PLoS ONE: Подавление RPL6 по миРНК подавляет пролиферацию и клеточного цикла Прогрессирование человеческого рака желудка клеточных линий

Абстрактный
<р> Наше предыдущее исследование показало, что человеческий рибосомных белков L6 (RPL6) был повышающей регуляции в клетках рака желудка с множественной лекарственной устойчивостью и избыточная экспрессия RPL6 может защитить рак желудка от апоптоза вызванного препаратом. Кроме того, было показано, что до регуляции RPL6 ускоренный рост и расширение в пробирке колониеобразующих способность клеток GES в то время как вниз регулирование RPL6 выставлены противоположные результаты. Настоящее исследование было разработано для изучения потенциальной роли RPL6 в терапии рака желудка для клиники. Выражение RPL6 и циклин Е в желудочном раковых тканей и нормальной слизистой оболочки желудка оценивали с помощью immunohistochemisty. Было установлено, что были выражены RPL6 и циклин Е на более высоком уровне в желудочном раковых тканей, чем в нормальной слизистой оболочке желудка и два были соотносительной в рак желудка. Выживание время послеоперационных пациентов анализировали с помощью анализа Каплана-Мейера, и было установлено, что у пациентов с положительным выражением RPL6 показали более короткое время выживания, чем у пациентов, которые с RPL6 отрицательным выражением. RPL6 тогда генетически понижающей регуляции в желудочном SGC7901 рака и клеточных линий AGS по миРНК. Было показано, что снижение экспрессии RPL6 снижается способность колонии клеток рака желудка в пробирке, образующую и снижение роста клеток в живом организме. Кроме того, вниз-регулирование RPL6 может подавлять G1-S фазового перехода в этих клетках. Кроме того, мы о чем свидетельствует, что RPL6 миРНК понижающей регуляции экспрессии циклин E в SGC7901 и AGS клеток. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что RPL6 был чрезмерно выраженное в желудочных тканях человека и вызвал неблагоприятный прогноз. Понижающую регуляцию RPL6 могут подавлять рост клеток и прогрессию клеточного цикла, по меньшей мере через вниз для регулирования циклин Е и который может быть использован в качестве нового подхода к терапии рака желудка
<р> Цитирование:. Ву Q, Y Гоу, Ван Q, Джин H, L Цуй, Чжан Y, и др. (2011) Подавление RPL6 по миРНК подавляет пролиферацию и клеточного цикла Прогрессирование человеческого рака желудка клеточных линий. PLoS ONE 6 (10): e26401. DOI: 10.1371 /journal.pone.0026401
<р> Редактор: Синь-юань Гуан, Университет Гонконга, Китай
<р> Поступило: 7 августа 2011 года; Принято: 26 сентября 2011 года; Опубликовано: 17 октября 2011
<р> Copyright: © 2011 Wu и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование была частично поддержана грантами от Национальной программы фундаментальных исследований Китая (№ 2010CB732400, No. 2010CB529300) и Национального фонда естественных наук Китая (№ 30801349). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка, с высокой нравственности, был одним из самых злокачественных видов рака в азиатских странах. Его появление было процессом с многоканальным факторов и мультимиллионеров шагов, вовлеченных в изменения во многих молекул, включая активацию протоонкогенов, инактивации генов-супрессоров опухолей, изменения в клеточного цикла связанных белков и так далее. В последнее десятилетие большое количество прото-онкогенов и генов-супрессоров опухолей были найдены. Несмотря на значительного числа генов, которые уже описаны, новые гены с онкогенными потенциальными или подавления роста опухолей деятельности по-прежнему идентифицированы. Однако, молекулярный механизм канцерогенеза желудка, остается неясным.
<Р> рибосома имеет важное значение для синтеза белка во всех клетках, который состоит из рибосомных РНК (рРНК) и рибосомных белков (RPS). Многие RPs также играют различные роли, которые не зависят от биосинтеза белка, который называется экстра-рибосомной функции [1]. Увеличение больше исследований показали, что нарушение трансляции белка участвовал в онкогенеза и многих рибосомных белков были дисфункциональными в опухолях, но механизмы еще не были известны [2]. Было высказано предположение, что многие RPs действуют как haploinsufficient супрессоров опухолей в генах рыб и многие RPS также могут быть онкогенов в человеческом роде [3]. Самое раннее сообщение об отношениях между РП и опухолей была опубликована в 90-х годах 20 ^{го века, который показал ассоциацию RPS19 с прогрессированием рака толстой кишки и дифференцировки [4] .Thereafter, все больше и больше RPs были найдены дисфункциональной в опухолях , такие как высокая экспрессия RPL19 в опухолях молочной железы [5], избыточная экспрессия RPL7a и RPL37 в образцах ткани простаты рака [6], более высокую экспрессию RPL15 при раке пищевода [7], RPs, как раннее обнаружение маркера человеческого плоскоклеточный клеточный рак шейки матки [8], а избыточная экспрессия RPL36a связанного с клеточной пролиферации в гепатоцеллюлярной карциномы [9] и так далее. Отчеты относительно ассоциации с РП канцерогенеза были все еще увеличивается [2], [10]. Однако точные роли в развитии РП опухоли разнообразны и по-прежнему нуждаются в дальнейшем уточнении.
<Р> Ранее мы проанализировали мРНК профилей желудка человека линии клеток рака SGC7901 и его множественной лекарственной устойчивостью вариант SGC7901 /VCR с помощью дифференциала отображается ПЦР и подавление субтрактивная гибридизация [11], [12]. RPL6 был идентифицирован как один из сверхвыражен генов в SGC7901 /АДР по сравнению с SGC7901, которое было дополнительно подтверждено с помощью ОТ-ПЦР и Нозерн-блот-анализа [13]. Последующие исследования показали, что повышающей регуляции RPL6 защищены клеток рака желудка от адриамицин-индуцированного апоптоза и усиливает сопротивление клеток рака желудка к нескольким химиотерапевтическим лекарственным средствам, в том числе винкристин, адриамицин, etopside, цисплатин и 5-fludrouracil [13]. Эти данные свидетельствуют о том, что RPL6 может способствовать злокачественных фенотипов клеток рака желудка, что привело нас к проведению дальнейших исследований с целью дальнейшего изучения точную роль RPL6 в канцерогенеза и развития рака желудка. Затем мы обнаружили, что генетически повышающей регуляции RPL6 в клетках GES может ускорить рост и повысить экстракорпорального колониеобразующих способность клеток GES в то время как вниз регулирование RPL6 может проявлять противоположные результаты. Кроме того, до регуляции RPL6 может способствовать G1 к S фазового перехода клеток GES. Дальнейшее исследование показало, что RPL6 повышающей регуляции экспрессии циклина Е в клетках GES [14]. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что RPL6 может способствовать злокачественные фенотипы клеток рака желудка и RPL6 может играть онкогенного роль в онкогенеза и развитие рака желудка, что привело нас провести настоящее исследование, чтобы изучить вопрос о потенциальной роли RPL6 в гене терапия рака желудка и может быть использован в качестве нового подхода к терапии рака желудка.}

Результаты
выражение

RPL6 и циклин Е в желудочном образцов рака человека и совпадающая смежных неопухолевых тканей

Для того, чтобы исследовать отношения между RPL6 и выражением циклин Е с развитием рака желудка, мы обнаружили экспрессию RPL6 и циклин E в желудочном раковых тканей человека и подобранных смежных неопухолевых тканей путем иммуногистохимического окрашивания. Результаты показали, что RPL6 и циклин локализован почти в цитоплазме и лишь изредка в ядрах клеток рака желудка (рис. 1А). Дальнейший анализ обнаружил, что положительное отношение (в том числе образцов, окрашенных) из RPL6 составила 84% (46 из 55 пациентов) в то время как положительное отношение циклин Е составила 75% (41 из 55 больных) в желудочном образцов рака человека. Положительное отношение как RPL6 и циклин Е составила 70% (38 из 55 пациентов) в то время как отрицательное отношение (в том числе образцов, которые не окрашивали) обоих RPL6 и циклин Е составила 11% (6 из 55 пациентов) в желудочном образцов рака человека , Положительное отношение обоих RPL6 и циклин Е было 18% (8 из 55 пациентов) в совпавших смежных неопухолевых тканей (данные не показаны). Что касается различий между выражением RPL6 и экспрессии циклин в желудочном образцов рака человека, не было никакой разницы. Настоящее исследование показало, что RPL6 и циклин E выражения в желудочных образцов рака человека, являются относительными (рис 1В, р &л;. 0,05), что может играть мошенника-щедр роль в развитии рака желудка и RPL6 и циклин Е может служить биомаркером для диагностики рака желудка и гена-мишени для терапии рака желудка. В конце наблюдения, выживаемости пациентов были проанализированы с помощью метода Каплана-Мейера, и результаты показали, что в течение пациентов, наблюдавшихся, у пациентов с обоих RPL6 положительной и циклин Е положительной показал более короткое время выживания и худший прогноз, чем те, с обоими RPL6 отрицательными и циклин Е отрицательное выражение, или те, с RPL6 положительными и циклин Е отрицательный или с RPL6 отрицательным и циклин положительного выражения соответственно (рис 2 а, р &ЛТ;. 0,01), которое может быть установлено, что у пациентов с обоих RPL6 положительными и циклин Е положительно показал неблагоприятный прогноз. Показано также, что у пациентов с RPL6 отрицательным выражением показали более длительное время выживания, чем RPL6 положительных (рис 2В, р <. 0,01), а у пациентов с циклин положительным выражением E показали плохой прогноз (фиг.2С, р &л;. 0,01). Таким образом, можно сделать вывод, что RPL6 может служил в качестве биомаркеров для оценки прогноза у больных раком желудка.

Выражение RPL6 в желудочном линиях раковых клеток и его дериваты
<р> Для дальнейшего изучения потенциальная роль RPL6 в генной терапии рака желудка, SGC7901 и AGS клетки трансфицировали RPL6 конкретных миРНК и был получен смешанный пул вариантов устойчивых к G418 клеток. В устойчивых к G418 варианты укрывательство RPL6 конкретных миРНК были соответственно названы SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 и SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. В G418-резистентные клетки, несущие скремблирования миРНК плазмид были разработаны в качестве SGC7901-siControl и АГС-siControl соответственно. Как показано на фигуре 3А, экспрессия RPL6 значительно подавлялась в SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 и SGC7901-siRPL6-2, клетки AGS-siRPL6-2 по сравнению с родительскими клетками и контрольными клетками. В настоящем исследовании, SGC7901-siRPL6-2 и АГС-siRPL6-2 показали более эффективные ингибирующие результаты, что свидетельствует о том, что клетки SGC7901-siRPL6-2 и АГС-siRPL6-2 может быть использован в качестве хорошей модели клеток для выяснения потенциала роль RPL6 в генной терапии рака желудка для клиники.

подавление RPL6 подавляют желудочную рост раковых клеток в пробирке
<р> для того, чтобы изучить вопрос о том понижающая регуляция экспрессии RPL6 может ингибировать рост SGC7901 и AGS клетки, родительские клетки, контрольные клетки и их варианты были посеяны в культуральные планшеты и их рост контролировали ежедневно с МТТ. Как видно из кривых роста на фигуре 3В, контроль (SGC7901-siControl и АГС-siControl) клетки показали аналогичные темпы роста до родителей (SGC7901 и AGS) клеток, соответственно, в то время как SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 и SGC7901 -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 клетки выставлены более низкие темпы роста по сравнению с контрольными клетками, и SGC7901-siRPL6-2, АГС-siRPL6-2 клетки показали самые низкие темпы роста (рис 3B, р &Лт;. 0,05). Рост анкеровка независимый от этих клеток дополнительно анализировали с мягком агаре Анализ образования колоний. Было выявлено, что SGC7901-siRPL6-1, АГС-siRPL6-1 и SGC7901-siRPL6-2, клетки AGS-siRPL6-2 получают гораздо меньше колоний клеток в мягком агаре, чем их родительских клеток и контрольных клеток (рис 3C, р &л.; 0,05), клетки, названные с SGC7901-siRPL6-2 и АГС-siRPL6-2 производства наименее колоний. Эти данные свидетельствуют о том, что вниз регулирование RPL6 может подавлять желудочную рост раковых клеток и подавляют образование колоний способность SGC7901 и AGS клеток.

RPL6 миРНК тормозится канцерогенез желудка раковых клеток в естественных условиях
<р> Для далее подтверждают эффекты RPL6 на онкогенеза рака желудка, анализ образования опухолей проводили в голых мышах. SGC7901, АГС и SGC7901-siRPL-2, АГС-siRPL6-2 клетки подкожно инокулировали в правую или левую верхнюю часть спины бестимусных голых мышей на одном месте. (. Фиг.4А и С) Через четыре недели мыши были убиты, и пересаженные опухоли вырезали и размеры опухолей были оценены (фиг.4В и D, P &Лт;. 0,05). Был значительное уменьшение размеров ксенографтов в RPL6 понижающей регуляции клеток. Эти данные указывают на то, что нокдауна из RPL6 может подавлять клетку рака желудка туморогенез в естественных условиях и RPL6 может играть ключевую роль в развитии злокачественного роста клеток рака желудка в естественных условиях.

RPL6 тормозится фазовый переход G1-S из SGC7901 клетки
<р>, чтобы раскрыть механизмы, лежащие в основе подавляющую роль RPL6 в желудочном роста раковых клеток, были проанализированы последствия RPL6 по распределению клеточного цикла SGC7901 клеток (рис. 5А). Как показано на фигуре 5В, SGC7901-siRPL6-1 клетки показали, слегка повышенный процент G1 фазы и снижение доли фазы S, в то время как SGC7901-siRPL6-2 клетки имеют значительно увеличился процент G1 фазы и снижение доли фазы S (P ≪ 0,05 ) по сравнению с родительскими клетками и контрольными клетками. Они показали, что RPL6 конкретных миРНК может замедлить G1-S переход SGC7901 клеток.

RPL6 понижающей регуляции экспрессии циклина Е в клетках рака желудка на уровне белка
<р> Хорошо известно что прогрессирование G1-S контролируется циклин D /CDK4 и циклин Е /CDK2 комплексов, которые регулируются членами семьи INK4, р21 и р27 соответственно. Выражение этих регуляторов в SGC7901 и AGS клеток и его вариантов определяли вестерн-блот анализа. Как показано на рисунке 6, экспрессия циклин Е значительно подавлялась в SGC7901-siRPL6-2 и клетки AGS-siRPL6-2. Выражения CDK2, р16, р21 и р27 были неизменными в вариантах SGC7901 и AGS клеток. Эти данные свидетельствуют о том, что понижающую регуляцию RPL6 снижал экспрессию циклина Е в SGC7901 и AGS клеток, которые могли бы очертить потенциальную роль RPL6 и циклин Е в развитии рака желудка и RPL6 может использоваться в качестве гена-мишени рака желудка в клиника.

Обсуждение
<р> настоящее исследование показало, что RPL6 и циклин E были чрезмерно выражены в опухолевых тканях желудка и существует положительная корреляция между ними в желудочном раковых тканей. Последующие результаты показали, что у пациентов с RPL6 отрицательным выражением показали более длительное время выживания, чем те, с положительным выражением RPL6, который предположил, что RPL6 положительных пациентов показали плохой прогноз. Дальнейшие исследования показали, что понижающую регуляцию RPL6 по RPL6-специфической миРНК ингибирует рост пролиферации и креплении независимый желудочного линий раковых клеток в пробирке, репрессирован прогрессию клеточного цикла и подавлял экспрессию E циклин Кроме того, нокдаун RPL6 по RPL6 конкретных миРНК подавлено опухоли формирование способности клеток рака желудка в естественных условиях.
<р> В нашем предыдущем исследовании, дифференциально выраженные гены, связанные с множественной лекарственной устойчивостью желудка раковых клеток выделяли с использованием дифференциальной дисплей RT-PCR и отнимающий гибридизацию [11], [ ,,,0],12]. RPL6, компонент большой субъединицы рибосомы, был, таким образом, выдел ют в виде клона сверхвыражен в множественной лекарственной устойчивостью клеток рака желудка [11]. Было показано, что RPL6 может защитить клеток рака желудка от химиотерапевтическое лекарственное средство-индуцированного апоптоза [13]. Эти данные свидетельствуют о том, что RPL6 может включать в регуляции злокачественного фенотипа рака желудка. Дальнейшее исследование было разработано для изучения роли RPL6 в онкогенеза и развитие рака желудка, а также результаты свидетельствуют о том, что до регуляции RPL6 ускоренного роста и в пробирке колонии способность клеток GES тогда вниз регулирование RPL6 выставлялась противоположные результаты формирования. Кроме того, до регуляции RPL6 ускоряются G1 к S фазового перехода клеток GES по меньшей мере, через регуляцию экспрессии циклина Е в то время как понижающей регуляции RPL6 показали противоположные результаты [14]. Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что RPL6 может играть роль онкогенных в онкогенеза и развитие рака желудка и может служить в качестве нового подхода к генной терапии рака желудка.
<Р> В настоящее время все большее количество пациентов умер от рака из-за злокачественные фенотипа них. терапия рака беспокоили людей во всем мире. Кроме химиотерапии и хирургического лечения, генная терапия является новым и перспективным для лечения рака. Одним из наиболее часто используемых методов генной терапии является РНК-интерференция (RNAi). RNAi, весьма консервативны механизм генной глушителей играет важную роль в регуляции экспрессии генов. Молчанием генов с помощью пост-транскрипционного механизма с гомологичной двухцепочечную РНК была впервые обнаружена в искусственных системах, где был введен двойной нити РНК (дцРНК) путем инъекции или путем экспрессии трансгенных конструкций. Это явление имеет место при малых интерферирующих РНК (киРНК) в цитоплазме клеток млекопитающих. В технологии миРНК два механизма доставки были рассмотрены, прямые поставки синтетических миРНК нуклеотида и введение плазмидной ДНК (пДНК), кодирующей короткий шпилька конструкцию (shRNA), которая была бы ферментативной деструкции в миРНК [15]. МиРНК сыграли свои роли ингибирующих путем сопоставления с последовательностями мРНК и ингибирует последующую экспрессию мРНК и трансляции, а также работал в качестве отрицательного регулирования. В настоящее время, все больше и больше ученые обнаружили, что в нокдауне экспрессии генов миРНК может значительно подавлять рост опухоли и метастазирование. ингибитор Х-хромосомой апоптоза белка (XIAP), что является важным членом ингибиторов апоптоза семейства белков (IAP), участвует в контроле клеточного деления, пролиферации клеток и ингибирования апоптоза [16], [17]. Понижающей регуляции XIAP по миРНК может значительно подавлять пролиферацию опухолевых клеток и повышать чувствительность опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам [18], [19]. Остеопонтина (OPN) белок, который был сверхвыражен в большинстве больных раком желудка и связанных с его патогенеза, играет важную роль в пролиферации, инвазии, метастазирования и выживаемости рака желудка [20]. Затем понижающую регуляцию OPN по OPN-специфической миРНК значительно ингибирует рост, миграцию и инвазию клеток рака желудка [21]. CML66, новым опухолевый антиген, который играет онкогенного роль, была чрезмерно выражена в большинстве клеточных линий рака и рака [22], сбивание свое выражение с помощью CMl66 специфических миРНК значительно ингибирует пролиферацию, инвазию и метастазирование клеток HeLa как в естественных условиях и в пробирке эксперименты [23]. FABP5, который кодирует кожную жирных кислот связывающего белка (С-FABP), является повышающей регуляции при раке простаты и действует как мнимого онкоген. Понижающую регуляцию FABP5 по FABP5 специфических миРНК эффективно ингибирует рост клеток рака предстательной железы у голых мышей [24]. Кроме того, когда рибосомных белков RPS13, который усиливается клетку рака желудка линии роста SGC7901 был сбит RPS13 специфических миРНК, является, рост клеток значительно ингибирует SGC7901 и колонии способность формирующей в пробирке и подавлена ​​способность образования опухоли в голых мышей [25]. Предыдущие исследования также обнаружили, что системная доставка миРНК через ателоколлагена, которая специально ориентирована опухолей, является безопасным и возможным для лечения рака при раке предстательной железы [26]. Таким образом, выше данные предположили, что миРНК, путем ингибирования экспрессии генов может быть новый подход к терапии рака и сделать генной терапии рака возможно для клинического лечения.
<Р> В настоящем исследовании, выражения RPL6 и циклин Е в желудочном раковые ткани и совпадающая смежных неопухолевых ткани были обнаружены и результаты показали, что RPL6 и циклин Е показали более высокую экспрессию в раковых тканях желудка, чем в соседних совпавших неопухолевых тканей. Кроме того, существует корреляция между экспрессией RPL6 и циклин Е в желудочных тканях рака, который предположил, что они могут играть CON-щедр роль в развитии рака желудка и RPL6 могли бы служить в качестве биомаркера для диагностики рака желудка. Последующие результаты показали, что у пациентов с обоих RPL6 положительными и циклин Е положительных выражений показал более короткое время выживания и худший прогноз, чем соответствующий контроль, а также показали, что у пациентов с RPL6 отрицательным выражением показали более длительное время выживания и лучший прогноз, чем у пациентов с положительным выражением RPL6, который предположил, что RPL6 может служил в качестве биомаркера для желудка прогноза рака и гена-мишени для терапии рака желудка в клинике.
<р> Для дальнейшего изучения потенциальной возможности RPL6 в качестве мишени для генной терапии рака желудка в клинике, мы постучали вниз выражение RPL6 в SGC7901 и AGS клеток путем RPL6 специфических миРНК, результаты показали, что понижающей регуляции RPL6 в рака желудка клеточных линий родительских (SGC7901 и AGS) роста клеток эффективно заторможенной и экстракорпоральное колонии способность формирования. Кроме того, анализ клеточного цикла показал, что вниз регулирование RPL6 тормозится G1 к S фазе клеток рака желудка. Вестерн-блот-анализ показал, что RPL6 тормозится прогрессирование клеточного цикла через понижающую регуляцию экспериментов формирования циклин Е. опухоли в голых мышах предположил, что вниз регуляция RPL6 может подавлять образование опухолей в естественных условиях.
<Р> циклин Е, ключевой ячейки цикл белок, который играл ключевую роль в G1-S переходе был в беспорядке во многих различных опухолей [27], [28], [29], [30], [31]. Предыдущие исследования показали, что циклин E была важной молекулой в онкогенеза. В настоящем исследовании, мы обнаружили, что экспрессия циклин Е, вместе с RPL6 была выше в желудочных раковых тканей человека, чем в соседних совпавших неопухолевых тканей, которые предложили роль циклин Е играет в развитии рака желудка. Дальнейшие исследования показали, что RPL6 влияет на рост клеток путем регуляции циклин Е, который показал, что высокая экспрессия циклин Е ускоренный рост клеток в то время как низкая экспрессия циклина Е тормозится пролиферацию клеток. Циклин Е и RPL6 могут играть CON-щедр роль в развитии рака желудка
<р> В заключение., Данное исследование показало, что экспрессия RPL6 и циклин были связаны друг с другом в желудочном раковых тканей, и они могли бы играть со- великодушные роль в развитии рака желудка, который предположил, что RPL6 может использоваться в качестве диагностического средства при раке желудка. Анализ данных Последующие показали, что у пациентов с RPL6 отрицательным выражением показали более длительное время выживания и лучший прогноз, чем у больных с RPL6 положительным выражением после операции, который предположил, что RPL6 служил в качестве биомаркера для желудка прогноза рака и новый ген-мишень для терапии рака желудка. Дальнейшие исследования показали, что вниз регуляции экспрессии RPL6 по RPL6 специфических миРНК ингибирует рост клеток SGC7901 и экстракорпоральное способности формирования колонии, тормозится SGC7901 клеток G1-S фазового перехода, и подавлено образование опухолей в естественных условиях. В заключение, наше нынешнее исследование подтвердило, что RPL6 миРНК может быть использовано в качестве нового подхода к лечению рака желудка в клинике.

Материалы и методы

Этика Заявление
<р> Для образцов тканей все пациенты были информированное согласие на использование избыточных патологических образцов для исследовательских целей. Протоколы, используемые в данном исследовании, были утверждены защиты больницы прав субъектов Комитета. Использование человеческих тканей было одобрено этическими комитетами Четвертого военного медицинского университета и соответствовал Хельсинкской декларации, и местному законодательству. Пациенты предлагают образцы для исследования подписали формы информированного согласия. Для исследований на животных, все процедуры для экспериментов на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами институционального ухода за животными и использование комитета в экспериментах на животных центре четвертого военного медицинского университета. Одобрение ID для использования животных был № 10218 экспериментом животных Центра четвертого военного медицинского университета.

Тканевые образцы и клеточные линии
<р> образцы ткани с парафином внедренные были собраны из 55 больных рак желудка, который подвергся гастрэктомии в нашей больнице в период между 2004 и 2009 годами все случаи рака желудка и прилегающих к нему тканей неопухолевыми были диагностированы клинически и патологически. Данные по клинико-патологическими особенностями и прогнозам пациентов были собраны и проанализированы ретроспективно. В общей сложности 55 пациентов находились под наблюдением вплоть до конца 2009 года, и два из них были потеряны в течение последующего периода. Человеческой аденокарциномы желудка клеточная линия SGC7901 была получена из Академии военно-медицинских наук, AGS был получен из Shanghai Cell Bank (Шанхай, Китай). Две клеточные линии были сохранены в нашем институте. Все клеточные линии поддерживали в RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (FCS) при 37 ° C с 5% CO <суб> 2 в увлажненном инкубаторе (Forma Scientific, Мариетта, ОН).

иммуногистохимии и иммуногистохимическое скоринг
<р> депарафинировали и регидрировали срезы промывали в пресной воде в течение 10 минут. Тепло-индуцированный поиска антигена проводили в течение 20 минут при 95 ° С в 10 мМ цитратном буфере натрия (рН 6,0). После того, как предметные стекла охлаждают при комнатной температуре в течение 40 минут, они были блокированы в 3% перекиси водорода в течение 20 минут, а затем в нормальной козьей сыворотки, удерживающего жидкость в течение 40 минут. После этого им давали возможность реагировать в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами к IgG, RPL6 и циклин (Santa Cruz). После согревания в течение 40 минут, они были затем подвергают взаимодействию с антителами (вторыми Чжуншань Goldenbridge биотехнологии Co.Ltd) в течение еще 40 минут при комнатной температуре. Затем продукты были разработаны с 3,3'-диаминобензидина и контрастно гематоксилином. Подсчет очков был завершен специалистом патологоанатомом и ученым, которые были ослеплены клинической и патологической информации. В случае несоответствия, консенсус был достигнут конференц-связи. Пропорции положительных клеток (от 0 до +3) и интенсивности окрашивания (от 0 до +3) оценивали отдельно при увеличении х200. Прежний рассчитывалась путем подсчета количества окрашивающего опухолевых клеток среди общего количества опухолевых клеток, например, при 25% от общего количества клеток окрашивали, оценка доля составляла + 1, и 50% равен +2, 75% равно до +3, 0% равен 0. скоринг интенсивность оценивали по цвету окрашенного ядра опухолевых клеток, в частности, оценка 0 означает ахроматический, +1 означает, амбры, +2 означает желтый, и +3 означает коричневый. Комбинированный скоринг + 1~ + 2 были определены "негативный", а + 3~ + 6 были рассмотрены "позитивный".

Конструкция плазмид и трансфекция
<р> Две пары шпилька малых интерферирующих РНК (миРНК ) олигонуклеотиды для RPL6 были разработаны в соответствии с проектными миРНК рекомендациями TaKaRa биотехнологии Co., Ltd. Сравнение последовательностей-мишеней к базе данных генома человека в поисках BLAST, чтобы исключить из рассмотрения любой последовательности-мишени с 21 пар оснований гомологии, прилегающего к другим кодирующих последовательностей, , Для получения олиго-1, смысл: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', антисмысловой: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; для олиго-2, смысл: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', антисмысловой: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Дуплексный скремблирования ДНК также была разработана в качестве контроля, для олиго-1, смысл: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', антисмысловой: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Для отжига с образованием ДНК-дуплексов, 0,01 М каждое из смысловых и антисмысловых олигонуклеотидов были использованы. Дуплексы были разведены, а затем сшили с pSilencer3.1-H1 нео вектор (Co TaKaRa биотехнологии (Далянь)., Ltd). Продукты были преобразованы в DH5 &-компетентные клетки. Устойчивые к ампициллину колонии были выбраны, которые были определены рестрикционным расщеплением, и дополнительно подтверждено путем секвенирования ДНК. В соответствии с инструкциями производителя, миРНК плазмид RPL6 трансфицировали в клетки с использованием SGC7901 Липофектамин 2000 реагента (Invitrogen, Carlsbad, CA), соответственно. Через двадцать четыре часа после трансфекции, G418 (400 мкг /мл) добавляли в питательную среду для создания стабильных клонов. Смешанные клоны размножали в течение еще 2-х месяцев. Клетки SGC7901 и AGS (также называемые родительские клетки), стабильно экспрессирующих экзогенной RPL6 были названы SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 и SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. А клетки, трансфицированные siControl были названы SGC7901-siRPL6 Контроль и управление АГС-siRPL6 (также называемые контрольные клетки).

Пролиферация клеток анализ
<р> 3- (4,5-диметилтиазол-2- ил) -2,5-дифенил-тетразолия бромид (МТТ) проводили для оценки эффекта RPL6 на пролиферацию клеток, как описано ранее [32]. Оптическую плотность при длине волны 490 нм (A490) каждой лунки считывали на микропланшет-ридере BP800 (Biohit, Хельсинки, Финляндия). Каждый эксперимент проводили в quadruplicates и повторяли 3 раза.

Мягкие агар анализы образования колоний
<р> Мягкая агар Анализ образования колонии использовали для определения якорной независимый потенциал роста клеток. Двенадцать луночные планшеты заполняли 0,5 мл 0,5% -ного агара благородного (Invitrogen) в RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки теленка в качестве нижнего слоя и дают затвердеть при 4 ° С в течение ночи. В общей сложности 200 клеток суспендировали в 0,25 мл 0,3% агарозы и высевают на нижней агара. Клеточные культуры планшеты выдерживали в течение 2-х недель в CO <югу> 2 инкубатора. Число колоний подсчитывали под микроскопом.

Туморогенность в голых мышей
<р> образование Опухоль проводилось с целью оценки последствий RPL6 на туморогенности в естественных условиях. BALB /C голых мышей от 4 до 6 недель были предоставлены Шанхай института рака и размещены в микро-изолирующих клетках под избыточным давлением воздуха, и поддерживают при постоянной температуре (22 ° C) и влажности для исследования туморогенности. Приблизительно 3 × 10 6 клеток в логарифмической фазе, собирали и инъецировали подкожно в верхнюю часть спины BALB /C голых мышей. По крайней мере, три голых мышей использовали для каждой группы. Мыши были убиты через 4 недели и вес опухоли каждой мыши оценивали. Все процедуры для экспериментов на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами институционального ухода за животными и использование комитета в экспериментах на животных центре четвертого военного медицинского университета.

клеточного цикла анализа
<р> Для анализа клеточного цикла распределение фазы, SGC7901 и его варианты в лог-фазе собирали и дважды промывали охлажденным льдом PBS. Клеточные гранулы фиксировали в 70% этаноле, обрабатывали РНКазой А (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) и окрашивали пропидийиодидом (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLoS ONE: ДНК Ремонт Gene APE1 T1349G полиморфизм и риск рака желудка в китайский Population
• PLoS ONE: Потеря белка промиелолейкозе в рака желудка: последствия для IP-10 Expression и опухолеподобных Проникновение…