Фон
<р> Рецептор для продвинутых гликирования (RAGE) является онкогенными междисциплинарный транс-перепончатые рецептор, который избыточно экспрессируется во многих раковых заболеваний человека. В последнее время было показано, что RAGE, также участвует в процессе канцерогенеза и опухолевой инвазии. В данном исследовании мы исследовали уровни экспрессии и прогностическое значение RAGE в первичного рака желудка (GC).
Введение Заявление по этике <бр> <р> Это исследование было одобрено комитетом по этике Nanfang больницы и письменное информированное согласие было получено всеми этими пациентами, участвующих. Пациенты и образцы ткани Вестерн-блоттинга иммуногистохимического анализа Статистический анализ Результаты Гиперэкспрессия RAGE в человеческих GC Ассоциация экспрессии RAGE с клинико-патологические характеристики Корреляция между экспрессией RAGE на основе IHC и выживаемости пациентов одномерных и многомерных Анализы Обсуждение На сегодняшний день значение ориентации RAGE для возможного раннего вмешательства и профилактики в GC остается неясным. Тем не менее, некоторые исследования выявили роль RAGE в других типах рака и показали, что блокада RAGE пониженный рост и метастазирование обоих имплантированных опухолей и опухолей развивающихся спонтанно у восприимчивых мышей. Ингибирование пролиферации RAGE уменьшилось в раковых клетках молочной железы и индуцированный апоптоз клеток и ингибирует рост рака простаты [20,21]. RAGE Дисфункция также ингибирует ангиогенез и прогрессирование колоректального рака, и длительное выживание при раке поджелудочной железы [22-24]. Блокада RAGE с растворимым RAGE (sRAGE) ослабляется повреждение печени, тем самым улучшая выживание, защиту от гепатоцеллюлярной некроза, а также усиления экспрессии фактора некроза-proregenerative опухоли цитокина [25]. К тому же, Moy и др. [26] обнаружили пограничное статистически значимую обратную связь между непрерывным воздействием sRAGE и риском развития рака печени, предполагая, что sRAGE может защитить от воспалительных эффектов, вызванных активацией RAGE. Эти результаты показали, что последовательно RAGE, могут также выступать в качестве потенциальной терапевтической мишени в GC. Учитывая биологические характеристики, RAGE и его производные были рассмотрены в качестве нового показателя злокачественного потенциала, включая GC. RAGE Gly 82Ser полиморфизм было показано, что связано с повышенным риском развития ГХ или прогрессирования в исследовании случай-контроль стационара на основе [13].
<р> рецептор для продвинутых конечных продуктов гликозилирования (RAGE), молекулы клеточной поверхности, выраженной в разнообразных типах клеток, является multiligand членом иммуноглобулина надсемейства [1]. RAGE, участвует в широком спектре патологических реакций, включая воспаление и рак, основываясь на множестве его лигандов [2]. Как недавно обнаруженным онкогенного транс-мембранным рецептором, было показано, участвует в многочисленных человеческих раковых клеток, стимулирующих рост, выживание и распространение метастазов [3]. Несколько исследований показали, что RAGE, усиливает свою активность и теряет свою характерную картину гранулированную в первичных опухолях [4]. Взаимодействие AGE-RAGE, играет решающую роль в развитии рака предстательной железы, а также ингибировать это взаимодействие имеет потенциал в качестве новой молекулярной мишени для профилактики рака или терапии [5]. Совместная экспрессия RAGE и высокой мобильности группы белка В1 (HMGB1) был в значительной степени связан с колоректальным инвазии и метастазирования рака [4,6,7]. Кроме того, экспрессия RAGE, коррелирует с ангиогенеза и метастазирования опухолей в полости рта плоскоклеточный рак (ККОН) и может быть независимым прогностическим фактором рецидива и прогнозом у пациентов ККОН [8,9]. Кроме того, генетический полиморфизм гена RAGE может быть прогностическим биомаркером используется для скрининга пациентов чувствительны к термотерапии и оценить прогноз немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) у пациентов [10].
<Р> Тем не менее, роль гнева при раке желудка (GC) остается неуловимым. RAGE, ранее уже было указано тесно связано с инвазии и метастазирования при раке желудка [11]. Кроме того, сообщалось, что блокада передачи сигналов RAGE подавление роста и метастаз клеток рака желудка [12]. В расследовании роли RAGE в GC патогенезе и прогрессии и последствия генных полиморфизмов на функции рецептора, Гу и его коллеги [13] показали, что RAGE Gly 82Ser полиморфизм может быть связано с повышенным риском инициирования или прогрессирование рака желудка. Тем не менее, насколько нам известно, отношения между выражением RAGE и GC прогнозом пациента неизвестна.
<Р> В этом исследовании мы проанализировали уровень экспрессии бушевать в GC, используя в реальном масштабе времени количественной ОТ-ПЦР (QRT-PCR), Вестерн-блоттинга и иммуногистохимии (IHC). Мы определили связь между выражением RAGE и клинико-патологическими особенностями GC, а затем оценивали прогностическое значение выражения RAGE для послеоперационной выживаемости больных ГЦ.
Материалы и методы
<р> Тридцать парные свежезамороженной желудка раковой и соответствующие доброкачественное слизистой ткани (иссекают &Гт в 10 см от края ГЦ) образцов были получены от больных ГЦ в течение 30 мин после резекции и сразу же хранили в жидком азоте до использования. Еще 180 парафиновых блоков тканей GC и 69 контрольных образцов из подобранных нормальных желудочных тканей, взятых из дистального края резекции были получены из сохраненных файлов кафедры общей хирургии, Nangfang больница, Южный медицинский университет, были собраны хирургическим путем в период с января 2007 года по декабрь 2008. 180 пациентов включали 120 мужчин и 60 женщин в возрасте 22-78 лет (в среднем 55,62 лет). Ни один из этих пациентов не лечили лучевой терапии или химиотерапии до хирургического вмешательства. Гистопатологическая тип и стадия резецированных образцов были определены в соответствии с критериями классификации Всемирной организации здравоохранения и Объединенного комитета американского рака (AJCC) Рак Поэтапное руководство по эксплуатации (7-е издание, 2010). Среди них 125 пациентов Стадия I-III получил радикальной резекцию (19, 25 и 81 для этапов I, II и III, соответственно), и 55 пациентов Стадия-IV получил паллиативные операции и /или химиотерапии. Метастаз пострадавших отдаленные органы у пациентов Стадии-IV включали брюшину, далекий лимфатический узел, печени, толстой кишки, поперечную яичника или яйцевода, поджелудочной железы, кишечника, костей, легких, головного мозга и нижней полой вены. Пациенты находились под наблюдением до самой смерти или последнего последующего дня (30 декабря 2013 года). Средняя продолжительность наблюдения составила 48 месяцев (от 2 до 82 месяцев).
Общее извлечение РНК и в режиме реального времени количественный RT-PCR
<р> Суммарную РНК экстрагировали из измельченных тканей с TRIzol реагент (Takara, Japan) и обратной транскрипции к первой цепи кДНК с TaqMan с обратной транскрипцией Kit (Takara, Japan). Затем, 0,5- до 1-мкл аликвоты кДНК использовали в качестве матриц для амплификации фрагмента RAGE (вперед: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3; обратный: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) при следующих условиях: 95 ° C в течение 30 с; 40 циклов при 95 ° С в течение 5 секунд; 60 ° С в течение 30 с; и плавление при температуре 95 ° С в течение 5 секунд, затем 60 ° С в течение 1 мин, и охлаждение при 50 ° C в течение 30 сек. ПЦР и сбор данных проводились на LightCycler480 системе (Roche, Швейцария) с комплектом мастер-микс 2 × SYBR Green (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Выражение RAGE нормировался что из GAPDH.
<р> Вестерн-блоттинг проводили в соответствии со стандартными способами, как описано ранее [14]. В кратком изложении, ткани измельчали и подвергали лизису с RIPA буфера для лизиса и лизаты собирали центрифугированием (12000 оборотов в минуту) при 4 ° С в течение 30 мин. Концентрации белка определяли с использованием набора для анализа белка с применением бицинхониновой кислоты (Pierce, Rockford, IL, USA). Примерно 50 мкг образцы затем отделяли электрофоретически на 10% додецилсульфата натрия (SDS) -polyacrylamide геле и переносили на поливинилидендифторидную мембрану. После блокирования неспецифических сайтов связывания, мембрану инкубировали с кроличьей поликлональной анти-RAGE антителом (Санта-Круз, Калифорния, США) в 1: 1000 разбавление при 4 ° С в течение ночи. После трех промывок TBST (трис-забуференный солевой раствор с Tween-20) в течение 10 мин, мембраны инкубировали со вторичным антителом при разведении 1: 3000 при комнатной температуре в течение 60 мин. Белки были обнаружены с расширенной системой хемилюминесценции (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, Нью-Джерси, США), и нормализовали к бета-актина обнаружены с помощью мыши против человеческого бета-актина антитело (разведение 1: 1000; Sigma, Сент-Луис, Миссури , США).
<р> анализ IHC проводили, как описано ранее [12,14]. Вкратце, слайды были депарафинировали диметилбензолом и регидратации через градиент этанола (100%, 95%, 90%, 80% и 70% этанола) в воду. После промывания PBS (фосфатно-солевого буферного раствора) в течение трех раз, слайды кипятили в буфере антигена поиска информации, 0,01 М цитрата натрия-соляной кислоты (рН = 6,0), в течение 30 мин в микроволновой печи. После того, как эндогенная активность пероксидазы гасили 3% Н <югу> 2О <подразделам> 2, после трех промывок PBS, неспецифического связывания антител блокировали путем инкубации слайды с 10% нормальной козьей неиммунной сыворотки. Затем срезы инкубировали при 4 ° С в течение ночи с кроличьи поликлональные RAGE антителом (Санта-Круз, Калифорния, США) на разведение 1: 400, а затем инкубируют с пероксидазой хрена (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM обнаружения комплект) при комнатной температуре в течение 30 мин. После промывки в PBS, срезы Затем были разработаны с использованием 3,3-V-диаминобензидин (Sigma), промывали в проточной водопроводной водой, и слегка контрастному окрашиванию гематоксилином до обезвоживания и покровное монтажа. Отрицательные контрольные эксперименты проводились путем замены первичного антитела с PBS.
<Р> Иммунологическое анализировали с помощью двух независимых наблюдателей (Y.X. и L.Z.), которые были ослеплены к исходу пациентов и других клинико-патологическими параметрами. Система обнаружения RAGE, было описано ранее [12]. Все образцы были классифицированы по степени иммунореактивности: 0, &ЛТ; 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. Окрашивание интенсивность оценивали как 0, отрицательное значение; 1, слабый; 2, умеренный; 3, сильный. Для каждого случая, общий балл иммунное также известен как индекс окрашивания (SI), рассчитывалась путем умножения процент положительных клеток со счетом интенсивность окрашивания, что дает значение от 0 до 12. Для этого исследования, оптимальное значение среза было определены следующим образом: SI &л; 8 использовали для обозначения низкую экспрессию RAGE и выражение высокой RAGE SI≥8
<р> Статистический анализ был проведен с использованием статистического пакета программ SPSS (SPSS версия 19.0.; SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Сопряженному-образцы Т-тест был использован для сравнения мРНК Ярость и уровни белка в раковых и смежных образцов нераковых тканей. Тест Манна-Уитни U или тест хи-квадрат Пирсона был использован для сравнения оценки СИ, полученные с помощью иммуногистохимических анализа ГХ и соответствующей нормальной слизистой ткани. Взаимосвязь между экспрессией RAGE и клинико-патологическими характеристиками были проанализированы с помощью хи-квадрат Пирсона тест. Кривые выживаемости рассчитывали по методу Каплана-Майера и анализировали с помощью лог-рангового теста. Пропорционального риска регрессионной модели Кокса была использована для однофакторного и многофакторного анализа для оценки соотношения рисков (ОР) и определить факторы, которые предсказывают выживание. Двусторонний значение р &л;. 0,05 считались статистически значимыми
<р> Для выяснения роли RAGE в развитии GC и прогрессии, мы сначала анализировали его экспрессию в образцах GC и соответствуют соседние нераковых тканей на уровне мРНК. В режиме реального времени количественный анализ ОТ-ПЦР показал, что RAGE, был избыточно экспрессируется в большинстве тканей ГЦ по сравнению с их нормальным аналогами (19/30; 63,3%) (рис 1). RAGE, аналогичным образом усиливает свою активность на уровне белка в GC, как показано с помощью Вестерн-блоттинга и анализы IHC. Повышенные уровень экспрессии RAGE был найден Вестерн-блоттинга анализа в 26 из 30 (86,7%) ГКС по сравнению с нормальными тканями (рис 2). Парафиновые блоки (N = 249) из 180 пациентов GC оценивали на экспрессию RAGE белка с помощью IHC (таблица 1). В отсутствие или низкое окрашивание (SI ≪ 8) нормальной слизистой оболочки желудка наблюдалось в 55 из 69 случаев (79,7%), в то время как высокое окрашивание (SI≥8) было отмечено в большинстве тканей GC (111/180; 61,7%). Выражение RAGE была значительно выше в тканях GC (n = 180; SI = 6,22) по сравнению с нормальными тканями желудка (n = 69; SI = 2,09; P
&л; 0,001). Характерные примеры слабых, умеренных, сильных окрашивания (микрофотографии с 200-кратным увеличением) показаны на рис 3.
<р> На основе категорий, которые мы определили в раздел Методы, данные показали, что высокая экспрессия RAGE значимо коррелировали с гистологическим класса ( P
= 0,002), узловой статус (N стадии, P
= 0.025), статус метастаз (M этап, P
= 0,002) и AJCC стадии ( P
= 0,020), но не с пола, возраста, размера опухоли, локализации опухоли, классификации Lauren или опухолевой инвазии (табл 2).
<р> кривая Каплана-Мейера показал, что пациенты с высоким RAGE группы имели значительно худшую общую выживаемость, чем пациенты с низким RAGE группа ( P
&л; 0,001; фиг.4А). У больных с высоким уровнем экспрессии RAGE также имели значительно худшую общую выживаемость, чем пациенты с низкой экспрессией RAGE в стадии AJCC III /IV подгруппы (п = 136; P
&л; 0,001; Рис 4C), но не в этап AJCC I /II подгруппа (п = 44; P
= 0,695; фиг.4В).
<р> Однофакторный анализ показал значимую связь между общим выживание и возраст, инвазия опухоли, узловой статус, статус метастаз, AJCC этап и экспрессия RAGE (таблица 3). Все эти факторы включены в многомерном Кокс модели пропорциональных рисков для корректировки последствий ковариантами. На основе этой модели, уровни экспрессии RAGE (отношение рисков (HR) = 2.143; 95% доверительный интервал (95% ДИ) = 1.357-3.383; P
= 0,001) и инвазия опухоли (HR = 11,209; 95 % ДИ = 1.297-96.874; P
= 0,028) были подтверждены в качестве независимых прогностических факторов (таблица 3)
<р> GC остается одним из самых смертельных злокачественных опухолей человека. , особенно в Восточной Азии. Несмотря на успехи в диагностике и терапии, прогноз для рака желудка до сих пор ничтожен, зависит от ряда карцинома характеристик, таких как опухолевый рост, дифференцировку, инвазию и отдаленными метастазами [15]. GC канцерогенез и прогрессирование плохо изучены, сложные, многоэтапные процессы регулируются внутренними и внешними клеточных сигналов с участием нескольких генов и белков изменения. Крайне важно, чтобы определить и понять молекулярные механизмы, лежащие в основе инициации и прогрессии опухоли разработать рациональные и канцерогенные конкретные подходы к ранней диагностике и лечению GC.
<Р> В данном исследовании мы исследовали состояние экспрессии RAGE в GC как на мРНК, так и уровни белка и обнаружили, что RAGE был заметно усиливает свою активность в тканях человека GC по сравнению с нормальным эпителием желудка. Анализ IHC проводили для дальнейшей проверки этой положительной регуляции экспрессии RAGE в первичном GC. Мы отметили, что высокий уровень экспрессии RAGE был в значительной степени связано с гистологической степени, узловой статус, статус метастазирования и AJCC стадии ГХ, аналогично предыдущим выводам в ККОН и НМРЛ [9,10]. Взятые вместе, эти результаты свидетельствуют о том, что RAGE могут быть вовлечены в прогрессировании ГХ.
<Р> Мы также определили в первый раз, что экспрессия RAGE является сильным предиктором неблагоприятного прогноза для пациентов GC, аналогичные выводы в колоректального рака, гепатоцеллюлярной рак, ККОН и НМРЛ [9,10,16,17]. Однако прогностическое влияние экспрессии RAGE, как представляется, различаются в зависимости от стадии рака (рис 4). В настоящем исследовании, анализ выживаемости предположил, что инвазия опухоли и экспрессия RAGE независимо друг от друга предсказали плохую общую выживаемость. Относительно небольшие размеры выборки из стадии I и II группы могут быть ответственны за разницу. Большинство пациентов с GC в Китае диагностированы в в поздних стадиях из-за отсутствия эффективного раннего обнаружения. Кроме того, экспрессия RAGE имеет более узкий 95% ДИ и, как представляется, аа лучшим предсказателем для GC по сравнению с опухолевой инвазии в данном исследовании.
<Р> RAGE является рецептором паттерн распознавания, который связывает несколько лигандов, полученных из среды поврежденной клетки, и играет решающую роль в развитии желудочно-tumourigenesis [18]. Кроме того, в качестве важного воспалительного медиатора, RAGE может модулировать перекрестных помех между путями выживания и аутофагии в опухолевых клетках и способствуют выживанию опухолей с помощью поддержания аутофагию и ограничения апоптоза [19]. Kuniyasu и др
. [11] сообщили, что экспрессия RAGE тесно связана с инвазии и метастазирования у больных ГХ, что обеспечивает нам экспериментальную основу для функционального исследования RAGE при раке желудка. Впоследствии, Сюй и его коллеги [12] показали, что нокдаун RAGE уменьшенный пролиферации клеток GC и инвазии рака желудка, снижение экспрессии АКТ, PCNA и ММР-2 и индуцированный апоптоз клеток и цикла ареста. Таким образом, целевое ингибирование RAGE или его лигандов могут служить в качестве новых целей для улучшения текущих методов лечения рака.
<Р> В настоящем исследовании мы обнаружили, что повышающая регуляция экспрессии RAGE была в значительной степени связано с плохими характеристиками клинико-патологическими и плохой общей выживаемости, предполагая, что это может способствовать злокачественного потенциала ГК. Поэтому RAGE может, следовательно, служить ценным новым биомаркером для предсказания прогноза и потенциальной терапевтической мишени для пациентов с GC. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования для выяснения механизмов, лежащих в основе Гнева избыточной экспрессии, тем самым способствуя более глубокому пониманию и дальнейшего развития его потенциальное использование.
Выражение признательности
<р> Мы благодарим д-р Ян Сяо Лян и д-р Чжао из Департамента патологии для патологического диагноза и подтверждения результатов IHC.
Аллергии, связанные с повышенным потреблением нездоровой пищи,
Грибы и бактерии в кишечнике могут в равной степени влиять на здоровье человека и тяжесть заболевания.
Смесь на основе козьего молока полезна для здоровья кишечника младенцев
Растительная пища может передавать человеку устойчивые к антибиотикам супербактерии
Риск рака пищевода можно снизить с помощью эзомепразола и аспирина в низких дозах.
Болезнь Крона
DeNovix объявляет победителя конкурса на спектрофотометр / флуорометр Platinum DS11 FX +
Компания DeNovix Inc. рада объявить победителя конкурса, который получит в дар уникальный, Спектрофотометр / флуорометр DS11 FX + платинового цвета. Случайно выбранный из тысяч записей, победитель Д-
Отметка потенциальных молекулярных предикторов ответа на биологическую терапию при язвенном колите
Некоторые люди, страдающие заболеваниями кишечника, такими как язвенный колит, не реагируют на традиционно используемые биологические методы лечения. В таких случаях, персонализированный прогноз терап
Нил Белл назначен директором по развитию Avacta Life Sciences
Avacta Group plc, разработчик Affimer ® биотерапевтические препараты и реагенты, рада объявить о немедленном назначении Нила Белла директором по развитию Avacta Life Sciences. Нил будет отвечать за