A ecologia espacial ou ecologia da paisagem é uma área de pesquisa que investiga a formação de padrões espaciais entre as comunidades bacterianas. A magnitude do 'grão' (a menor unidade sendo observada) e a 'extensão' (a gama de observações) são determinantes importantes da escala de exame. A escala é crucial quando se trata de construir teorias sobre como essas comunidades são organizadas.
Como esses padrões são formados? Na boca humana, pelo menos, a resposta inclui fatores como a temperatura, os níveis de umidade, o fluxo de saliva, o nível de oxigênio, o pH, e o número de vezes que ocorrem abrasões ou procedimentos de higiene oral. Além desses fatores de nível macro, os próprios micróbios produzem e utilizam compostos metabólicos, nutrientes, e inibidores, incluindo moléculas antimicrobianas. Eles também previnem fisicamente que outros micróbios ocupem o espaço principal, ou suas superfícies podem oferecer bons locais para outros micróbios se ligarem. Essas interações levam a uma comunidade diversa e funcionalmente redundante, que é mais ou menos estável e metabolicamente ativo de acordo com os níveis de interação inter-microbiana.
Para mapear a orientação espacial, outros fatores devem ser conhecidos, como a distância entre micróbios, bem como a distância entre micróbios e outras características do hospedeiro, como a célula hospedeira mais próxima ou a superfície de um biofilme do qual o micróbio faz parte. A imagem é usada para obter informações sobre esses padrões em nível de célula individual em escalas de até um milímetro.
O desenvolvimento de uma técnica chamada marcação combinatória junto com hibridização in situ de imagem espectral-fluorescência (CLASI-FISH) ajudou a identificar e localizar várias classes microbianas ao mesmo tempo, marcando qualquer tipo de micróbio com múltiplos fluoróforos. Isso ajuda a visualizar o arranjo espacial de todo um sistema de micróbios formando comunidades microbianas em escala de mícron.
Biofilme bacteriano raspado da superfície da língua e fotografado usando CLASI-FISH. O tecido epitelial humano forma um núcleo central (cinza). As cores indicam bactérias diferentes:Actinomyces (vermelho) ocupam uma região próxima ao núcleo; O estreptococo (verde) está localizado em uma crosta externa e em listras no interior. Outros táxons (Rothia, ciano; Neisseria, amarelo; Veillonella, magenta) estão presentes em aglomerados e listras que sugerem o crescimento da comunidade para fora do núcleo central. Crédito da imagem:Steven Wilbert e Gary Borisy, The Forsyth Institute O estudo atual usa imagens de fluorescência multi-espectral para estabelecer seu papel na ecologia espacial de sistemas microbianos na língua. Aqui, existem vários micróbios densamente agrupados em contato com o epitélio humano e também com outros habitats orais, como a membrana mucosa da boca e os dentes.
Os investigadores usaram um raspador de língua de plástico com sulcos para coletar um espécime raspado de trás para frente. O tamanho e o arranjo interno desses fragmentos de biofilme os levaram a concluir que eles representavam o arranjo espacial das bactérias em vários níveis do dorso da língua fielmente em uma escala de centenas de micrômetros. Esses níveis incluem o topo das papilas filiformes que cobrem a língua, os vales entre eles, e os finos espinhos que se projetam deles, todos hospedando bactérias de diferentes tipos.
Os pesquisadores primeiro identificaram os principais tipos de bactérias nas amostras raspadas da língua de 21 voluntários saudáveis por sequenciamento, e então analisou cada classe para chegar a uma visão completa da estrutura do microbioma em detalhes suficientes para permitir que cada uma das espécies-chave recebesse seu próprio ponto na língua.
A maioria dos genes microbianos na comunidade da língua é formada por um número limitado de oligótipos, de acordo com o Human Microbiome Project (HMP). Ao vincular cada oligótipo na boca às classes bacterianas no banco de dados expandido de Microbioma Oral Humano (eHOMD), os pesquisadores identificaram 17 gêneros bacterianos presentes em mais de 80% das pessoas e formando 0,5% dos micróbios. Usando dados de sequenciamento do HMP, eles descobriram que 95% ou mais das sequências bacterianas vieram de um conjunto semelhante de gêneros.
Os pesquisadores concluíram que esses gêneros são "propensos a formar a estrutura espacial e metabólica do microbioma TD saudável".
Os pesquisadores descobriram três tipos de arranjos microbianos:bactérias livres, bactérias em células epiteliais escamosas, e consórcios bacterianos, ou grupos estruturalmente complexos. Os últimos eram biofilmes bacterianos feitos de várias camadas de micróbios, com uma fronteira distinta e um núcleo epitelial.
A análise da composição bacteriana em cada categoria e localização espacial mostrou que os consórcios eram mais homogêneos do que as outras categorias, com padrões bacterianos semelhantes em todas as amostras. As bactérias livres e ligadas ao epitélio ocorreram isoladamente ou em pequenos grupos. Em contraste, cada consórcio exibiu a mesma estrutura de patch localizada, cada um dominado por um tipo de bactéria.
Cada patch tem um limite distinto, tem dezenas a centenas de micrômetros de comprimento, e tem um núcleo de células epiteliais da mucosa humana. Os consórcios vivem entre a zona do perímetro, que é exposta à saliva e oxigênio, e o núcleo epitelial.
Pelo menos uma amostra de cada participante, e mais de 95% das imagens de amostra, mostrou a presença de 3 gêneros: Actinomyces, Rothia, e Estreptococo . Cada um tinha seu próprio 'ponto ideal' no consórcio, com Actinomyces formando grandes domínios contínuos perto do núcleo ou faixas entre manchas de outras bactérias. Rothia formou grandes manchas perto do perímetro, bem como em torno de um núcleo de células epiteliais ou bacterianas. Dentro dessa camada cortical, a Rothia era freqüentemente interrompido por fluxos ou manchas de outros tipos de bactérias. Estreptococo formou uma fina camada externa no consórcio, bem como veias ou manchas dentro dele.
Outros tipos de bactérias proeminentes observados em amostras de todos os indivíduos no estudo incluíram Veillonella, Gemella, Neisseriaceae, e filo Saccharibacteria . Algumas dessas classes de bactérias podem ajudar a converter o nitrato da saliva em nitrito e, assim, ajudar a regular os níveis de óxido nítrico no corpo. Menos de um quinto das células não foram coradas com nenhuma das sondas específicas.
Próximo, os pesquisadores analisaram os diferentes gêneros dentro do consórcio, cada espécie dentro de um gênero, e uma espécie em particular que se pensava ser a representante desse gênero na língua. Conforme esperado a partir de dados HMP, eles encontraram, por exemplo, naquela Rothia foi representado por R. mucilaginosa , Actinomyces por A. odontolyticus , e em muito menor grau, A. graevenitizii , e Neisseria por N. flavescens . S. mitis , S. salivarius e S. parasanguinis foram encontrados em todos os consórcios, mas em locais diferentes.
Os cientistas levantam a hipótese de que as células bacterianas no dorso da língua se empurram umas sobre as outras à medida que se multiplicam. Cada classe aumenta mais rapidamente em número na área que é ideal para seu crescimento, levando a manchas de formato irregular. Esta é a origem do arranjo do patch visto no microbioma maduro. Com a saúde debilitada, a estrutura da comunidade microbiana pode variar.
"Nosso estudo é novo porque ninguém antes foi capaz de olhar para o biofilme da língua de uma forma que distingue todas as diferentes bactérias para que possamos ver como elas se organizam, "o pesquisador Gary Borisy diz." A maioria dos trabalhos anteriores sobre comunidades bacterianas usaram abordagens baseadas em sequenciamento de DNA, mas para obter a sequência de DNA, você tem que primeiro moer a amostra e extrair o DNA, que destrói toda a bela estrutura espacial que estava lá. A obtenção de imagens com a nossa técnica CLASI-FISH permite-nos preservar a estrutura espacial e, ao mesmo tempo, identificar as bactérias. "
Em outras palavras, este método de imagem foi capaz de identificar a maioria das células em cada consórcio, bem como sua abundância e disposição espacial em relação à fonte de nutrição e à localização do substrato.
Os estudos em escala micrométrica ajudam a diferenciar as comunidades microbianas em relação ao seu arranjo biológico. O uso de sondas em nível de espécie mostra que muitas espécies são especialistas em locais que ocorrem em um local, como placa dentária, mas não no outro, isso é, o dorso da língua.
Os pesquisadores concluem, "Embora a imagem seja apenas uma das várias tecnologias-chave, fornece o benefício único de nos mostrar o alvo:a paisagem e as estruturas que os micróbios constroem e que precisamos explicar e replicar para ter alcançado uma compreensão da comunidade microbiana. "
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