PLOS ONE: regulación a la baja de RPL6 de siRNA inhibe la proliferación y la progresión del ciclo celular de la célula del cáncer gástrico humano Lines

Extracto

Nuestro estudio anterior reveló que la proteína ribosomal humano L6 (RPL6) fue hasta reguladas en multirresistente células de cáncer gástrico y la sobre expresión de RPL6 podrían proteger el cáncer gástrico de la apoptosis inducida por fármacos. Se demostró además que la sobre regulación de RPL6 aceleró el crecimiento y la mejora en la capacidad de formación de colonias in vitro de células GES, mientras que la baja regulación de RPL6 exhibió los resultados opuestos. El presente estudio fue diseñado para investigar el papel potencial de RPL6 en la terapia del cáncer gástrico para la clínica. La expresión de RPL6 y ciclina E en tejidos de cáncer gástrico y la mucosa gástrica normal se evaluó por inmunohistoquímica. Se encontró que RPL6 y ciclina E se expresaron en un nivel más alto en tejidos de cáncer gástrico que en la mucosa gástrica normal y los dos eran correlativos en el cáncer gástrico. El tiempo de supervivencia de los pacientes postoperatorios se analizó mediante análisis de Kaplan-Meier y se encontró que los pacientes con expresión positiva RPL6 mostraron un menor tiempo de supervivencia que los pacientes que con la expresión negativa RPL6. Fue entonces RPL6 genéticamente reducido regulado en SGC7901 cáncer gástrico y líneas de células AGS por siRNA. Se demostró que la baja regulación de RPL6 reduce colonia capacidad de las células de cáncer gástrico in vitro la formación y redujo el crecimiento celular in vivo. Por otra parte, la baja regulación de RPL6 pudo reprimir G1 a la transición de fase S en estas células. Además, se evidenció que RPL6 siRNA abajo-regula la expresión de ciclina E en células SGC7901 y AGS. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que era RPL6-sobreexpresado en los tejidos gástricos humanos y causaron un mal pronóstico. Baja regulación de RPL6 podría suprimir el crecimiento celular y la progresión del ciclo celular por lo menos hasta abajo de la regulación de ciclina E y que pudieran utilizarse como un enfoque novedoso para el tratamiento del cáncer gástrico

Visto:. Wu Q, Y Gou, Wang Q, Jin H, Cui L, Zhang Y, et al. (2011) La regulación por disminución de RPL6 de siRNA inhibe la proliferación y la progresión del ciclo celular de líneas celulares de cáncer gástrico humano. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10.1371 /journal.pone.0026401

Editor: Xin Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China

Recibido: 7 Agosto, 2011; Aceptado: September 26, 2011; Publicado: 17 de octubre 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica de China (Nº 2010CB732400, Nº 2010CB529300), y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30801349). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico, con la moral alta, fue uno de los cánceres más malignos en los países asiáticos. Su aparición fue un proceso con múltiples factores y de múltiples pasos, que participan en alteraciones en muchas moléculas, incluyendo la activación de proto-oncogenes, la inactivación de genes supresores de tumores, alteraciones en las proteínas relacionadas con el ciclo celular y así sucesivamente. En la última década, se han encontrado un gran número de proto-oncogenes y genes supresores de tumores. A pesar del considerable número de genes ya descritos, están en fase de identificación de nuevos genes con actividades potenciales o supresores de tumores oncogénicos. Sin embargo, el mecanismo molecular de la carcinogénesis gástrica sigue siendo poco clara.

ribosoma es esencial para la síntesis de proteínas en todas las células, que está constituido por ARN ribosómicos (ARNr) y proteínas ribosomales (RPS). Muchos RPs también desempeñan diversas funciones que son independientes de la biosíntesis de proteínas, que se llama función extra-ribosomal [1]. El aumento de más investigación demostró que el trastorno de la traducción de proteínas participó en la tumorigénesis y muchas proteínas ribosomales eran disfuncional en los tumores, pero los mecanismos eran todavía desconocida [2]. Se ha propuesto que muchas RPs actúan como supresores de tumores haploinsufficient en pescado y muchos RPs genes también puede estar oncogenes en especie [3] humano. El primer informe sobre las relaciones entre los RP y los tumores se publicó en 90 s de la disfuncional 20 ^{siglo XX, lo que demuestra la asociación de RPS19 con la progresión del carcinoma de colon y la diferenciación [4] .Thereafter, se encontraron cada vez más RPs en los tumores , tales como la alta expresión de RPL19 en tumores de mama [5], la sobre expresión de RPL7a y RPL37 en muestras de tejido de cáncer de próstata [6], el aumento de expresión de RPL15 en cáncer de esófago [7], RPs marcador de detección tan pronto de escamosas humanas carcinoma de células del cuello uterino [8], y la sobre expresión de RPL36A asociado con la proliferación celular en el carcinoma hepatocelular [9] y así sucesivamente. Los informes relacionados con la asociación de RP con la carcinogénesis siguen aumentando [2], [10]. Sin embargo, el papel exacto de los RPs en el desarrollo de tumores son diversos y todavía necesitan más aclaraciones.}

Anteriormente, se analizaron los perfiles de ARNm de una línea celular de cáncer gástrico humano SGC7901 y su variante resistente a múltiples fármacos SGC7901 /VCR diferencial muestran PCR y la supresión de sustracción de hibridación [11], [12]. RPL6 fue identificado como uno de los genes sobreexpresados ​​en SGC7901 /ADR en comparación con SGC7901, que fue confirmada por RT-PCR y análisis de transferencia Northern [13]. Estudios posteriores revelaron que la regulación de RPL6 protegida células de cáncer gástrico de la apoptosis inducida por adriamicina y aumentó la resistencia de las células de cáncer gástrico a múltiples fármacos quimioterapéuticos, incluyendo vincristina, adriamicina, etopósido, cisplatino y 5-fludrouracil [13]. Estos datos indicaron que RPL6 podría promover los fenotipos malignos de células de cáncer gástrico, lo que nos llevó a realizar el estudio posterior a explorar más a fondo el papel exacto de RPL6 en la carcinogénesis y el desarrollo de cáncer gástrico. Entonces descubrimos que genéticamente regulación de RPL6 en las células GES podría acelerar el crecimiento y mejorar la capacidad de formación de colonias in vitro en células de GES, mientras que la baja regulación de RPL6 podría exhibir los resultados opuestos. Por otra parte, la sobre regulación de RPL6 podría promover G1 a S transición de fase de células GES. El estudio adicional demostró que RPL6 hasta regulada la expresión de ciclina E en células GES [14]. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que RPL6 podría promover los fenotipos malignos de células de cáncer gástrico y RPL6 podría desempeñar un papel oncogénico en la tumorigénesis y el desarrollo de cáncer gástrico, lo que nos ha llevado a cabo el presente estudio para explorar el posible papel de RPL6 en el gen la terapia de cáncer gástrico y podría ser utilizado como un enfoque novedoso para el tratamiento del cáncer gástrico.

resultados
expresión

RPL6 y ciclina e en muestras de cáncer gástrico humano y emparejaron los tejidos adyacentes no neoplásicas

Para explorar las relaciones entre RPL6 y la expresión de ciclina e con el desarrollo de cáncer gástrico, se detectó la expresión RPL6 y ciclina e en tejidos de cáncer gástrico humano y emparejaron los tejidos adyacentes no neoplásicas por tinción inmunohistoquímica. Los resultados revelaron que RPL6 y ciclina localizan casi en el citoplasma y sólo ocasionalmente en los núcleos de células de cáncer gástrico (Fig. 1A). Un análisis más detallado descubrió que la relación positiva (incluidas las muestras que manchaba) de RPL6 fue del 84% (46 de 55 pacientes), mientras que la relación positiva de ciclina E fue del 75% (41 de 55 pacientes) en muestras de cáncer gástrico humano. La relación positiva de ambos RPL6 y ciclina E fue del 70% (38 de 55 pacientes), mientras que la relación negativa (incluyendo especímenes que no se tiñeron) tanto RPL6 y ciclina E fue del 11% (6 de 55 pacientes) en muestras de cáncer gástrico humano . La relación positiva de ambos RPL6 y ciclina E fue del 18% (8 de 55 pacientes) en los tejidos no neoplásicas adyacentes emparejados (datos no mostrados). En cuanto a las diferencias entre la expresión y la expresión de ciclina RPL6 en especímenes de cáncer gástrico humano, no hubo diferencia. El presente estudio demostró que las expresiones RPL6 y ciclina E en muestras de cáncer gástrico humano fueron relativo (figura 1B, p. ≪ 0,05), lo que puede desempeñar un papel con-generoso en el desarrollo de cáncer gástrico y RPL6 y ciclina E puede servir como una biomarcador para el diagnóstico de cáncer gástrico y un objetivo de genes para la terapia del cáncer gástrico. Al final del seguimiento, el tiempo de supervivencia de los pacientes se analizaron por el método de Kaplan-Meier y los resultados revelaron que durante los pacientes que fueron seguidos, los pacientes con tanto RPL6 positivos y ciclina E positivo mostraron una supervivencia más corta y peor pronóstico que aquellos tanto con RPL6 negativo y ciclina e expresión negativa, o aquellos con RPL6 positivo y ciclina e negativo o con RPL6 negativo y ciclina expresión positiva, respectivamente (Fig 2 A, p <. 0,01), que puede ser revelado que los pacientes con tanto RPL6 positivo y ciclina E positivo mostró un mal pronóstico. También se demostró que los pacientes con expresión negativa RPL6 mostraron tiempo de supervivencia que RPL6 los positivos (Fig 2B, p <. 0,01), y los pacientes con ciclina E expresión positiva mostró mal pronóstico (Fig 2C, p <. 0.01). Por lo tanto, una conclusión que se puede extraer RPL6 puede servido como un biomarcador para evaluar el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico.

Expresión de RPL6 en líneas celulares de cáncer gástrico y sus derivados

Para explorar aún más la papel potencial de RPL6 en la terapia génica del cáncer gástrico, células AGS SGC7901 y fueron transfectadas con siRNA-RPL6 específico y se produjo la piscina mixta de variantes de células resistentes a G418. Las variantes resistentes a G418 que albergan siRNA-RPL6 específica fueron nombrados como consecuencia SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 y SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Las células resistentes a G418 que albergan plásmidos siRNA revueltos fueron diseñados como SGC7901-siCONTROL y AGS-siCONTROL respectivamente. Como se muestra en la Figura 3A, la expresión RPL6 fue significativamente las reguladas en SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 y SGC7901-siRPL6-2, las células AGS-siRPL6-2 en comparación con las células parentales y las células de control. En el presente estudio, SGC7901-siRPL6-2 y AGS-siRPL6-2 mostraron resultados inhibitorios más eficaces, lo que indica que las células SGC7901-siRPL6-2 y AGS-siRPL6-2 podría ser utilizado como un buen modelo celular para aclarar el potencial papel de RPL6 en la terapia génica del cáncer gástrico para la clínica.

regulación a la baja de RPL6 suprimir el crecimiento de células de cáncer gástrico in vitro

para estudiar si la baja regulación de la expresión RPL6 podría inhibir el crecimiento de SGC7901 y células AGS, las células parentales, células de control y sus variantes fueron sembradas en placas de cultivo y su crecimiento se controló todos los días con el ensayo de MTT. Como se indica por las curvas de crecimiento en la figura 3B, control (SGC7901-siCONTROL y AGS-siCONTROL) células mostraron una tasa de crecimiento similar a la de los padres (SGC7901 y AGS) células respectivamente, mientras que SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 y SGC7901 células -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 exhibieron tasa de crecimiento más baja que las células de control, y SGC7901-siRPL6-2, las células AGS-siRPL6-2 mostraron la menor tasa de crecimiento (figura 3B, p. < 0,05). El crecimiento independiente de anclaje de estas células se analizó adicionalmente con ensayo de formación de colonias en agar blando. Se reveló que SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 y SGC7901-siRPL6-2, las células AGS-siRPL6-2 producen mucho menos colonias de células en agar blando que sus células parentales y células control (Figura 3C, p. ≪ 0,05), con celdas con nombre SGC7901-siRPL6-2 y AGS-siRPL6-2 fue el de menor colonias. Estos datos sugieren que la baja regulación de RPL6 podría suprimir el crecimiento de células de cáncer gástrico e inhibir la capacidad de formación de colonias de células SGC7901 y AGS.

RPL6 siRNA inhibe la tumorigénesis de células de cáncer gástrico in vivo

Para confirmar adicionalmente los efectos de RPL6 en la tumorigénesis del cáncer gástrico, ensayo de la formación de tumores se realizó en ratones desnudos. SGC7901, AGS y SGC7901-siRPL-2, las células AGS-siRPL6-2 se inocularon por vía subcutánea en la derecha o la parte superior trasera de ratones desnudos atímicos en un solo sitio a la izquierda. (Fig. 4A y C) Cuatro semanas más tarde, los ratones fueron sacrificados y se extirparon los tumores trasplantados y tamaños de los tumores se evaluaron (Fig 4B y D, p <. 0.05). Hubo una disminución significativa de tamaños de xenoinjertos en RPL6 células hacia abajo-regulada. Estos datos indicaron que knock-down de RPL6 podría suprimir la tumorigénesis de células de cáncer gástrico en vivo e RPL6 puede desempeñar un papel clave en la promoción del crecimiento maligno de células de cáncer gástrico in vivo.

RPL6 desaceleró G1-S transición de fase de SGC7901 células

Para descubrir los mecanismos que subyacen a la función supresora de RPL6 en el crecimiento celular del cáncer gástrico, se analizaron los efectos de RPL6 sobre la distribución del ciclo celular de las células SGC7901 (Fig. 5A). Como se muestra en la figura 5B, las células SGC7901-siRPL6-1 mostraron ligeramente mayor porcentaje de la fase G1 y la disminución de porcentaje de la fase S, mientras que las células SGC7901-siRPL6-2 muestran una mayor significativamente porcentaje de la fase G1 y la disminución de porcentaje de la fase S (P < 0,05 ) en comparación con las células parentales y las células de control. Estos indicaron que siRNA RPL6 específica podría desacelerar el G1-S transición de SGC7901 células.

RPL6 abajo-regula la expresión de la ciclina E en células de cáncer gástrico a nivel de proteínas

Es bien sabido que G1-S progresión es controlado por ciclina D /CDK4 y ciclina complejos de e /CDK2, que son reguladas por miembros de la familia INK4, p21 y p27, respectivamente. La expresión de estos reguladores en SGC7901 y las células AGS y sus variantes se determinaron mediante análisis de Western Blot. Como se indica en la figura 6, la expresión de la ciclina E fue significativamente las reguladas en las células AGS-siRPL6-2 SGC7901-siRPL6-2 y. Expresiones de CDK2, p16, p21 y p27 se mantuvieron sin cambios en las variantes de células SGC7901 y AGS. Estos datos sugirieron que la baja regulación de RPL6 disminuyó la expresión de la ciclina E en las células SGC7901 y AGS, que puede delinear el papel potencial de RPL6 y ciclina E en el desarrollo de cáncer gástrico y RPL6 puede utilizar como un objetivo de genes para el cáncer gástrico en la clínica.

Discusión

el presente estudio demostró que RPL6 y ciclina e se sobre-expresado en tejidos de cáncer gástrico y existe una correlación positiva entre ellas en tejidos de cáncer gástrico. Seguimiento de los resultados revelaron que los pacientes con expresión negativa RPL6 mostraron mayor tiempo de supervivencia que aquellos con RPL6 expresión positiva, lo que sugiere que los pacientes positivos mostraron RPL6 mal pronóstico. Investigaciones posteriores demostraron que la baja regulación de RPL6 por RPL6-siRNA inhibe la proliferación y el anclaje independiente crecimiento de líneas celulares de cáncer gástrico in vitro, reprimió la progresión del ciclo celular y suprime la expresión de ciclina E, Además, desmontables de RPL6 de siRNA-RPL6 específica suprimido capacidad de formación de tumor de células de cáncer gástrico in vivo.

en nuestro estudio anterior, los genes expresados ​​diferencialmente asociadas a la resistencia a múltiples fármacos de células de cáncer gástrico se aislaron utilizando visualización diferencial RT-PCR y la hibridación sustractiva [11], [ ,,,0],12]. RPL6, un componente de la subunidad grande de ribosoma, fue aislado de este modo como un clon sobre-expresado en células de cáncer gástrico resistentes a múltiples fármacos [11]. Se demostró que RPL6 podría proteger a las células de cáncer gástrico inducido por fármacos de apoptosis quimioterapéutico [13]. Estos datos sugirieron que podría implicar RPL6 en la regulación del fenotipo maligno de cáncer gástrico. Continuando el estudio fue diseñado para explorar el papel de RPL6 en la tumorigénesis y el desarrollo de cáncer gástrico, y los resultados sugiere que la regulación de RPL6 aceleró el crecimiento y en la colonia vitro capacidad de las células GES mientras que la baja regulación de RPL6 exhibió resultados opuestos formando. Además, la regulación de RPL6 acelerada G1 a S transición de fase de células GES al menos a través de la regulación de la expresión de ciclina E, mientras que la baja regulación de RPL6 mostraron resultados opuestos [14]. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que RPL6 podría desempeñar un papel oncogénico en la tumorigénesis y el desarrollo de cáncer gástrico y puede servir como un nuevo enfoque para la terapia génica del cáncer gástrico.

Hoy en día, cada vez más pacientes murieron de cáncer debido a los fenotipos malignos de ellos. terapia del cáncer perturbado personas en todo el mundo. Además de la quimioterapia y el tratamiento de la cirugía, la terapia génica es una novela y el tratamiento del cáncer prometedor. Uno de los métodos más utilizados para la terapia génica es la interferencia de ARN (RNAi). RNAi, un mecanismo de silenciamiento génico altamente conservada desempeña un papel importante en la regulación de la expresión génica. El silenciamiento génico mediante un mecanismo post-transcripcional que implica homóloga ARN de doble cadena se descubrió primero en sistemas artificiales que se introdujo ARN de doble hebra (dsRNA) a través de inyección o por la expresión de las construcciones transgénicas. Este fenómeno se produce por pequeños ARN de interferencia (siRNA) en el citoplasma de células de mamíferos. En la tecnología de siRNA, se consideraron dos mecanismos de entrega, la entrega directa de nucleótidos siRNA sintético y la introducción de un ADN de plásmido (pDNA) que codifica una construcción de horquilla corta (ARNhc) que sería degradado enzimáticamente en siRNA [15]. SiRNA desempeñó sus funciones inhibidoras, haciendo coincidir con las secuencias de ARNm y se inhibe la expresión del ARNm y la traducción consecuente, y trabajó como regulación negativa. Hoy en día, más y más científicos han descubierto que asoló la expresión de genes de siRNA podría suprimir significativamente el crecimiento tumoral y la metástasis. ligada al X inhibidor de la proteína de la apoptosis (XIAP), un miembro importante de los inhibidores de la proteína de la apoptosis (IAP) de la familia, está involucrado en el control de la división celular, la proliferación celular y la inhibición de la apoptosis [16], [17]. Baja regulación de XIAP de siRNA podría suprimir significativamente la proliferación de las células tumorales y sensibilizar a las células tumorales a los agentes quimioterapéuticos [18], [19]. La osteopontina (OPN) proteína, que se sobre-expresa en la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico y se asocia con su patogénesis, juega un papel importante en la proliferación, invasión, metástasis y la supervivencia del cáncer gástrico [20]. Luego baja regulación de OPN OPN de siRNA específicos inhibió significativamente el crecimiento, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico [21]. CML66, un nuevo antígeno tumoral que jugó un papel oncogénico, estaba sobreexpresado en la mayoría de las líneas celulares de cáncer y cáncer [22], derribando su expresión por CML66-siRNA inhibió significativamente la proliferación, invasión y metástasis de las células HeLa, tanto en vivo e in vitro experimentos [23]. FABP5, que codifica ácido graso cutánea proteína de unión (C-FABP), está regulado en cáncer de próstata y actúa como un oncogén putativo. Baja regulación de FABP5 de siRNA crecimiento de las células del cáncer de próstata efectivamente inhibe-FABP5 específica en ratones nude [24]. Por otra parte, cuando RPS13 proteína ribosomal que realzó la línea celular de cáncer gástrico crecimiento SGC7901 fue derribado por siRNA, el crecimiento celular se inhibió significativamente SGC7901-RPS13 específica y la capacidad de formación de colonias in vitro y la capacidad suprimida la formación de tumores en ratones nude [25]. La investigación anterior también encontró que la administración sistémica de siRNA a través de atelocolágeno, que se dirige específicamente a los tumores, es seguro y factible para la terapia del cáncer en el cáncer de próstata [26]. Por lo tanto, la evidencia sugiere que por encima de siRNA, mediante la inhibición de la expresión de genes podría ser un nuevo enfoque para la terapia del cáncer y hacer que la terapia génica del cáncer viable para el tratamiento clínico.

En el presente estudio, las expresiones de RPL6 y ciclina E en gástrico cáncer de los tejidos y los tejidos no neoplásicas adyacentes emparejados fueron detectados y los resultados indicaron que RPL6 y ciclina e mostró una mayor expresión en tejidos de cáncer gástrico que en tejidos no neoplásicas adyacentes emparejados. Por otra parte, existe una correlación entre RPL6 y ciclina E expresión en tejidos de cáncer gástrico, lo que sugiere que pueden desempeñar un papel con-generoso en el desarrollo de cáncer gástrico y RPL6 podrían servir como un biomarcador para el diagnóstico del cáncer gástrico. Seguimiento de resultados demostraron que los pacientes con ambas expresiones positivas RPL6 positivos y ciclina E mostraron una supervivencia más corta y con peor pronóstico que el control correspondiente y también indicaron que los pacientes con expresión negativa RPL6 mostraron un mayor tiempo de supervivencia y mejor pronóstico que los pacientes con expresión positiva RPL6, lo que sugiere que puede RPL6 servido como un biomarcador para el pronóstico del cáncer gástrico y un objetivo para la terapia génica del cáncer gástrico en la clínica.

para estudiar más a fondo la posible viabilidad de RPL6 como objetivo la terapia génica del cáncer gástrico en la clínica, nos llamaron por la expresión RPL6 en SGC7901 y las células AGS de siRNA-RPL6 específica, los resultados mostraron que la baja regulación de RPL6 en líneas celulares de cáncer gástrico parentales (SGC7901 y AGS) el crecimiento celular inhibe eficazmente y en la colonia vitro la capacidad de formación. Además, el análisis del ciclo celular indicó que la baja regulación de RPL6 desaceleró G1 a la fase S de células de cáncer gástrico. Western blot demostró que RPL6 inhibe la progresión del ciclo celular a través de la baja regulación de los experimentos de formación de ciclina E. tumorales en ratones desnudos sugirió que la baja regulación de RPL6 podría suprimir la formación de tumores in vivo.

ciclina E, una célula clave proteína del ciclo que jugó un papel clave en la transición G1-S estaba en desorden en muchos tumores diferentes [27], [28], [29], [30], [31]. La investigación anterior ha demostrado que la ciclina E era una molécula importante en la tumorigénesis. En el presente estudio, hemos descubierto que la expresión de ciclina E, junto con RPL6 fue mayor en los tejidos de cáncer gástrico humano que en los tejidos adyacentes no neoplásicas coincidentes, lo que sugiere el papel de la ciclina E juega en el desarrollo de cáncer gástrico. La investigación adicional demostró que RPL6 afectado el crecimiento celular mediante la regulación de la ciclina E, que mostró que la alta expresión de la ciclina E se aceleró el crecimiento de células mientras que la baja expresión de la ciclina E se desaceleró la proliferación celular. Ciclina E y RPL6 pueden desempeñar papeles con-generoso en el desarrollo de cáncer gástrico.

En conclusión, el presente estudio demostró que la expresión de la ciclina RPL6 y se asociaron entre sí en tejidos de cáncer gástrico y que podría desempeñar con- papeles generosas en el desarrollo de cáncer gástrico, lo que sugiere que RPL6 puede utilizar como una herramienta de diagnóstico en el cáncer gástrico. Seguimiento de análisis de los datos demostró que los pacientes con expresión negativa RPL6 mostraron un mayor tiempo de supervivencia y mejor pronóstico que los pacientes con RPL6 expresión positiva después de la operación, lo que sugiere que RPL6 sirve como un biomarcador para el pronóstico del cáncer gástrico y un objetivo nuevo gen para la terapia del cáncer gástrico. Continuando el estudio indicó que la baja regulación de la expresión RPL6 por RPL6-siRNA inhibe SGC7901 el crecimiento celular y en la capacidad de formación de colonias in vitro, se desaceleró SGC7901 celda G1 de transición de fase S, y suprime la formación de tumores in vivo. En conclusión, nuestro estudio confirma que RPL6 siRNAs podría ser utilizado como un enfoque novedoso para el tratamiento del cáncer gástrico para la clínica.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

Para obtener muestras de tejido , todos los pacientes fueron informados consentimiento para utilizar el exceso de muestras patológicas con fines de investigación. Los protocolos utilizados en este estudio fueron aprobados por Protección de Comité de Sujetos Humanos de la hospital. La utilización de tejidos humanos fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Cuarta Universidad Médica Militar y se conformó con la Declaración de Helsinki, y con la legislación local. Los pacientes que ofrecen muestras para el estudio firmaron formularios de consentimiento informado. Para la investigación con animales, se llevaron a cabo todos los procedimientos para la experimentación con animales de acuerdo con las directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo del Centro Experimental Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar. El ID de autorización para el uso de los animales fue el No. 10218 por el experimento Centro Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar.

Las muestras de tejido y líneas celulares

Las muestras de tejido embebidas con parafina se obtuvieron de 55 pacientes con cáncer gástrico que se sometió a una gastrectomía en nuestro hospital entre 2004 y 2009. Todos los casos de cáncer gástrico y los tejidos no tumorales adyacentes fueron diagnosticados clínica y patológicamente. Los datos sobre las características clínico y pronóstico de los pacientes se recogieron y analizaron retrospectivamente. Un total de 55 pacientes fueron seguidos hasta el final del año 2009 y dos de ellos se perdieron durante el periodo de seguimiento. línea celular de adenocarcinoma gástrico humano SGC7901 se obtuvo de la Academia de Ciencias Médicas Militares, AGS se obtuvo del Banco de Células de Shanghai (Shanghai, China). Las dos líneas celulares se conservan en nuestro instituto. Todas las líneas celulares se mantuvieron en RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero de ternera fetal inactivado por calor (FCS) a 37 ° C con 5% de CO _{2 en un incubador humidificado (Forma Scientific, Marietta, OH).}

La inmunohistoquímica y la inmunohistoquímica de puntuación

eliminó la parafina y las secciones rehidratadas se lavaron con agua fresca durante 10 minutos. la recuperación de antígeno inducida por calor se llevó a cabo durante 20 minutos a 95 ° C con tampón citrato de sodio 10 mM (pH 6,0). Después los portaobjetos se enfriaron a temperatura ambiente durante 40 minutos, que se bloquearon en peróxido de hidrógeno al 3% durante 20 minutos y luego en un líquido normal de confinamiento de suero de cabra durante 40 minutos. Después de esto, se les permitió reaccionar durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios para IgG, RPL6 y ciclina (Santa Cruz). Después de recalentamiento durante 40 minutos, que luego se hicieron reaccionar con segundos anticuerpos (Zhongshan Goldenbridge Biotecnología CO.LTD) durante otros 40 minutos a temperatura ambiente. A continuación, los productos fueron desarrollados con 3,3-diaminobencidina y de contraste con hematoxilina. La puntuación se completó por un patólogo especialista y un científico que fueron cegados a la información clínica y patológica. En caso de discrepancia, se alcanzó un consenso por conferencia. Las proporciones de células positivas (0 a 3) y las intensidades de tinción (0 a 3) se evaluaron por separado con una ampliación de 200 x. El primero se calculó contando el número de células tumorales teñidas entre el número total de células tumorales, por ejemplo, cuando el 25% del total de células se tiñeron, la puntuación proporción era 1, y 50% es igual a 2, 75% iguales a 3, 0% es igual a 0. la puntuación de la intensidad fue evaluado por el color del núcleo de la célula tumoral manchado, en concreto, la puntuación de 0 significa acromático, 1 significa ámbar, 2 significa amarillo, marrón y 3 significa. la puntuación combinada + 2 + 1~ se definieron "negativo", y 3~ + + 6 fueron considerados "positivo".

Construcción del plásmido y transfección

Dos pares de horquilla pequeños ARN de interferencia (siRNA ) oligos para RPL6 fueron diseñados de acuerdo con las directrices de diseño siRNA de Takara Biotecnología Co., Ltd. Comparar secuencias diana a la base de datos del genoma humano en una búsqueda BLAST para eliminar de la consideración cualquier secuencia diana con 21 pares de bases de homología contigua a otras secuencias de codificación . Para oligo-1, el sentido: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', antisentido: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; para oligo-2, el sentido: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', antisentido: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Un dúplex de ADN scramble también fue diseñado como control, para oligo-1, el sentido: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', antisentido: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Para el recocido para formar dúplex de ADN, se utilizaron 0,01 M cada uno de los oligonucleótidos sentido y antisentido. Los dúplex se diluyeron y se ligan entonces con pSilencer3.1-H1 vector neo (Co Takara Biotecnología (Dalian)., Ltd). Los productos se transformaron en células DH5-competentes. colonias resistentes a la ampicilina fueron seleccionados, identificados por digestión de restricción y confirmado por secuenciación de ADN. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, los plásmidos siRNA de RPL6 se transfectaron en células SGC7901 utilizando Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA), respectivamente. Veinticuatro horas después de la transfección, se añadió G418 (400 mg /ml) al medio de cultivo para el establecimiento de clones estables. Los clones mixtos se expandieron durante otros 2 meses. Las células SGC7901 y AGS (también llamadas células de los padres) que expresan establemente RPL6 exógena fueron nombrados como SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1, y SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Y las células transfectadas con siCONTROL fueron nombrados como SGC7901-siRPL6 control y el mando AGS-siRPL6 (también llamadas células de control).

La proliferación celular ensayo

3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-difenil-tetrazolio (MTT) ensayo se realizó para evaluar el efecto de RPL6 sobre la proliferación celular tal como se describe anteriormente [32]. La absorbancia a 490 nm (A490) de cada pocillo se leyó en un lector de microplacas BP800 (Biohit, Helsinki, Finlandia). Cada experimento se realizó por cuadruplicado y se repitió 3 veces.

ensayos de formación de colonias en agar blando

se utilizó ensayo de formación de colonias en agar suave para determinar el potencial de crecimiento de células independiente del anclaje. Doce placas de pocillos se llenaron con 0,5 ml de 0,5% de agar noble (Invitrogen) en RPMI1640 suplementado con suero de ternera 10%, como una capa inferior y se deja solidificar a 4 ° C durante la noche. Un total de 200 células se suspendieron en 0,25 ml de 0,3% de agarosa y se sembró en el agar inferior. placas de cultivo de células se mantuvieron durante 2 semanas en un CO _{2 incubadora. El número de colonias se contó bajo un microscopio.}

tumorigenicidad en ratones desnudos

formación del tumor se lleva a cabo para evaluar los efectos de RPL6 en la tumorigenicidad in vivo. BALB /c desnudos ratones de 4 a 6 semanas fueron proporcionados por el Instituto de Cáncer de Shanghai y alojados en jaulas micro-aislador bajo presión de aire positiva, y se mantuvo a una temperatura constante (22 ° C) y la humedad para el estudio tumorigenicidad. Aproximadamente 3 × 10 ^{6 se recogieron las células en fase logarítmica y se inyecta por vía subcutánea en la parte superior trasera de los ratones Balb /c desnudos. Al menos tres ratones desnudos se utilizaron para cada grupo. Los ratones se sacrificaron 4 semanas más tarde y se evaluó el peso del tumor de cada ratón. Todos los procedimientos para la experimentación con animales se realizaron de acuerdo con las directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo del Centro Experimental Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar.}

análisis del ciclo celular

Para el análisis del ciclo celular distribución de fase, SGC7901 y sus variantes en fase log se recogieron y se lavaron dos veces con PBS enfriado en hielo. Los sedimentos celulares se fijaron en 70% de etanol, se trató con RNasa A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y se tiñeron con yoduro de propidio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLOS ONE: La reparación del ADN de genes APE1 T1349G polimorfismo y el riesgo de cáncer gástrico en una población china
• PLOS ONE: pérdida de la proteína de la leucemia promielocítica en el cáncer gástrico: Implicaciones para la IP-10 Expresión y linfocitos infiltrantes de tumores,