PLoS ONE: nedregulering av RPL6 av siRNA hemmer spredning og cellecyklusprogresjonen of Human magekreft cellelinjer

Abstract

Vår tidligere studie viste at menneskelig ribosomalt protein L6 (RPL6) var oppregulert i multiresistente magekreftceller og over-uttrykk for RPL6 kunne beskytte magekreft fra legemiddelindusert apoptose. Det ble videre vist at opp-regulering av RPL6 akselerert vekst og forbedret in vitro kolonidannende evne GES celler, mens nedregulering av RPL6 oppviste det motsatte resultat. Denne studien var designet for å undersøke den potensielle rolle RPL6 i terapi av magekreft for klinikken. Ekspresjonen av RPL6 og cyclin E i magekreft vev og normal gastrisk mukosa ble evaluert ved immunohistochemisty. Det ble funnet at RPL6 og cyclin E ble uttrykt på et høyere nivå i magekreft vev enn det som er normalt i mageslimhinne, og de to var korrelative i magekreft. Overlevelsestid av postoperative pasienter ble analysert ved Kaplan- Meier analyse, og det ble funnet at pasienter med RPL6 positivt uttrykk viste kortere overlevelsestiden sammenlignet med pasienter som med RPL6 negative uttrykk. RPL6 var da genetisk nedregulert i magekreft SGC7901 og AGS cellelinjer av siRNA. Det ble demonstrert at nedregulering av RPL6 redusert kolonidannende evne av magekreftceller in vitro og nedsatt cellevekst in vivo. Videre kan nedregulering av RPL6 undertrykke G1 til S-fase overgang i disse cellene. Videre dokumentert vi at RPL6 siRNA nedregulert cyclin E uttrykk i SGC7901 og AGS celler. Samlet utgjør disse resultatene at det RPL6 var over-uttrykt i humane mage vev og forårsaket dårlig prognose. Nedregulering av RPL6 kunne undertrykke cellevekst og cellesyklusprogresjon i det minste ved å nedregulere cyclin E, og som kan bli brukt som en ny tilnærming for å magekreftterapi

relasjon:. Wu Q, Gou Y, Wang Q, Jin H, Cui L, Zhang Y, et al. (2011) nedregulering av RPL6 av siRNA hemmer spredning og cellecyklusprogresjonen of Human magekreft cellelinjer. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10,1371 /journal.pone.0026401

Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

mottatt: 7 august 2011; Godkjent: 26 september 2011; Publisert: 17 oktober 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Denne studien ble støttet delvis med tilskudd fra National Basic Research Program of China (No. 2010CB732400, nr 2010CB529300), og Natural Science Foundation National of China (nr 30801349). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP, med høy moral, var en av de mest ondartet kreft i asiatiske land. Forekomsten var en prosess med multi-faktorer og multi-trinn, som er involvert i endringer i mange molekyler, deriblant aktivering av proto-onkogener, inaktivering av tumor-suppressor-gener, endringer i cellesyklusrelaterte proteiner og så videre. I det siste tiåret, har et stort antall proto-onkogener og tumor-suppressor gener blitt funnet. Til tross for det betydelig antall gener som allerede er beskrevet, er nye gener med onkogene potensielle eller tumorhemmende aktivitet fortsatt blir identifisert. Men den molekylære mekanisme av magekreftutvikling er fortsatt uklar.

ribosom er essensiell for proteinsyntese i alle celler, som utgjøres av ribosomale RNA (rRNAs) og ribosomale proteiner (RPS). Mange RPs også spille ulike roller som er uavhengige av proteinsyntese, som kalles ekstra-ribosomale funksjon [1]. Økende mer forskning demonstrert at forstyrrelse av proteintranslasjon deltatt i tumorigenese og mange ribosomale proteiner var dysfunksjonell i tumorer, men mekanismene var fremdeles ukjent [2]. Det er foreslått at mange RPs fungere som haploinsufficient tumor suppressors i fisk og mange RPS gener kanskje også onkogener i menneskelig form [3]. Den tidligste rapport om forholdet mellom RPs og svulster ble publisert i 90 s av 20 ^{århundre, som viste foreningen av RPS19 med tykktarmskreft progresjon og differensiering [4] .Thereafter, flere og flere RPs ble funnet dysfunksjonell i tumorer , slik som høy uttrykk for RPL19 i brystsvulster [5], over-uttrykk for RPL7a og RPL37 i prostata-kreft vevsprøver [6], høyere uttrykk av RPL15 i spiserørskreft [7], RPs så tidlig deteksjon markør av menneskelig plateepitel cellekarsinom i cervixuteri [8], og over-ekspresjon av RPL36a assosiert med cellulær proliferasjon i leverkreft [9] og så videre. Rapporter om sammenslutning av RPs med kreft fortsatt økende [2], [10]. Men den eksakte roller RPs i tumorutvikling er mangfoldige, men fortsatt trenger ytterligere klargjøring.}

Tidligere analyserte vi mRNA-profiler av en human magekreft cellelinje SGC7901 og dens multiresistent variant SGC7901 /video av differensial vist PCR og undertrykkelse subtraktiv hybridisering [11], [12]. RPL6 ble identifisert som en av de over-uttrykte gener i SGC7901 /ADR i forhold til SGC7901, noe som ble ytterligere bekreftet ved RT-PCR og Northern blot-analyse [13]. Etterfølgende studier viste at oppregulering av RPL6 beskyttet mage kreftceller fra adriamycin-indusert apoptose og forbedret motstand av gastrisk kreft celler til flere kjemoterapeutiske medikamenter, inkludert vinkristin, adriamycin, etopsid, cisplatin og 5-fludrouracil [13]. Disse data indikerte at RPL6 kunne fremme de ondartede fenotyper av mage kreftceller, noe som førte oss til å gjennomføre den påfølgende studie for å utforske videre eksakte rolle RPL6 i kreftutvikling og utvikling av magekreft. Da vi oppdaget at genetisk oppregulering av RPL6 i GES celler kunne akselerere veksten og forbedre in vitro kolonidannende evne GES celler, mens nedregulering av RPL6 kunne oppvise de motsatte resultater. Videre oppregulering av RPL6 kunne fremme G1 til S-fase overgang av GES celler. Videre studier viste at RPL6 oppregulert cyclin E uttrykk i GES celler [14]. Samlet utgjør disse resultatene at det RPL6 kunne fremme de ondartede fenotyper av mage kreftceller og RPL6 kan spille en onkogen rolle i tumordannelse og utvikling av magekreft, noe som førte oss til å gjennomføre denne studien å undersøke mulighetene rolle RPL6 i genet terapi av magekreft og kan brukes som en ny tilnærming til magekreft terapi.

Resultater

RPL6 og cyclin E uttrykk i menneskelige mage kreftprøver og matchet tilstøtende ikke-neoplastiske vev

for å utforske forholdet mellom RPL6 og cyclin E uttrykk med utvikling av magekreft, vi har oppdaget RPL6 og cyclin E uttrykk i menneskelige mage kreft vev og matchet tilstøtende ikke-neoplastiske vev ved immunhistokjemisk farging. Resultatene viste at RPL6 og cyclinE lokalisert nesten i cytoplasma og bare av og til i kjerner i mage kreftceller (Fig. 1a). Videre analyser oppdaget at det positive forhold (inkludert prøver som farget) av RPL6 var 84% (46 av 55 pasienter), mens den positive forhold av cyclin E var 75% (41 av 55 pasienter) i humane magecancerprøver. Den positive forhold på både RPL6 og cyclin E var 70% (38 av 55 pasienter), mens den negative forhold (herunder prøver som ikke flekker) av både RPL6 og cyclin E var 11% (6 av 55 pasienter) i humane mage kreftprøver . Det positive forhold av både RPL6 og cyclin E ble 18% (8 av 55 pasienter) i sammenfallende tilstøtende ikke-neoplastiske vev (data ikke vist). Når det gjelder forskjellene mellom RPL6 uttrykk og cyclinE ekspresjon i humane magecancerprøver, var det ingen forskjell. Denne studien viste at RPL6 og cyclin E uttrykk i menneskelige magekreft prøver var relativ (figur 1B, p. ≪ 0,05), som kan spille en con-sjenerøs rolle i utviklingen av magekreft og RPL6 og cyclin E kan tjene som en biomarkør for magekreft diagnose og et gen mål for magekreft terapi. Ved slutten av oppfølgings, ble overlevelsestiden for pasientene analysert ved Kaplan- Meier metode, og resultatene viste at i løpet av pasientene som ble fulgt opp, pasienter med både RPL6 positiv og cyclin E positiv viste en kortere overlevelsestid og dårligere prognose enn med både RPL6 negativ og cyclin E negative uttrykk, eller de med RPL6 positiv og cyclin E negativ eller med RPL6 negativ og cyclinE positivt uttrykk henholdsvis (figur 2 A, p. < 0,01), som kan bli avdekket at pasienter med både RPL6 positiv og cyclin E positive viste dårlig prognose. Det er også vist at pasienter med RPL6 negative uttrykk viste lengre overlevelsestid enn RPL6 positive (figur 2B, p. ≪ 0,01), og pasienter med cyclin E positivt uttrykk viste dårlig prognose (figur 2C, p. ≪ 0,01). Derfor kan en konklusjon trekkes at RPL6 kan serveres som en biomarkør for å vurdere prognosen av mage kreftpasienter.

Uttrykk av RPL6 i magekreft cellelinjer og dets derivater

For ytterligere å undersøke potensielle rolle RPL6 i genterapi av magekreft, ble SGC7901 og AGS celler transfektert med RPL6 spesifikke siRNA og blandet pool av G418-resistente celle varianter ble produsert. G418-resistente varianter husing RPL6 spesifikke siRNA ble derfor benevnt som SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. G418-resistente celler som krafse siRNA plasmider ble utformet som henholdsvis SGC7901-siControl og AGS-siControl. Som vist i figur 3A, RPL6 ekspresjon ble betydelig nedregulert i SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2-celler sammenlignet med foreldreceller og kontrollcellene. I den foreliggende undersøkelse, SGC7901-siRPL6-2 og AGS-siRPL6-2 viste mer effektive inhiberende resultater, noe som indikerte at SGC7901-siRPL6-2 og AGS-siRPL6-2 celler kan brukes som en god cellemodell for å avklare potensialet rollen RPL6 i genterapi av magekreft for klinikken.

nedregulering av RPL6 undertrykke magekreft cellevekst in vitro

for å undersøke om nedregulering av RPL6 uttrykk kan hemme veksten av SGC7901 og AGS celler, foreldre celler, kontrollceller og deres varianter ble sådd på kulturplater og deres vekst ble overvåket hver dag med MTT-analyse. Som indikert av vekstkurvene i figur 3B, kontroll (SGC7901-siControl og AGS-siControl) celler viste en tilsvarende vekst i foreldre (SGC7901 og AGS) celler henholdsvis, mens SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 og SGC7901 -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celler viste lavere veksttakt enn Kontrollceller celler~~POS=HEADCOMP, og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celler viste den laveste vekstrate (figur 3B, p. < 0,05). Den forankrings-uavhengig vekst av disse cellene ble analysert videre med bløt agar-kolonidannelsesbestemmelsen. Det ble avslørt at SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 celler produseres mye mindre cellekolonier i myk agar enn foreldre celler og kontrollceller (Fig 3C, p <.; 0,05), celler kalt med SGC7901-siRPL6-2 og AGS-siRPL6-2 produsert minst koloniene. Disse data antydet at nedregulering av RPL6 kunne undertrykke magekreft cellevekst og hindre kolonidannelse evne SGC7901 og AGS celler.

RPL6 siRNA hemmet tumordannelse av magekreftceller in vivo

Å ytterligere bekrefte effektene av RPL6 på tumorigenesis av magekreft, ble tumordannelse målingen ble utført på nakne mus. SGC7901, AGS og SGC7901-siRPL-2, ble AGS-siRPL6-2 celler subkutant podet inn i høyre eller venstre øvre del av ryggen av atymiske nakne mus på ett sted. (Fig. 4A og C) Fire uker senere ble musene drept, og de transplanterte tumorer ble skåret ut og tumorstørrelsene ble evaluert (figur 4B og D, p. ≪ 0,05). Det var en betydelig reduksjon av størrelsen av xenografter i RPL6 nedregulert celler. Disse data indikerte at knock-down av RPL6 kunne undertrykke magekreftcelle tumorigenesis in vivo og RPL6 kan spille en nøkkelrolle i å fremme ondartet vekst av magekreftceller in vivo.

RPL6 bremses G1-S fase overgang av SGC7901 celler

for å avdekke mekanismene bak undertrykkende rolle RPL6 i magekreft cellevekst, ble effekten av RPL6 på cellesyklus distribusjon av SGC7901 celler analysert (fig. 5A). Som vist i figur 5B, SGC7901-siRPL6-1 celler viste noe økt prosentandel av G1 fase og redusert prosentandel av S-fasen, mens SGC7901-siRPL6-2 celler som vises betydelig økt prosentandel av G1 fase og redusert prosentandel av S-fasen (P < 0,05 ) sammenlignet med parentale celler og kontrollcellene. Dette indikerte at RPL6-spesifikke siRNA kunne retardere G1-S-overgang av SGC7901 celler.

RPL6 nedregulert ekspresjon av cyclin E i magekreftceller på proteinnivået

Det er vel kjent at G1-S progresjon styres av cyklin D /CDK4 og cyklin E /CDK2 komplekser, som er regulert av INK4 familiemedlemmer, p21 og p27, respektivt. Uttrykket av disse regulatorer i SGC7901 og AGS celler og dens varianter ble bestemt ved Western Blot analyse. Som antydet i figur 6, ekspresjon av cyclin E ble signifikant nedregulert i SGC7901-siRPL6-2 og AGS-siRPL6-2 celler. Uttrykk for CDK2, p16, p21 og p27 var uendret i SGC7901 og AGS celle varianter. Disse data antydet at nedregulering av RPL6 redusert ekspresjon av cyclin E i SGC7901 og AGS-celler, som kan avgrense den potensielle rolle RPL6 og cyclin E i utvikling av magekreft og RPL6 kan anvendes som et gen som mål for magekreft i klinikken.

Diskusjoner

Denne studien viste at RPL6 og cyclin E var over-uttrykt i mage kreft vev, og det er en positiv sammenheng mellom dem i mage kreft vev. Oppfølging Resultatene viste at pasienter med RPL6 negative uttrykk viste lengre overlevelsestid enn de med RPL6 positive uttrykk, noe som antydet at RPL6 positive pasienter viste dårlig prognose. Videre forskning har vist at nedregulering av RPL6 ved RPL6-spesifikk siRNA inhiberte proliferasjonen og forankrings-uavhengig vekst av magecancercellelinjer in vitro, trykt cellesyklusprogresjon og undertrykket cyclin E uttrykk, Videre knockdown av RPL6 ved RPL6-spesifikk siRNA trykt svulstdannelse evne mage kreftceller in vivo.

i vår forrige undersøkelse, differensielt uttrykte gener knyttet til multiresistens av mage kreft celler ble isolert ved hjelp av differensial skjerm RT-PCR og subtraktiv hybridisering [11], [ ,,,0],12]. RPL6, en komponent av den store subenhet av ribosom, ble således isolert som en klon over-uttrykt i multiresistente magecancerceller [11]. Det ble demonstrert at RPL6 kunne beskytte magekreftceller fra kjemoterapeutisk medikament-indusert apoptose [13]. Disse data antydet at RPL6 kan innebære i reguleringen av den ondartede fenotype av magekreft. Videre studier ble konstruert for å undersøke hvilken rolle RPL6 i tumorigenese og utvikling av magekreft, og resultatene antydet at oppregulering av RPL6 akselerert vekst og in vitro kolonidannende evne GES celler, mens nedregulering av RPL6 oppviste motsatte resultater. Også oppregulering av RPL6 akselerert G1 til S-fase overgang fra GES celler i det minste ved oppregulering av cyclin E uttrykk mens nedregulering av RPL6 viste motsatte resultater [14]. Samlet utgjør disse resultatene at det RPL6 kan spille en onkogen rolle i tumordannelse og utvikling av magekreft og kan tjene som en ny tilnærming til genterapi av magekreft.

I dag, økende flere pasienter døde av kreft på grunn av ondartede fenotyper av dem. Kreftbehandling forstyrret mennesker over hele verden. Foruten kjemoterapi og kirurgisk behandling, er genterapi en ny og lovende kreftbehandling. En av de mest brukte metoder for genterapi er RNA interferens (RNAi). RNAi, spiller en sterkt konservert gen stillemekanisme en viktig rolle i reguleringen av genekspresjon. Genet Slå av en post-transkripsjonell mekanisme som omfatter homolog dobbelt-trådet RNA ble først oppdaget i kunstige systemer hvor dobbeltstrenget RNA (dsRNA) ble innført via injeksjon eller ved ekspresjon av transgene konstruksjoner. Dette skjer ved små interfererende RNA (siRNA) i cytoplasma i pattedyrceller. I siRNA teknologi, ble to leveringsmekanismer vurderes, direkte levering av syntetisk siRNA nukleotid og innføring av et plasmid DNA (pDNA) koder for en kort hårnål konstruksjon (shRNA) som ville være enzymatisk nedbrutt til siRNA [15]. SiRNA spilt sine hemmende roller ved å matche med sekvenser av mRNA og hemmet påfølgende mRNA uttrykk og oversettelse, og jobbet som en negativ regulering. I dag har flere og flere forskere oppdaget at slått ned genuttrykk av siRNA kunne gi en betydelig undertrykke tumorvekst og metastasering. X-bundet hemmer av apoptose protein (XIAP), et viktig medlem av inhibitorer av apoptose protein (IAP) familien, er involvert i kontroll av celledeling, celleproliferasjon og inhibering av apoptose [16], [17]. Nedregulering av XIAP ved siRNA kan i betydelig grad undertrykke proliferasjon av tumorceller og sensibilisere tumorceller overfor kjemoterapeutiske midler [18], [19]. Osteopontin (OPN) protein, som ble overuttrykt i de fleste av magekreftpasienter og i forbindelse med dets patogenese, spilte en viktig rolle i spredning, invasjon, metastase og overlevelse av magekreft [20]. Deretter nedregulering av OPN ved OPN-spesifikk siRNA vesentlig hemmet vekst, migrering og invasjon av magekreftceller [21]. CML66, en roman svulst antigen som spilte en onkogen rolle, var over-uttrykt i et flertall av kreft cellelinjer og kreft [22], slå ned sitt uttrykk ved CMl66 spesifikke siRNA betydelig hemmet spredning, invasjon og metastasering av HeLa-celler både i vivo og in vitro eksperimenter [23]. FABP5, som koder for kutan fettsyrebindende protein (FABP-C), er oppregulert i prostatakreft og fungerer som en antatt onkogen. Nedregulering av FABP5 ved FABP5-spesifikk siRNA effektivt hemmet prostatacancer cellevekst i nakne mus [24]. Dessuten, når ribosomalt protein RPS13 som forbedret magekreft cellelinje SGC7901 vekst ble slått ned av RPS13-spesifikke siRNA, det betydelig hemmet SGC7901 cellevekst og kolonidannende evne in vitro og undertrykte tumordannelse evne i nude mus [25]. Tidligere forskning har også funnet at systemisk levering av siRNA via atelokollagen, som er spesielt rettet mot svulster, er trygt og gjennomførbart for kreftbehandling i prostata kreft [26]. Derfor bevis ovenfor foreslo at siRNA, ved å hemme genekspresjon kan være en ny tilnærming til kreftbehandling og gjøre genterapi av kreft mulig for klinisk behandling.

I denne studien uttrykk for RPL6 og cyclin E i mage cancervev og de tilpassede tilstøtende ikke-neoplastiske vev ble registrert, og resultatene indikerte at RPL6 og cyclin E viste økt ekspresjon i magekreft vev enn i sammenfallende tilstøtende ikke-neoplastiske vev. Videre er det en sammenheng mellom RPL6 og cyclin E uttrykk i mage kreft vev, noe som antydet at de kan spille en con-sjenerøs rolle i utviklingen av magekreft og RPL6 kan tjene som en biomarkør for magekreft diagnose. Oppfølging Resultatene viste at pasienter med både RPL6 positive og cyclin E positive uttrykk viste en kortere overlevelse og dårligere prognose enn den tilsvarende kontroll og viste også at pasienter med RPL6 negative uttrykk viste lengre overlevelsestid og bedre prognose enn pasienter med RPL6 positive uttrykk, som antydet at RPL6 kan serveres som en biomarkør for magekreft prognose og et gen mål for magekreft behandling i klinikken.

for ytterligere å undersøke mulighetene heten av RPL6 som genterapi mål av magekreft i klinikken, vi banket ned RPL6 ekspresjon i SGC7901 og AGS celler ved RPL6-spesifikke siRNA, viste resultatene at nedregulering av RPL6 i magekreft parencellelinjer (SGC7901 og AGS) effektivt inhiberte cellevekst og in vitro kolonidannende evne. Videre er cellesyklusanalyse indikerte at nedregulering av RPL6 bremses G1 til S-fasen av magekreftceller. Western blot-analyse viste at RPL6 hemmet cellesyklusutvikling ved nedregulering av cyclin E. tumordannelse i nakne mus eksperimenter antydet at nedregulering av RPL6 kunne undertrykke tumordannelse in vivo.

Cyclin E, en nøkkel celle syklus protein som spilte nøkkelroller i G1-S-overgang var i uorden i mange forskjellige tumorer [27], [28], [29], [30], [31]. Tidligere forskning har vist at cyclin E var et viktig molekyl i tumorigenesis. I denne studien, oppdaget vi at cyclin E uttrykk, sammen med RPL6 var høyere i menneskelige mage kreft vev enn at i matchet tilstøtende ikke-neoplastiske vev, som foreslått rolle cyclin E spilt i utviklingen av magekreft. Videre forskning viste at RPL6 påvirket cellevekst ved å regulere cyclin E, som viste at høyt uttrykk for cyclin E akselerert cellevekst mens lav uttrykk for cyclin E avtatt celleproliferasjon. Cyclin E og RPL6 kan spille con-sjenerøs roller i utviklingen av magekreft.

I konklusjonen, denne studien viste at RPL6 og cyclinE uttrykket var forbundet med hverandre i mage kreft vev og de kan spille kon- sjenerøse roller i utviklingen av magekreft, noe som antydet at RPL6 kan brukes som et diagnostisk verktøy i magekreft. Følge opp dataanalyse viste at pasienter med RPL6 negative uttrykk viste lengre overlevelsestid og bedre prognose enn pasienter med RPL6 positivt uttrykk postoperativt, noe som antydet at RPL6 fungerte som en biomarkør for magekreft prognose og en roman gen mål for magekreft terapi. Videre studier indikerte at nedregulering av ekspresjon av RPL6 RPL6-spesifikk siRNA hemmet SGC7901 cellevekst og in vitro kolonidannelsen evne, retarderes SGC7901 celle G1 til S-fase overgang, og undertrykket tumordannelse in vivo. Konklusjonen vår studien bekreftet at RPL6 sirnas kan brukes som en ny tilnærming til magekreft terapi for klinikken.

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

For vevsprøver alle pasientene ble informert samtykke til bruk av overskytende patologiske prøver for forskningsformål. Protokollene som brukes i denne studien ble godkjent av sykehusets beskyttelse av menneske fag komiteen. Bruken av menneskelig vev ble godkjent av Institutional Review Board av den fjerde Military Medical University og ble forvandlet til Helsinki-deklarasjonen, og til lokal lovgivning. Pasienter som tilbyr prøvene for studien signert informert samtykke former. For dyr forskning, ble alle prosedyrer for dyreforsøk utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer Experiment Animal midten av fjerde Military Medical University. Godkjenningen ID for å bruke dyrene ble nr 10218 av Experiment Animal Center of the fjerde Military Medical University.

Vevsprøver og cellelinjer

Vevsprøver innebygd med parafin ble samlet fra 55 pasienter med magekreft som gjennomgikk gastrektomi i våre sykehus mellom 2004 og 2009. Alle tilfeller av magekreft og tilstøtende ikke-tumorvev ble diagnostisert klinisk og patologisk. Data om clinicopathological funksjoner og prognoser av pasientene ble samlet og analysert retrospektivt. Totalt 55 pasienter ble fulgt opp fram til slutten av året 2009, og to av dem ble tapt under oppfølgingsperioden. Menneskelig gastrisk adenokarsinom cellelinje SGC7901 ble hentet fra Academy of Military Medical Science, ble AGS hentet fra Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kina). De to cellelinjer ble bevart i vårt institutt. Alle cellelinjene ble opprettholdt i RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) tilsatt 10% varme-inaktivert føtalt kalveserum (FCS) ved 37 ° C med 5% CO _{2 i en fuktet inkubator (Forma Scientific, Marietta, OH).}

Immunohistochemistry og Immunhistokjemisk scoring

Deparaffinized og rehydrert seksjonene ble vasket i ferskvann i 10 minutter. Termisk induserte antigen gjenfinning ble utført i 20 minutter ved 95 ° C med 10 mM citrat natrium-buffer (pH 6,0). Etter at snittene ble avkjølt ved romtemperatur i 40 minutter, ble de blokkert i 3% hydrogenperoksid i 20 minutter og deretter i normal geiteserum begrensnings væske i 40 minutter. Etter dette fikk de lov til å reagere over natten ved 4 ° C med primære antistoffer for IgG, RPL6 og cyclinE (Santa Cruz). Etter gjenoppvarming i 40 minutter, var de så reagert med andre antistoffer (Zhongshan Goldenbridge bioteknologi CO.LTD) for ytterligere 40 minutter ved romtemperatur. Da produktene ble utviklet med 3,3'-diaminobenzidin og kontra med haematoxylin. Scoring ble gjennomført av en spesialist patolog og en vitenskapsmann som var blindet for den kliniske og patologiske informasjon. Ved uoverensstemmelse, ble en enighet etter konferanser. Andelene av positive celler (0 til 3) og fargeintensitetene (0 til 3) ble evaluert separat ved en forstørrelse på 200 x. Førstnevnte ble beregnet ved å telle antallet fargede tumorceller blant det totale antall tumorceller, for eksempel når 25% av totale celler ble farget, andelen minutter ble 1, og 50% er lik til 2, 75% likhets til 3, tilsvarer 0% til 0. intensiteten anledninger ble evaluert ved fargen av farget tumorcellekjernen, spesielt, 0 poeng betyr akromatisk, 1 betyr rav, 2 betyr gul, og 3 betyr brun. Kombinert scoring + 1~ + 2 ble definert "negative", og + 3~ + 6 ble betraktet som "positive".

Plasmid konstruksjon og transfeksjon

To par hårnål små interfererende RNA (siRNA ) oligonukleotider for RPL6 ble utformet i henhold til de siRNA retningslinjer for design av Takara Bioteknologi Co, Ltd sammenligning målsekvenser til det menneskelige genom databasen i en BLAST søk for å eliminere fra hensynet noen mål sekvens med 21 basepar av homologi sammenhengende til andre sekvenser . For oligo-1, sense: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; for oligo-2, sense: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; En krafse DNA-dupleks er også utformet som kontroll, for oligo-1, sense: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. For gløding for å danne DNA-duplekser, 0,01 M hver av sense og antisense oligonukleotider ble anvendt. Duplexes ble utvannet og deretter bundet med pSilencer3.1-H1 neo vektor (Takara Bioteknologi (Dalian) Co., Ltd). Produktene ble forvandlet til DH5a-kompetente celler. Ampicillin-resistente kolonier ble utvalgt, identifisert ved restriksjonsspaltning, og ytterligere bekreftet ved DNA-sekvensering. Ifølge produsentens instruksjoner, ble siRNA plasmider av RPL6 transfektert inn SGC7901 celler ved hjelp Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, California), henholdsvis. Tjuefire timer etter transfeksjon, ble G418 (400 ug /ml) tilsatt til kulturmediet for å etablere stabile kloner. De blandede kloner ble ekspandert for ytterligere 2 måneder. De SGC7901 og AGS celler (også kalt foreldreceller) stabilt uttrykker EXOGENIC RPL6 ble navngitt som SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1, og SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Og celler transfektert med siControl ble navngitt som SGC7901-siRPL6 Kontroll og AGS-siRPL6 Control (også kalt kontrollceller).

Celleproliferering analysen

3- (4,5-2- yl) -2,5-difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) analyse ble utført for å evaluere effekten av RPL6 på celleproliferasjon som tidligere beskrevet [32]. Absorbansen ved 490 nm (A490) fra hver brønn ble lest på en mikroplateleser BP800 (Biohit, Helsinki, Finland). Hvert eksperiment ble utført i quadruplicates og ble gjentatt 3 ganger.

soft agar-kolonidannelse assays

myk agar-kolonidannelse analyse ble benyttet for å beregne forankringsuavhengig cellevekst potensial. Tolv brønners plater ble fylt med 0,5 ml 0,5% agar edel (Invitrogen) i RPMI 1640 supplert med 10% kalveserum som et bunnlag og tillatt å stivne ved 4 ° C over natten. Totalt 200 celler ble suspendert i 0.25 ml av 0,3% agarose og utsådd på bunnen agar. Cellekulturplatene ble holdt i 2 uker i en CO _{2 inkubator. Antallet kolonier ble tellet under et mikroskop.}

tumorigenicity i hårløse mus

Tumor formasjonen ble gjennomført for å vurdere virkningene av RPL6 på tumorigenicity in vivo. BALB /c nakne mus av 4 til 6 uker, ble gitt av Shanghai Cancer Institute og plassert i mikro isolator merdene under positivt lufttrykk, og holdt ved en konstant temperatur (22 ° C) og fuktighet for den tumorgenisitetsstudie. Omtrent 3 x 10 ^{6-celler i log-fasen ble oppsamlet og injisert subkutant i øvre del av ryggen av BALB /c nakne mus. Minst tre nakne mus ble brukt for hver gruppe. Musene ble avlivet 4 uker senere, og tumorvekten for hver mus ble evaluert. Alle prosedyrer for dyreforsøk ble utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk komité retningslinjer Experiment Animal midten av fjerde Military Medical University.}

Cell syklus analyse

For analyse av cellesyklus fase~~POS=TRUNC fordelingen~~POS=HEADCOMP, SGC7901 og dens varianter ved log-fase ble høstet og vasket to ganger med iskald PBS. Cellepelletene ble fiksert i 70% etanol, ble behandlet med RNase A (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) og farget med propidiumjodid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLoS ONE: DNA Repair Gene APE1 T1349G Polymorphism og risikoen for magekreft i en kinesisk Befolkning
• PLoS ONE: Tap av Promyelocytic Leukemi Protein i Gastric Cancer: Konsekvenser for IP-10 Expression og Tumor-infiltrerende Lymphocytes