen werden als vergelijking (figuur 3d). MDM2
overexpressie positief gecorreleerd met het aantal kopieën analysegegevens. Hoewel eerder gerapporteerde array CGH data [32] had een relatief lage resolutie voor CNV detectie, gebruikten we deze gegevens te zoeken naar een bias in veranderingen van gen aantal kopieën in elke histopathologische type. Een copy number winst van genen die coderen voor eiwitten calciumantagonisten (CACNG6
, CACNG7
en CACNG8
, P
= 4,24 × 10 -2) significant vaker voor bij DGC monsters was (zie extra file 1: tabel S17). Alle geïntegreerde wijziging informatie wordt getoond in Extra bestanden (zie Extra file 1: Tafel S18 en S19 Table, zie Extra file 5). Figuur 3 de verdubbeling gebied van de MDM2-gen op chromosoom 12 in monsters D-01 T en D-02 T. (a) Mapping diepte grafieken van de twee chromosomen. (B) dunne zwarte spikes werden bij het in kaart brengen diepte van 2000-base breedte. De y-as toont
relatieve diepte. Elke unit vertegenwoordigt ongeveer 30 keer sequencing diepte. (C) Gene posities en namen rond het geamplificeerde gebieden. De zwarte banden tonen gen locaties. (D) MDM2
transcript niveaus in tumor en aangrenzend normaal weefsel gepaarde monsters en normale cellijnen. Kwantitatieve RT-PCR werd gebruikt om MDM2
mRNA niveaus in monsters D-01 en D-02 (bevattende geamplificeerde MDM2
gebieden), D-04, D-05, D-10 te meten, I-03, en I-04 (zonder versterkte MDM2
regio's), en drie normale cellijnen (HDF, HMEC en Hs 738.St/Int). Error bars werden berekend uit twee gescheiden experimenten van drievoudige reacties.
3D structurele analyse van het gemuteerde CDH1 Belgique Om te begrijpen hoe de gedetecteerde mutaties invloed eiwitstructuur /functie en activatie van downstream biologische pathways beïnvloeden van carcinogenese, we geanalyseerd driedimensionale ( 3D) structuren van de mutant E-cadherine eiwit gevonden in een IGC en vijf DGC monsters (zie Extra file 2). De CDH1
gen codeert voor een calcium-afhankelijke celadhesie glycoproteïne en heeft vijf extracellulaire domeinen cadherin (EC1-EC5) (Figuur 4a). Het is bekend dat de wisselwerking tussen cadherin en calcium vereist voor dimerisatie, structurele stijfheid en bescherming tegen proteolytische degradatie [58]. Mutaties in de EC1-2 en EC2-3 verbindingen is bekend dat onjuiste cadherine lokalisatie en verminderde celhechting [59] veroorzaken. Structurele analyse werd uitgevoerd op vier nsSNVs (D221G, V252G, N256S en D257N) uitgevoerd, met uitzondering van een onzin SNV (Q23 *), een frameshift inbrengen (S829fs), en een splitsingsplaats (chr16: 68.842.472) mutatie. Alle vier nsSNVs bevonden zich in de kruising tussen EC1 en EC2 (EC1-2 knooppunt) (figuur 4b, c), en drie nsSNVs (D221G, N256S, en D257N) waren in het eiwit regio die direct met een calciumion (fig 4d, e). Deze situatie kan leiden tot afwijkende interacties tussen de cadherine domeinen. Het is gemeld dat A298t, D231K en D231A mutatie, die een soortgelijke structurele positie in de EC1-2 afslag naar de somatische mutaties in deze studie toonde een verlies van celadhesie functie [60, 61]. NsSNV andere mutatie, V252G ligt in het β-sheet structuur van cadherine en de zijketen is gericht naar binnen. Omdat β-barrel structuren bevatten in het algemeen afwisselende polaire en hydrofobe aminozuren, met de hydrofobe resten georiënteerd naar het inwendige van het vat een hydrofobe kern vormen, en de polaire residuen georiënteerd naar de buitenkant van het vat op het oplosmiddel blootgestelde oppervlak, het vorming van de hydrofobe kern kan worden belemmerd door de V252G mutatie (figuur 4e). Een eerdere studie gemeld exome twee CDH1
mutaties, P127fs (frameshift mutatie in een DGC) en V694I (in een MSI IGC) [22]. Dimerisatie van twee cadherin moleculen in hetzij een cis- of trans

configuratie trad op de kruising tussen EC1-2 en EC1-2 [62], terwijl mutaties op de EC3-4 en EC4-5 verbindingen geen significante invloed celhechting [59]. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Mechanismen van gastroprotection methanol extract van Melastoma malabathricum leaves
• Hogere frequentie van cagA Epiya-C fosforylatieplaatsen in H. pylori stammen uit de eerste graad familieleden van patiënten met maagkanker