PLoS ONE: sovraespressione del recettore per l'avanzata Glycation prodotti finali (RAGE) è associato ad una prognosi sfavorevole nel cancro gastrico

Astratto

Sfondo

Il recettore per prodotti finali della glicazione avanzati (RAGE) è un multidisciplinare recettore trans-membranoso oncogeno, che è sovraespresso in molteplici tumori umani. Recentemente, è stato dimostrato che RAGE è anche coinvolto nella carcinogenesi del tumore e l'invasione. In questo studio, abbiamo studiato i livelli di espressione e valore prognostico di RAGE nei tumori gastrici primarie (GC).

Metodi

Abbiamo studiato l'espressione di gran moda in GC primaria e associato tessuto gastrico normale reale tempo quantitativa RT-PCR (n = 30) e l'analisi Western blotting (n = 30). Inoltre, abbiamo effettuato immunoistochimica su 180 campioni GC inclusi in paraffina, 69 abbinati campioni normali.

Risultati

RAGE è stato sovraespresso in GC rispetto ai tessuti non tumorali adiacenti ( P
<0.001), e l'espressione più alta RAGE significativamente correlata con il grado istologico ( P
= 0,002), stato linfonodale ( P
= 0.025), lo stato di metastasi ( P
= 0.002), e Joint Committee on Cancer palco ( P
= 0,020). Inoltre, upregulation dell'espressione RAGE è un fattore prognostico indipendente in analisi multivariata utilizzando il modello di regressione di Cox ( P
= 0,001).

Conclusioni

RAGE sovraespressione può essere un utile indicatore per prevedere la progressione GC e prognosi infausta

Visto:. Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, Mou T, et al. (2015) La sovraespressione del recettore per l'avanzata Glycation prodotti finali (RAGE) è associato ad una prognosi sfavorevole nel cancro gastrico. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10.1371 /journal.pone.0122697

Editor Accademico: Valli De Re, IRCCS Istituto Nazionale Tumori, ITALIA

Ricevuto: 22 Novembre 2014; Accettato: 13 Febbraio 2015; Pubblicato: 10 apr 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

disponibilità dei dati: Tutti i dati rilevanti sono all'interno della carta

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma nazionale della specialità chiave clinica medica, il Fondo di ricerca del benessere pubblico in Health Industry (No.201402015), l'importante programma di Scienza e Tecnologia programma di Guangzhou (No.201300000087), e The National Key Technology R & D programma (No.2013BAI05B00). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

il recettore per i prodotti finali della glicazione avanzati (RAGE), una molecola di superficie cellulare espressa in una vasta gamma di tipi di cellule, è un membro del multiligand immunoglobuline superfamiglia [1]. RAGE è stata implicata in un ampio spettro di risposte patologiche, tra cui l'infiammazione e cancro, in base alla varietà dei suoi ligandi [2]. Come un recettore trans-membranoso oncogeno appena riconosciuta, è stato dimostrato di essere coinvolto in diversi tumori umani stimolare la crescita, la sopravvivenza e la diffusione metastatica [3]. Diversi studi hanno dimostrato che RAGE è upregulated e perde il suo modello granulare caratteristica nei tumori primari [4]. L'interazione AGE-RAGE svolge un ruolo cruciale nello sviluppo del cancro alla prostata, e inibendo questa interazione ha un potenziale come un nuovo bersaglio molecolare per la prevenzione del cancro o la terapia [5]. Co-espressione di RAGE e High-mobilità proteina gruppo B1 (HMGB1) è stato sostanzialmente associata al colon-retto l'invasione del cancro e metastasi [4,6,7]. Inoltre, l'espressione RAGE è correlata con l'angiogenesi tumorale e le metastasi nel carcinoma a cellule squamose orale (OSCC) e può essere un fattore prognostico indipendente di recidiva e la prognosi nei pazienti OSCC [8,9]. Inoltre, il polimorfismo genetico del gene RAGE può essere un biomarcatore predittivo utilizzato per schermo per i pazienti sensibili alla termoterapia e per valutare la prognosi del cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC) pazienti [10].

Tuttavia, il ruolo di RAGE nel carcinoma gastrico (GC) è rimasta inafferrabile. RAGE è stata precedentemente indicato strettamente associato con l'invasione e metastasi nel cancro gastrico [11]. Inoltre, è stato segnalato che il blocco della segnalazione rabbia repressa la crescita e la metastasi delle cellule di cancro gastrico [12]. In un'indagine sui ruoli di RAGE in GC patogenesi e nella progressione e gli effetti dei suoi polimorfismi genici sulla funzione dei recettori, Gu e colleghi [13] hanno dimostrato che RAGE Gly ^{82Ser polimorfismo può essere associato ad un aumento del rischio di innesco o progressione del carcinoma gastrico. Tuttavia, a nostra conoscenza, il rapporto tra l'espressione di RAGE e GC prognosi del paziente è sconosciuta.}

In questo studio, abbiamo analizzato il livello di espressione RAGE in GC utilizzando real-time RT-PCR quantitativa (qRT-PCR), Western blotting ed immunoistochimica (IHC). Abbiamo identificato una relazione tra espressione rabbia e le caratteristiche clinico-patologici di GC, e poi valutato il valore prognostico di espressione RAGE per la sopravvivenza postoperatoria dei pazienti CG.

Materiali e Metodi

dichiarazione etica

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Nanfang Hospital e consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti questi pazienti coinvolti.

pazienti e campioni di tessuto

Trenta accoppiato fresco congelato gastrica cancerose e corrispondente tessuti della mucosa non tumorali (asportato > 10 cm di distanza dal bordo del GC) i campioni sono stati raccolti da pazienti GC entro 30 minuti dopo la resezione e subito conservati in azoto liquido fino al momento dell'uso. Un altro 180 blocchi di tessuto GC inclusi in paraffina e 69 campioni di controllo da corrispondenti tessuti normali gastrici prelevati dal margine di resezione distale sono stati ottenuti dai file memorizzati del Dipartimento di Chirurgia Generale, Nangfang Hospital, Southern Medical University, sono stati raccolti chirurgicamente tra il gennaio 2007 e il dicembre 2008. I 180 pazienti inclusi 120 uomini e 60 donne di età compresa tra 22-78 anni (media, 55.62 anni). Nessuno di questi pazienti sono stati trattati con radioterapia o chemioterapia prima dell'intervento chirurgico. Il tipo istopatologico e lo stadio dei campioni asportati sono stati determinati secondo i criteri della classificazione dell'Organizzazione Mondiale della Sanità e il Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual (7 ° edizione, 2010). Tra questi, 125 pazienti in stadio I-III ricevuto resezione radicale (19, 25 e 81 per le fasi I, II e III, rispettivamente), e 55 pazienti Stage-IV hanno ricevuto la chirurgia e /o chemioterapia palliativa. Gli organi distanti metastasi colpite nei pazienti Stage-IV incluso il peritoneo, linfonodo distante, fegato, colon trasverso, dell'ovaio o ovidutto, pancreas, intestino, ossa, polmoni, cervello e la vena cava inferiore. I pazienti sono stati seguiti fino alla morte o l'ultima data di follow-up (30 dicembre 2013). Il tempo mediano di follow-up è stato di 48 mesi (da 2 a 82 mesi).

estrazione di RNA totale e in tempo reale RT-PCR quantitativa

L'RNA totale è stato estratto dai tessuti tritata con il TRIzol reattivo (Takara, Giappone) e trascrizione inversa a cDNA prima filamento con la TaqMan trascrizione inversa Kit (Takara, Giappone). Poi, da 0,5 a 1-microlitri aliquote di cDNA sono stati utilizzati come modelli per amplificare il frammento RAGE (in avanti: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3; inverso: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) nelle seguenti condizioni: 95 ° C per 30 s; 40 cicli di 95 ° C per 5 secondi; 60 ° C per 30 s; e fusione a 95 ° C per 5 secondi, seguito da 60 ° C per 1 min, e raffreddamento a 50 ° C per 30 sec. PCR e la raccolta dei dati sono stati eseguiti su LightCycler480 System (Roche, Svizzera) con 2 × SYBR Green kit Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, California, Stati Uniti d'America). espressione RAGE è stata normalizzata a quella della GAPDH.

Western blotting

Western blotting è stata eseguita secondo metodi standard, come descritto in precedenza [14]. Brevemente, i tessuti sono stati macinati e lisate con tampone di lisi RIPA ei lisati sono state raccolte mediante centrifugazione (12.000 rpm) a 4 ° C per 30 min. concentrazioni di proteine ​​sono state determinate utilizzando il Protein Assay Kit acido bicinconinico (Pierce, Rockford, IL, USA). Circa 50 microgrammi campioni sono stati poi separati per elettroforesi, il 10% sodio dodecil solfato (SDS) gel -polyacrylamide e trasferiti in una membrana polivinildenfluoruro. Dopo aver bloccato i non specifici siti di legame, la membrana è stata incubata con un coniglio policlonale anti-RAGE anticorpi (Santa-Cruz, CA, USA) in una diluizione 1: 1.000 a 4 ° C durante la notte. Dopo tre lavaggi con TBST (soluzione salina tamponata con tris-Tween-20) per 10 min, le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 3000 a temperatura ambiente per 60 min. Le proteine ​​sono state rilevate con un sistema di chemiluminescenza potenziata (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA), e normalizzati per beta-actina rilevati utilizzando un mouse anticorpo β-actina anti-umano (1: 1000 diluizione; Sigma, St. Louis, MO , Stati Uniti d'America).

immunoistochimica test

Il test IHC è stata eseguita come descritto in precedenza [12,14]. Brevemente, i vetrini sono stati deparaffinate con dimethylbenzene e reidratate attraverso un gradiente di etanolo (100%, 95%, 90%, 80% e 70% etanolo) in acqua. Dopo lavaggio con PBS (tampone fosfato salino) per tre volte, vetrini sono stati bolliti in tampone recupero dell'antigene, 0,01 M citrato di sodio-acido cloridrico (pH = 6,0), per 30 minuti in un forno a microonde. Dopo l'attività perossidasi endogena è stata spenta con il 3% H _{2O 2, a seguito di tre lavaggi PBS, anticorpo legame non specifico è stata bloccata incubando i vetrini con il 10% normale di capra siero non immune. Le sezioni sono state poi incubate a 4 ° C per una notte con l'anticorpo policlonale di coniglio RAGE (Santa-Cruz, CA, USA) in una diluizione 1: 400 e successivamente incubate con perossidasi di rafano (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) a temperatura ambiente per 30 min. Dopo il lavaggio in PBS, le sezioni sono state poi sviluppate utilizzando 3,3-V-diaminobenzidina (Sigma), lavati in acqua corrente, e leggermente di contrasto con ematossilina prima di disidratazione e vetrino di montaggio. esperimenti di controllo negativo sono stati condotti sostituendo l'anticorpo primario con PBS.}

Immunocolorazione è stato analizzato da due osservatori indipendenti (Y.X. e L.Z.) che sono stati accecati a esiti dei pazienti e altri parametri clinico-patologici. Il sistema di rilevamento RAGE è stato descritto in precedenza [12]. Tutti i campioni sono stati classificati dalla misura di immunoreattività: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. intensità di colorazione è stato segnato come 0, negativo; 1, debole; 2, moderata; 3, forte. Per ogni caso, il punteggio totale immunocolorazione noto anche come indice di colorazione (SI), è stata calcolata moltiplicando la percentuale di cellule positive con il punteggio intensità di colorazione, ottenendo un valore compreso tra 0 e 12. Per questo studio, un valore ottimale di taglio era identificato come segue: SI < 8 è stato utilizzato per indicare l'espressione bassa RAGE ed espressione alta RAGE SI≥8

l'analisi statistica

l'analisi statistica è stata effettuata utilizzando il pacchetto software statistico SPSS (versione SPSS 19.0. , SPSS, Chicago, IL, USA). A-campioni appaiati t-test è stato utilizzato per confrontare i mRNA rabbia e livelli di proteine ​​nei campioni di tessuto non tumorali cancerose e adiacenti. Il test di Mann-Whitney U o il test di Pearson chi-quadrato è stato utilizzato per confrontare i punteggi ottenuti da SI analisi immunoistochimica del GC e del tessuto mucosa normale corrispondente. Il rapporto tra l'espressione di RAGE e le caratteristiche clinico-patologici sono stati analizzati utilizzando il test di Pearson Chi-quadrato. Le curve di sopravvivenza sono state calcolate secondo il metodo di Kaplan-Meier e analizzati utilizzando il log-rank test. Il modello dei rischi proporzionali di regressione di Cox è stato utilizzato per l'analisi univariata e multivariata per valutare l'hazard ratio (HR) e identificare i fattori che predicono la sopravvivenza. A due lati p-value. ≪ 0,05 sono stati considerati statisticamente significativi

Risultati

sovraespressione di RAGE in GC umana

Per chiarire il ruolo di RAGE nello sviluppo GC e progressione, in primo luogo abbiamo analizzato la sua espressione nei campioni GC e abbinati tessuti non tumorali adiacenti a livello di mRNA. Real-time quantitativa analisi RT-PCR ha dimostrato che RAGE è stato overexpressed nella maggior parte dei tessuti GC rispetto alle loro controparti normali (19/30; 63,3%) (Fig 1). RAGE è stato simile upregulated a livello proteico in GC, come mostrato da Western Blot e saggi IHC. Elevato livello di espressione RAGE è stato trovato con l'analisi Western blotting in 26 su 30 (86,7%) rispetto al GC tessuti normali (Fig 2). Incluso in paraffina blocchi (n = 249) di 180 pazienti con CG sono stati valutati per l'espressione della proteina RAGE da IHC (Tabella 1). Assente o bassa colorazione (SI < 8) della mucosa gastrica è stata osservata in 55 su 69 casi (79,7%), mentre elevata colorazione (SI≥8) è stato osservato nella maggior parte dei tessuti GC (111/180; 61,7%). espressione RAGE è stata significativamente maggiore nei tessuti GC (n = 180; SI = 6.22) rispetto ai normali tessuti gastrici (n = 69; SI = 2.09; P
< 0,001). Esempi rappresentativi di deboli, moderati, forti di colorazione (microscopio con 200 × ingrandimenti) sono mostrati in figura 3.

Associazione di espressione RAGE con caratteristiche clinico-patologici

In base alle categorie che abbiamo definito nel la sezione Metodi, i dati hanno mostrato che l'alta espressione di RAGE è risultata significativamente correlata con il grado istologico ( P
= 0,002), stato linfonodale (stadio N, P
= 0.025), lo stato di metastasi (M fase, P
= 0,002) e lo stadio AJCC ( P
= 0,020), ma non era con sesso, età, dimensioni del tumore, localizzazione del tumore, la classificazione Lauren o l'invasione del tumore (Tabella 2).

La correlazione tra l'espressione RAGE sulla base di IHC e sopravvivenza del paziente

La curva di Kaplan-Meier ha mostrato che i pazienti nel gruppo ad alto RAGE avevano una sopravvivenza globale significativamente peggiore rispetto ai pazienti a basso RAGE gruppo ( P
< 0,001; Fig 4A). I pazienti con elevata espressione di RAGE ha avuto anche una sopravvivenza globale significativamente peggiore rispetto a quelli con bassa espressione di RAGE nella fase AJCC III /IV sottogruppo (n = 136; P
< 0,001; Fig 4C), ma non in lo stadio AJCC I /II sottogruppo (n = 44; P
= 0,695; Fig 4B).

univariata e multivariata analisi

l'analisi univariata ha mostrato una relazione significativa tra complessiva la sopravvivenza e l'età, l'invasione del tumore, stato linfonodale, lo stato di metastasi, stadio AJCC ed espressione RAGE (vedi tabella 3). Tutti questi fattori sono inclusi in un multivariata di Cox modello di rischio proporzionale per regolare gli effetti delle covariate. Sulla base di questo modello, i livelli di espressione RAGE (hazard ratio (HR) = 2.143; intervallo di confidenza del 95% (95% CI) = 1,357-3,383; P
= 0,001) e l'invasione tumorale (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297-96,874; P
= 0,028) sono stati confermati come fattori prognostici indipendenti (Tabella 3)

Discussione

GC resta una delle neoplasie umane più fatali. , in particolare in Asia orientale. Nonostante i progressi nella diagnosi e terapia, la prognosi per il cancro gastrico è ancora triste e dipende da una serie di caratteristiche di carcinoma, come la crescita del tumore, differenziazione, invasione e metastasi a distanza [15]. tumorigenesi GC e la progressione sono poco conosciute, complessi processi multistep regolati da segnali cellulari intrinseche ed estrinseche che coinvolgono molteplici alterazioni del gene e proteine. E 'di vitale importanza per identificare e comprendere i meccanismi molecolari alla base di iniziazione e la progressione del tumore di sviluppare approcci razionali e specifici del tumore alla diagnosi precoce e il trattamento di GC.

In questo studio, abbiamo studiato lo stato di espressione RAGE in GC sia a livello di mRNA e livelli di proteine ​​e ha scoperto che RAGE è stata notevolmente upregulated nei tessuti umani GC rispetto al normale epitelio gastrico. analisi IHC è stata eseguita per validare ulteriormente questo upregulation di espressione RAGE in GC primaria. Abbiamo osservato che un elevato livello di espressione RAGE era significativamente associato con il grado istologico, stato linfonodale, lo stato di metastasi, e lo stadio AJCC in GC, simile a precedenti risultati in OSCC e NSCLC [9,10]. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che RAGE possono essere coinvolti nella progressione GC.

Abbiamo determinato anche per la prima volta che l'espressione RAGE è un forte predittore di prognosi sfavorevole per i pazienti GC, simile a scoperte nel cancro del colon-retto, epatocellulare cancro, OSCC e NSCLC [9,10,16,17]. Tuttavia, l'impatto prognostico di espressione RAGE sembra differire a seconda dello stadio del cancro (Fig 4). In questo studio, l'analisi di sopravvivenza ha suggerito che l'invasione tumorale e l'espressione di RAGE hanno predetto in modo indipendente scarsa sopravvivenza globale. Le relativamente piccole dimensioni del campione della fase I e II gruppo potrebbero essere responsabili per la differenza. La maggior parte dei pazienti affetti da GC in Cina sono diagnosticati in nelle fasi avanzate a causa della mancanza di diagnosi precoce efficiente. Inoltre, l'espressione RAGE ha un più stretto IC 95% e sembra essere aa predittore migliore per GC rispetto a invasione tumorale in questo studio.

RAGE è un recettore riconoscimento di forme che si lega più leganti derivati ​​da un ambiente cellula danneggiata, e svolge un ruolo fondamentale nel promuovere la tumorigenesi gastrointestinale [18]. Anche come un importante mediatore infiammatorio, RAGE potrebbe modulare crosstalk tra i percorsi di sopravvivenza e l'autofagia nelle cellule tumorali e promuovere la sopravvivenza del tumore tramite sostenere l'autofagia e di limitare l'apoptosi [19]. Kuniyasu et al
. [11] hanno riferito che, l'espressione RAGE è strettamente associato con l'invasione e metastasi in pazienti GC, che ci fornisce una base sperimentale per lo studio funzionale di RAGE nel cancro gastrico. Successivamente, Xu e colleghi [12] hanno dimostrato che il colpo di RAGE ridotta proliferazione delle cellule GC e l'invasione del cancro gastrico, diminuita espressione di AKT, PCNA e MMP-2, e l'apoptosi cellulare indotta e arresto del ciclo. Pertanto, mirato l'inibizione di RAGE o dei suoi ligandi può servire obiettivi come nuovi per migliorare le terapie del cancro attuali.

Ad oggi, il valore di puntare RAGE per un possibile intervento precoce e profilassi in GC rimane poco chiaro. Tuttavia, diversi studi hanno rivelato il ruolo di RAGE in altri tipi di cancro e hanno dimostrato che il blocco di RAGE è diminuita la crescita e le metastasi di entrambi i tumori impiantati e tumori in via di sviluppo spontaneamente nei topi suscettibili. L'inibizione di RAGE è diminuita la proliferazione delle cellule di cancro al seno e l'apoptosi cellulare indotta e la crescita del cancro alla prostata inibito [20,21]. RAGE erettile anche inibito l'angiogenesi e la progressione del cancro del colon-retto, e prolungato la sopravvivenza nel carcinoma pancreatico [22-24]. Il blocco del RAGE con RAGE solubile (Srage) attenuato danno epatico, migliorando in tal modo la sopravvivenza, la protezione contro la necrosi epatocellulare, e migliorare l'espressione del fattore di necrosi, una citochina proregenerative tumorale [25]. Inoltre, Moy et al. [26] hanno trovato un'associazione inversa statisticamente significativa linea di confine tra l'esposizione Srage continua e il rischio di cancro al fegato, il che suggerisce che Srage può proteggere contro gli effetti infiammatori causati dalla attivazione RAGE. Questi risultati costantemente indicato che RAGE potrebbe anche agire come un potenziale bersaglio terapeutico in GC. Date le sue caratteristiche biologiche, RAGE ed i suoi derivati ​​sono stati considerati come un nuovo indicatore per il potenziale maligno tra cui GC. La rabbia Gly ^{82Ser polimorfismo ha dimostrato di essere associato ad un aumentato rischio di sviluppo di GC o la progressione in uno studio caso-controllo su base ospedaliera [13].}

Nel presente studio, abbiamo scoperto che upregulation di espressione RAGE era significativamente associato con scadenti caratteristiche clinico-patologici e la scarsa sopravvivenza globale, suggerendo che esso può contribuire alla potenziale maligno di GC. Pertanto, RAGE potrebbe quindi servire come un prezioso romanzo biomarker per predire la prognosi e un potenziale bersaglio terapeutico per i pazienti con GC. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per chiarire i meccanismi alla base di RAGE sovraespressione, contribuendo in tal modo a una migliore comprensione e l'ulteriore sviluppo del suo potenziale utilizzo.

Riconoscimenti

Ringraziamo il Dr. Xiao Yan e il dottor Liang Zhao dal Dipartimento di Patologia per la diagnosi patologica e la conferma dei risultati IHC.

• PLoS ONE: il significato prognostico dei livelli di pretrattamento siero CEA in cancro gastrico: Una meta-analisi basata su 14651 Patients
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