PLOS ONE: o Sonic Hedgehog via é essencial para a manutenção de células estaminais-como o câncer no câncer gástrico humano

Abstract

ativação anormal do Sonic hedgehog (SHH) via tem sido descrito em uma grande variedade de cancros humanos e em células-tronco cancerosas (CSCs), no entanto, o papel do SHH percurso em CSCs gástrica tem não foram relatadas. Neste estudo, investigou-se a possibilidade de que a activação anormal da via SHH mantidas as características de CSCs gástricas. Primeiro, identificamos câncer de células estaminais-like (CSLCs) das linhas humanas gástricas celulares de cancro (HGC-27, MGC-803 e MKN-45) usando tumorsphere cultura. Em comparação com células aderentes, as células tumorsphere flutuantes tinha mais capacidade de auto-renovação e chemoresistance. As células que expressam marcadores CSCs (CD44, CD24 e CD133) foram também significativamente mais em tumorsphere células do que em células aderentes. Mais importante ainda, os estudos in vivo mostraram que os tumores de xenoenxerto pode ser gerado com 2 × 10 ^{4 tumorsphere células, o que era 100 vezes menos do que as necessárias para os tumores de contaminação por células aderentes. Em seguida, RT-PCR e transferência de Western demonstrou que os níveis de Ptch e Gli1 (genes-alvo via SHH) expressão foram significativamente maiores no tumorsphere células do que em células aderentes. Os resultados de quantitativa PCR em tempo real foram semelhantes aos de RT-PCR e transferência de Western. Uma análise mais aprofundada revelou que via SHH bloqueado por cyclopamine ou 5E1 causou uma redução maior na capacidade de auto-renovação do HGC-27 tumorsphere células do que a de células aderentes. Nós também descobrimos que via SHH bloqueando fortemente reforçada a eficácia dos medicamentos quimioterápicos no HGC-27 tumorsphere células in vitro e in vivo, mas não teve efeito significativo em células aderentes. Finalmente, foram isoladas as tumorspheres da amostra de cancro gástrico, essas células também teve chemoresistance ea capacidade tumorigénica, e SHH percurso manteve as características CSLCs gástricos de tumorsphere células de amostras de tumores primários. Em conclusão, nossos dados sugerem que SHH percurso era essencial para a manutenção da CSLCs no cancro gástrico humano}

Citation:. Canção Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) o Sonic Hedgehog via é essencial para a manutenção de células estaminais-como o câncer no câncer gástrico humano. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10.1371 /journal.pone.0017687

editor: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de novembro de 2010; Aceito: 10 de fevereiro de 2011; Publicação: 04 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 Song et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de alta Tecnologia de Pesquisa e Desenvolvimento da China (È6AA402A04,È6AA02A107), o Programa Estadual major Pesquisa básica da China (È9CB521704), eo National Nature Science Foundation da China (.872.468,Ĵ73031). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

CSCs desempenham um papel importante no desenvolvimento do cancro, esta subpopulação dentro do tumor possui as características de capacidade de auto-renovação, quimiorresistência e a capacidade tumorigénica, assim, podem desempenhar um papel crucial na iniciação, progressão e recorrência de cancro. Examinar e manipular as vias bioquímicas envolvidas nessas características é uma das melhores formas de contribuir para os CSCs, levando ao desenvolvimento de novos medicamentos e os procedimentos de tratamento. via SHH desempenha um papel crítico em diversos CSCs, tais como células estaminais glioblastoma [1], [2], células CD34 + de leucemia [3], [4] e CSCs de mama [5], Além disso, é essencial para o desenvolvimento e homeostase da glândula gástrica [6], a activação anormal da via SHH pode resultar em cancro gástrico [7], [8], no entanto, o papel da via de SHH em CSCs gástrica não é clara.

na via de SHH células de mamífero é mediada por ligandos Shh [9]. Na ausência de Shh, o receptor transmembranar patched (Ptch) inibe a actividade de outra proteína transmembranar, smoothened (SMO), resultando na inactivação da via de SHH [9], [10]. A ligação de Shh para Ptch anula o efeito inibitório de Ptch e Smo é desreprimida, activando deste modo factor de transcrição Gli (Gli1, Gli2 e Gli3) [9], [10]. Gli1 é um forte activador positivo de genes alvo a jusante e é ela própria um alvo transcricional de SHH via [11]. Portanto, Gli1 é considerado um marcador de activação anormal SHH via de [10], [12]

Recentemente, vários tipos de CSCs ou CSLCs foram identificados e isolados a partir de tumores malignos [13] -. [25]. No cancro gástrico, metodológico, que é difícil de isolar e amplificar CSCs partir de linhas celulares ou amostras de tecido de tumor. No presente momento, CD44 parece ser o marcador mais útil para a purificação em perspectiva de CSCs gástricas, no entanto, não é altamente específica para os CSCs gástricas [26].

Neste estudo, foi isolado a partir de CSLCs gástrico humano linhas celulares de cancro (HGC-27, MGC-803 e MKN-45) usando tumorsphere cultura em meio isento de soro e identificada a capacidade de auto-renovação, quimiorresistência e a capacidade tumorigénica de células tumorsphere; Em seguida, examinámos a expressão de Shh moléculas relacionadas às vias, incluindo Shh, Ptch, Smo, Gli1 Gli2 e em tumorsphere células e as células aderentes, especialmente a expressão de Ptch e Gli1.Then, que bloqueado por via SHH ciclopamina tomatina ou controlo, 5E1 ou controlo de PBS para investigar se as características de CSLCs em tumorsphere células foram mantidas pela activação anormal da via SHH. Finalmente, utilizou amostras de câncer gástrico primários para analisar os aspectos funcionais do SHH percurso em CSLCs gástricas.

ciclopamina é um alcalóide esteroidal de células-permeável. Que perturba o colesterol bio-síntese e antagoniza especificamente via de sinalização SHH através da interação direta com Smo (alisado), um parente distante de receptores acoplados à proteína G. É uma ferramenta valiosa para estudar o envolvimento da sinalização SHH no desenvolvimento de vários tumores. Tomatina é um alcalóide esteroidal que estruturalmente se assemelha cyclopamine, mas não tem a capacidade de inibir a sinalização de SHH. Ele pode ser usado como um controlo negativo. 5E1 é um anticorpo monoclonal anti-HH, que neutraliza a actividade SHH e IHH.

Resultados

1. células Tumorsphere possuía as características de CSLCs

Nós crescemos HGC-27, MGC-803 e MKN-45 células aderentes em meio isento de soro descrito na secção de métodos. Após 7 dias, tumorspheres consistindo de aproximadamente 50 a 100 células foram observadas (Fig. 1A).

A capacidade de auto-renovação destas tumorspheres foi avaliada por dissociando-os em uma única célula e crescendo a uma densidade clonal de 1000 células por mililitro. Após 2 semanas, uma única célula derivada de HGC-27 tumorsphere células geradas sub-tumorspheres em 41,83% ± 3,13% em comparação com 8,17% ± 2,40% das células aderentes, por outro lado, em MGC-803 e MKN-45, a formação de sub-tumorspheres taxa de tumorsphere células foram também mais elevados do que a de células aderentes. (Fig. 1B). Estes dados sugerem que a capacidade de auto-renovação de células tumorsphere foi significativamente maior do que a de células aderentes. células Tumorsphere também mostrou um aumento da capacidade de formar colônias em condições independente de ancoragem em um ensaio em agar mole padrão após 14 dias no HGC-27 e MKN-45 (Fig. 1C).

Também foi realizada uma diluição limitante ensaio para a formação de esferóides utilizando HGC-27 e células tumorsphere células aderentes, respectivamente. Como mostrado na Tabela S1, cerca de 27-35% de células tumorsphere poderia produzir esferóides, enquanto que menos de 5% de células aderentes pode gerar esferóides, após 3 semanas de cultura. Portanto, nos tumorsphere células HGC-27, podemos estimar que os esferóides formadoras população de células composto por um máximo de 35%.

chemoresistance é outra característica de CSCs, então nós investigamos se uma diferença de chemoresistance existia entre tumorsphere células e as células aderentes. Os resultados mostraram que, após 48 horas, as células tumorsphere demonstraram significativamente maior resistência a drogas em comparação com as células aderentes nas mesmas condições (Fig. 1D). Foram também avaliadas quimiorresistência de HGC-27 tumorsphere células aderentes e células a diferentes concentrações de drogas, no entanto, ambas as células tumorsphere e células aderentes não mostraram significativamente quimiorresistência de medicamentos de uma forma dependente da dose (Fig. S1).

em seguida, examinámos a expressão de CD44 em células tumorsphere dissociadas e as células aderentes utilizando um ensaio de imunofluorescência e western blot. Os resultados mostraram que as células que expressam CD44 eram significativamente mais em tumorsphere células do que em células aderentes (Fig. 2a). Além disso, a expressão de outros CSCs marcadores (CD24 e CD133) em tumorsphere células e as células aderentes foi analisada por Western blot, em comparação com tumorsphere células, a expressão de CD24 foi significativamente menor em células aderentes, enquanto a expressão de CD133 foi semelhante (Fig . 2B). Além disso, nós fraccionado HGC-27 de células por separação por FACS para CD44, descobrimos que fracção de células CD44 (+) poderia gerar mais colónias esferóides em comparação com CD44 (-) fracção de célula, além disso, o tamanho das colónias de esferóide a partir de CD44 (+) células era maior do que os de CD44 (-) (Fig. 2C). as células

2. células Tumorsphere poderia gerar tumores sobre xenotransplante

Para os estudos de xenotransplante, número igual (2 × 10 ^{4, 2 × 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) de recém-dissociado tumorsphere células aderentes ou células de controlo foi injectado SC em cada rato (seis ratos por grupo). Os resultados mostraram que os tumores foram gerados com 2 × 10 4 tumorsphere células, o que era 100 vezes menos do que as necessárias para a propagação do tumor por células aderentes (Tabela 1). Além disso, as células tumorsphere gerado tumores subcutâneos com maior volume e tempo mais curto em comparação com os que são gerados a partir de células aderentes (Fig. 3A, B). Assim, a injecção subcutânea de baixo número de tumorsphere células confirmou que as células esferóides retida capacidade mais forte tumorigénico em ratinhos nus de células aderentes}

H &. E exame de xenotransplantes derivados de HGC-27 tumorsphere células mostrou que estes tumores de perto assemelhava ao tumor humano original, principalmente contendo células diferenciadas (Fig. 3C). Importante, tumorspheres poderia ser re-derivados dos tumores xenotransplantadas (Fig. 3D), e que poderia formar de novo tumor (Fig. 3E). Esses dados, portanto, indicam que as células tumorsphere representada CSLCs que tinham capacidade tumorigénica.

3. via SHH foi expressa superior em tumorsphere células do que em células aderentes

Para investigar a ligação entre a via SHH e CSLCs características de tumorsphere células, examinamos primeiro a expressão mRNAs de Shh moléculas relacionadas às vias, incluindo Shh, Ptch, Smo, Gli1 Gli2 e por RT-PCR. Os resultados mostraram que todos os ARNm foram alta expresso em HGC-27 tumorsphere células. Comparado com tumorsphere células, os níveis de Shh, Ptch, Smo e Gli1 expressão foram significativamente mais baixos em células aderentes, enquanto que os níveis de expressão foram semelhantes Gli2 para tumorsphere células. No MGC-803 e MKN-45, os níveis de Shh, Ptch e Gli1 expressão também foram significativamente mais baixos em células aderentes que em tumorsphere células, enquanto que os níveis de Smo e Gli2 expressão teve nenhuma diferença significativa entre as células aderentes e tumorsphere células (Fig . 4A).

Na via SHH, Ptch e Gli1 são genes-alvo, eles são considerados como importantes marcadores de ativação anormal via SHH. Então, examinamos ainda mais os níveis de expressão de Ptch e Gli1 por Western blot e quantitativa PCR em tempo real.

Ao usar o Western Blot, descobrimos que os níveis de Ptch e Gli1 expressão também foram maiores no tumorsphere células do que em células aderentes (Fig. 4B). A seguir avaliou os níveis de Ptch e Gli1 expressão em xenoenxertos de HGC-27 por quantitativa PCR em tempo real. As análises quantitativas-PCR em tempo real dos genes alvo (SHH PTCH e GLI1) mostraram os mesmos resultados acima de semi-quantitativo de RT-PCR (Fig. 4C).

4. via SHH bloqueio reduziu a capacidade de auto-renovação e chemoresistance de HGC-27 tumorsphere células

Para testar para um possível papel do SHH percurso na capacidade de auto-renovação das células tumorsphere, usamos cyclopamine ou controlo tomatina, 5E1 ou controlo PBS para bloquear a via.

os resultados mostraram que o tratamento ciclopamina levou a uma redução significativa na capacidade para a formação de sub-tumorspheres em 27 HGC-tumorsphere células de uma forma dependente da dose, mas tal efeito foi observada em células aderentes (Fig. 5a). Nós ainda avaliada se o tratamento com cyclopamine afetaria a capacidade de formação de colónias de HGC-27 células tumorsphere pelo ensaio de crescimento independente de ancoragem. Do mesmo modo, a capacidade para formar colónias foi reduzido mais nas células tumorsphere de uma forma dependente da dose em relação às células aderentes (Fig. 5B).

Em seguida, investigámos o efeito da via de SHH na quimiorresistência de HGC -27 células tumorsphere, que os tratados com células dissociadas ciclopamina ou controlo tomatina durante 48 horas, e, em seguida, foi avaliada a resistência aos medicamentos de tumorsphere células. Quando ciclopamina foi seguido por drogas, o tratamento resultou numa taxa de morte celular global significativamente melhorada. Os melhores resultados foram obtidos quando foi combinado com ciclopamina oxaliplatina mais Mitomicina (Fig. 5C). Não se observou qualquer efeito sinergético em tais células aderentes após a exposição à droga com ciclopamina durante 48 horas (Fig. 5D).

também ensaiado o efeito de diferentes concentrações de ciclopamina (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) em morte celular. Os resultados mostraram que ciclopamina sozinho para células tumorsphere poderia fazer uma pequena mas consistente diminuição do número de células viáveis. Comparado com HGC 27 tumorsphere células, o efeito da ciclopamina na morte celular para células aderentes foi mais significativa (Fig. 5C, D).

Quando SHH via foi bloqueada por 5E1 ou controlo de PBS, os resultados de auto capacidade -renewing e quimiorresistência de tumorsphere células e as células aderentes foram semelhantes aos bloqueados pelo ciclopamina tomatina ou de controlo (Fig. S2).

5. via SHH bloqueando a resposta do tumor reforçada a drogas in vivo

Para testar esta hipótese in vivo, analisamos se via SHH bloqueio reforçada a eficácia da quimioterapia, cyclopamine ou controlo tomatina foi usado para inibir as respostas da via SHH. HGC-27 tumorsphere células foram deixadas a crescer em ambos os flancos traseiros de ratinhos nus até que o diâmetro maior do tumor atingiu cerca de 2 mm. Os ratinhos foram então tratados duas vezes por semana durante 3 semanas com ciclopamina ou controlo tomatina 24 horas antes do parto oxaliplatina. Em todos os ratinhos tratados, os tumores tratados com oxaliplatina foram significativamente menores do que os não tratados com oxaliplatina. Além disso, os tumores apresentaram significativamente maior inibição do crescimento tumoral, quando foram tratados com oxaliplatina em combinação com ciclopamina, a resposta do tumor à droga quimioterapêutica foi reforçada por ciclopamina (Fig. 6A, B). Investigou-se também se via SHH bloqueada por 5E1 ou controlo de PBS eficácia melhorada quimioterapia, in vivo, os resultados mostraram que 10 ug de tratamento /ml 5E1 conduziu a uma inibição do crescimento do tumor significativamente maior do que aqueles tratados apenas com oxaliplatina (Fig. 6A, B).

Estes dados sugerem que, embora fármacos quimioterapêuticos padrão retardada desenvolvimento de tumor durante o tratamento, quando eles foram combinados com ciclopamina ou 5E1, a eficácia da quimioterapia foi significativamente melhorada e também mais sustentada, após a interrupção do tratamento.

em seguida, para investigar se o bloqueio via SHH in vivo teve um efeito específico sobre HGC 27 tumorsphere células. Os ratinhos foram tratados apenas ciclopamina no flanco direito traseiro ou tomatina controlo no flanco traseiro esquerdo (duas vezes por semana durante 3 semanas), quando os tumores de HGC 27 tumorsphere células atingiram cerca de 2 mm, depois de 3 semanas, foi realizado um ensaio de diluição limitante para esferóides de formação usando células tumorais tratadas com ciclopamina e tratados com tomatina, respectivamente. Como mostrado na Tabela S2, cerca de 9-15% das células de tumor tratadas com xenotransplantadas tomatina poderia produzir esferóides, enquanto que menos de 2,5% de células de tumor tratadas com xenotransplantadas ciclopamina poderia gerar esferóides. Portanto, o bloqueio via SHH in vivo poderia reduzir o número de CSLCs gástricas.

6. via SHH manteve as características CSLCs gástricos de tumorsphere células de amostras de tumor primário

Para determinar se via SHH poderia estar envolvido nas características CSCs gástricos de tumorsphere células do tecido câncer gástrico, utilizamos amostras de câncer gástrico primários para analisar a aspectos funcionais de Shh em CSLCs via gástrica.

células em massa primeiro, que cresceu recentemente dissociados a partir de espécimes de cancro gástrico em meio isento de soro descrito na secção de métodos, após 10 dias, foram observadas tumorspheres (Fig. 7A, B). Então nós investigamos chemoresistance ea capacidade tumorigénica das células tumorsphere de tecido de câncer gástrico. Os resultados mostraram que tumorsphere células de tecido de cancro gástrico demonstraram significativamente maior resistência a drogas do que as células em massa nas mesmas condições (Fig. 7C). Além disso, as células em massa recentemente dissociados a partir de espécimes de cancro gástrico injectado a 2 × 10 ^{7 células por ratinho foram capazes de estabelecer tumores subcutâneos, enquanto a tão pouco quanto 2 x 10 4 das células tumorsphere a partir de espécimes de cancro gástrico poderia formar tumores (Tabela 1), os xenoenxertos de tumores resultantes da injecção de células tumorsphere apresentou as mesmas características de histopatologia como a respectiva tumor humano (Fig. 7F). Estes resultados mostraram que tumorsphere células de tecido de cancro gástrico possuía as características de CSLCs. Em seguida, observou-se o efeito da via de SHH de bloqueio na quimiorresistência de células in vitro tumorsphere e tumor resposta a drogas in vivo. Os resultados mostraram que cyclopamine ou poderiam 5E1 resultou em uma taxa de morte celular global significativamente aumentada (Fig. 7D) e a resposta do tumor à droga (Fig. 7E).}

Discussão

CSCs compartilham muitos características com células-tronco de tecidos, tais como auto-renovação, proliferação, chemoresistance, e são os principais responsáveis ​​para sustentar o crescimento de tumores [27], [28]. Muitos investigadores usaram células activadas por fluorescência para identificar e isolar os CSCs e determinado que estas células podem formar esferas em meio isento de soro especializado. Neste estudo, nós tomamos a abordagem oposta através do desenvolvimento de células tumorsphere e, em seguida, determinar se estas células adquiriu características CSCs.

Foi utilizado um meio livre de soro definido consistindo de EGF, FGF-2, B-27 suplemento e N-2 suplemento para manter as linhas de células de cancro gástrico. Estas condições foram usadas antes para manter endógenos neurais estaminais /progenitores e células-tronco do tumor a partir de tumores humanos e linhas celulares de tumor. Por exemplo, Kondo et ai. [24] caracterizou a linha de células tumorais C6 de rato in vitro e in vivo e observou-se uma pequena população de células estaminais-como derivados a partir da população lado bem caracterizado. Setoguchi et al. [29] demonstraram potencial de células estaminais-como o câncer em outras linhas celulares de cancro, incluindo a linha de mama MCF7 câncer, neuroblastoma B104 e HeLa adenocarcinoma.

No nosso experimento, foram utilizadas três linhas celulares de cancro gástrico (HGC- 27, MKN-45 e MGC-803) para tumorspheres cultura. linha de células HGC-27 foi estabelecido pela cultura do linfonodo metastático a partir de um histológico diagnosticado paciente com câncer gástrico como carcinoma indiferenciado. MKN-45 foi estabelecida a partir do adenocarcinoma fracamente diferenciado do estômago de uma mulher de 62 anos de idade. MGC-803 é uma linha de epitélio gástrico humano pouco diferenciado das células muco-adenocarcinoma de um homem de 74 anos de idade.

Duas abordagens diferentes têm sido tipicamente usada para identificar CSCs em estudos publicados [30], [31] . Um deles é um método in vitro denominado "formação de colónias esferóide", e outro é no método vivo envolvendo implantação de CSCs candidatos sob a pele de ratos imunodeficientes.

O primeiro método envolve a cultura CSCs candidatos em placas de cultura com revestimento especial para noncell fixação com meios isentos de soro contendo factor de crescimento epidérmico e factor de crescimento de fibroblastos básico. O crescimento das colônias esféricas depois de algumas semanas é considerado indicativo de capacidade de auto-renovação, e seria consistente com um fenótipo CSC. O último método para o crescimento de células em camundongos imunodeficientes-é necessária para demonstrar verdadeiro tumorigenicidade e é geralmente considerado como o padrão de ouro para provar existência de CSCs. Um número de estudos têm sugerido que estas duas abordagens geralmente proporcionar resultados semelhantes em avaliar CSCs candidatos para muitos tumores sólidos.

Actualmente, CSCs gástricas têm máquinas de superfície não específicas, de modo, nós desenvolvemos tumorsphere células e, em seguida, determinar se estas células adquiridos CSCs características, incluindo a capacidade de auto-renovação, chemoresistance ea capacidade tumorigénica.

Nossos dados mostraram que linhas celulares de cancro gástrico (HGC-27, MGC-803, MKN-45) cultivadas em um sérica definido meio livre poderia formar tumorspheres que continham células comportando como CSLCs. In vitro, a tumorsphere células mostraram um aumento da capacidade de formar colónias em agar mole em condições independente da ancoragem e uma capacidade aumentada para formar sub-tumorspheres. Também mostramos que a capacidade de auto-renovação para formar sub-tumorspheres de HGC 27 tumorsphere células teve um aumento nas passagens 2 a 8 (a partir de 44,5% até 70,5%), e, em seguida, mantida uma proporção relativamente estável após 8 ou mais passagens quando cultivados a uma densidade clonal (Fig. S3). Estes dados sugerem que o potencial proliferativo de células tumorsphere foi mantida após passagens prolongadas. Além disso, tumorsphere células in vitro eram mais resistentes a mitomicina e oxaliplatina em comparação com as células aderentes, estes dados sugerem que tumorsphere células composta por um número de CSLCs enriquecidos, que potencialmente as tornava menos sensíveis às acções de ambos oxaliplatina e mitomicina. In vivo, tumorsphere células poderiam gerar tumores sobre xenotransplante a uma taxa maior do que as células aderentes. Além disso, tumorsphere células gerado tumores subcutâneos com maior volume e tempo mais curto em comparação com os que são gerados a partir de células aderentes, de forma importante, tumorspheres poderia ser re-derivados dos tumores xenotransplantadas, e eles podem formar tumores de novo, estes dados sugerem que tumorspheres foram enriquecidas em CSLCs .

Em nosso estudo, as células aderentes presumivelmente continha uma percentagem relativamente baixa de CSCs, como foi usado nenhum método para o isolamento ou remoção destas células. Pode-se argumentar que é esta pequena população de CSCs que é responsável pela formação de tumores. Independentemente disso, mais CSCs foram evidentes nas células tumorsphere, o que pode explicar seu comportamento mais agressivo.

Em seguida, investigaram se as características de CSLCs em tumorspheres foram mantidas pela activação anormal da via SHH. Em primeiro lugar, foi demonstrado que os níveis de moléculas relacionadas com a via de SHH (Shh, e Ptch GLI1) Expressão de ARNm foram significativamente maiores no tumorsphere células do que em células aderentes, enquanto que Gli2 foi elevada expresso em ambas as células. Foram examinados mais os níveis de genes alvo via SHH (Ptch) e GLI1 expressão por Western blot e quantitativa PCR em tempo real, os resultados foram semelhantes aos de RT-PCR. Em segundo lugar, a inibição da actividade da via SHH por ciclopamina ou 5E1 conduziu a uma diminuição da capacidade de auto-renovação e aumento da sensibilidade à droga em HGC-27 tumorsphere células, mas estes efeitos não foram pronunciada em células aderentes. In vivo, em todos os ratinhos tratados, os tumores tratados com oxaliplatina foram significativamente menores do que os não tratados com oxaliplatina, após o tratamento com ciclopamina ou 5E1, a resposta do tumor a fármacos quimioterapêuticos foi melhorada. Estes dados sugerem que, embora fármacos quimioterapêuticos padrão retardada desenvolvimento de tumor durante o tratamento, quando eles foram combinados com ciclopamina, a eficácia da quimioterapia foi significativamente melhorada e também mais sustentada, após a interrupção do tratamento.

Finalmente, utilizou-se o cancro gástrico primário amostras para analisar os aspectos funcionais do SHH percurso em CSLCs gástricas. Os resultados mostraram que tumorsphere células da amostra de cancro gástrico também tinha chemoresistance ea capacidade tumorigénica, além disso SHH percurso bloqueio reduziu o chemoresistance de tumorsphere células e resposta tumoral melhorado para drogas in vivo.

Como para chemoresistance, várias características dos CSCs podem torná-los difíceis de eliminar. CSCs são relativamente quieta e isso lhes permite escapar de regimes de quimioterapia que geralmente têm como alvo as células divisão activa. Além disso, como mostrado pela sua contrapartida normal, CSCs têm sido propostos para exibir expressão de nível elevado de genes da família multidroga transportador, resultando provavelmente em efluxo mais eficaz de fármacos quimioterapêuticos e resistência a múltiplas drogas inato, além disso, vias de sinalização, tais como Wnt, hedgehog ou Notch, está desregulada em CSCs conducentes ao desenvolvimento do tumor. O desenvolvimento de uma abordagem terapêutica eficaz exigiria, portanto, a identificação de vias moleculares distintos ativos em CSCs ea identificação de agentes que podem bloquear a proliferação CSC ou induzir a diferenciação CSC, aumentando assim a sensibilidade às drogas quimioterápicas. Assim, fatores importantes que afetam o chemoresistance de CSCs são fatores intrínsecos. O microambiente, ou nicho, pode influenciar a capacidade de CSCs a proliferar, migrar ou invadir. O nicho é um site de ancoragem para CSCs, e moléculas de adesão ou moléculas solúveis microambiente, incluindo fatores de crescimento e citocinas, podem contribuir significativamente para a refratariedade à terapia. Embora a inibição da via SHH por cyclopamine ou 5E1 seria uma estratégia útil, em nosso estudo, demonstramos que Ptch componente do receptor e factor de transcrição Gli1 foram também expressas em alta tumorsphere células. Então, Ptch ou Gli1 pode ser um alvo alternativo para o tratamento do câncer gástrico. Uma estratégia possível é a utilização de pequena interferência RNA (siRNA) ou shRNA específico para Ptch ou Gli1, mas CSLCs gástricas em tumorsphere células não foram completamente purificados, precisamos purificar ainda mais os CSLCs gástricas, de modo que este trabalho será feito em nosso mais estudo.

em conclusão, mostramos que SHH percurso poderia ser envolvido na auto-renovação, proliferação, resistência aos medicamentos e tumorigénico do tumorsphere células e sugerem que as estratégias destinadas a inibir vias SHH representam uma abordagem terapêutica racional para atingir CSCs gástrico.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética animal

ratinhos nus atímicos Masculino (nu /nu), de 6 a 8 semanas de idade, foram obtidos a partir de Pequim Vital-Rio Biotério Technology Co. Ltd (SCXK JING 2007-0001) e foram alojados em condições livres de patógenos na instalação de barreira animal. Todos os ratos foram conduzidos sob diretrizes aprovadas de Centro de Animais de Laboratório da Academia Militar de Ciências Médicas (SYXK junho 2002-001).

Cultura de células aderentes, tumorspheres e sub-tumorspheres

câncer gástrico humano linhas celulares (HGC-27, MGC-803 e MKN-45) obtido a partir de Pequim União Medical College foi cultivada em 1640 contendo soro bovino fetal a 10% (FBS) e plaqueadas a uma densidade de 1 × 10 ^{6 células vivas por 75 cm 2 balão. Quando as células em anexo, que passados ​​sobre eles confluência. Tumorspheres foram obtidos colocando as células aderentes em meio de 1640 de cultura isento de soro contendo 1% de suplemento N-2 (Invitrogen), 2% de B-27, suplemento (Invitrogen), 1% de mistura de antibióticos (Gibco), 20 ng /FGF humano ml -2 (Chemicon), e 100 ng /ml de EGF (Chemicon), e as células aderentes foram colocadas em placas em 24 poços da placa de ultra-baixo de fixação (Corning) em 500 células por cavidade. 2 semanas mais tarde, as placas foram analisadas para a formação tumorspheres e foram quantificados usando um microscópio invertido (Olympus) a 40 × 100 e × ampliação
.}

Após tumorspheres primários atingiram o tamanho de cerca de 200-500 células por esfera, o tumorspheres foram dissociadas com uma densidade de 1000 células por mililitro e 100 uL de suspensão de células isoladas foi semeada em cada poço da placa de 24 poços de ultra-baixo de fixação (Corning) em meio isento de soro acima descrito. Cada poço foi examinada para uma única célula, e apenas os poços que continham uma única célula foram marcados. 2 semanas mais tarde, os poços foram analisados ​​para a formação de sub-tumorspheres. células aderentes normais foram utilizados como controle para a capacidade de formar sub-tumorspheres. Para testar a ligação entre a via de SHH e a formação de sub-tumorspheres, nós tratamos as células dissociadas com ciclopamina (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) ou tomatina controlo, 5E1 (10 ug /ml) ou controlo de PBS e observou-se a formação de de sub-tumorspheres.

tecidos de câncer gástrico espécime

as, amostras de tecidos humanos frescos estéreis câncer gástrico foram obtidos de acordo com os padrões éticos do comitê institucional sobre experimentação humana de 15 pacientes (idade intervalo 70-85 anos) submetidos a uma ressecção de câncer gástrico, após a obtenção do consentimento informado dos pacientes (Tabela S3).

em seguida, os espécimes foram imersos em 95% de etanol durante 2-3 segundos para evitar a contaminação, e lavada com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e antibióticos várias vezes para retirar o sangue. Após estes, a superfície das amostras de tecido de cancro foi removido e as partes internas foram cortados em 1-3 mm ^{3 pedaços de tamanho. Em seguida, eles foram digeridas em solução de colagenase e dispase a 37 ° C, após 4 h de incubação, a solução contendo os tecidos digerido foi centrifugado para remover a solução de colagenase. O sedimento de células foi lavada uma vez com 1640 antes de ser suspensa em soro-livre 1640 contendo 1% de N-2 suplemento, 2% de B-27, suplemento, 1% de mistura de antibióticos, a 20 ng /ml de FGF-2 humano, 100 ng /ml EGF e banhado em 24 poços da placa ultra-low anexo. Todas as culturas foram incubadas a 37 ° C em incubadoras fornecidos com ar umidificado e 5% de CO _2.}

Anchorage independente ensaio de crescimento

Para observando ainda mais a capacidade de auto-renovação, macio ensaio de agar foi utilizada para determinar a formação de colónias de células e tumorsphere células aderentes, em condições independente de ancoragem. Cada poço de uma placa de seis poços foi revestido com 1 ml de 10% FBS 1640 com 1% de agarose. Após 20 min de incubação a 37 ° C, os números iguais (500) de tumorsphere células ou células aderentes foram adicionados em 1 ml de 10% FBS 1640 com 0,5% de agarose. Para testar a ligação entre a via de SHH e a formação de colónias, em condições independente de ancoragem, que os tratados com células dissociadas ciclopamina (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) ou controlo tomatina, 5E1 (10 ug /ml) ou controlo de PBS.

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