PLOS ONE: Sonic Hedgehog Pathway est essentielle pour le maintien du cancer des cellules souches-Like dans le cancer gastrique humain

Résumé

activation anormale de la protéine Sonic hedgehog (SHH) voie a été décrite dans une grande variété de cancers humains et dans les cellules souches du cancer (CSC), cependant, le rôle de la voie SHH dans CSCs gastrique a pas été rapporté. Dans cette étude, nous avons étudié la possibilité que l'activation anormale de la voie SHH a maintenu les caractéristiques des cellules souches cancéreuses gastriques. Tout d'abord, nous avons identifié le cancer des cellules souches comme (les CLSC) à partir de lignées humaines gastriques de cellules cancéreuses (HGC-27, MGC-803 et MKN-45) en utilisant tumorsphere culture. Par rapport aux cellules adhérentes, les cellules tumorsphere flottantes ont une plus grande capacité d'auto-renouvellement et la chimiorésistance. Les cellules exprimant CCM marqueurs (CD44, CD24 et CD133) ont également été significativement plus tumorsphere cellules que dans les cellules adhérentes. études in vivo de xénogreffes Plus important encore, ont montré que les tumeurs pourraient être générés avec 2 x 10 ^{4 tumorsphere cellules, qui était 100 fois moins que celles requises pour les tumeurs d'ensemencement par des cellules adhérentes. Ensuite, RT-PCR et transfert de Western a montré que les niveaux de Ptch et Gli1 (Les gènes SHH cibles de la voie) étaient significativement plus élevés d'expression dans les cellules tumorsphere que dans les cellules adhérentes. Les résultats de la PCR quantitative en temps réel ont été semblables à ceux de la RT-PCR et transfert de Western. Une analyse plus poussée a révélé que la voie de SHH bloquée par cyclopamine ou 5E1 a entraîné une réduction plus importante de la capacité d'auto-renouvellement de HGC-27 tumorsphere cellules que celle des cellules adhérentes. Nous avons également constaté que la voie SHH bloquant fortement amélioré l'efficacité des médicaments chimiothérapeutiques dans HGC-27 tumorsphere des cellules in vitro et in vivo, mais n'a eu aucun effet significatif sur les cellules adhérentes. Enfin, nous avons isolé les tumorspheres de spécimens de cancer gastrique, ces cellules ont également chimiorésistance et la capacité tumorigène, et la voie SHH maintenu les caractéristiques des gastriques les CLSC tumorsphere cellules des échantillons de tumeurs primaires. En conclusion, nos données suggèrent que la voie SHH était essentiel pour le maintien de les CLSC dans le cancer gastrique humain}

Citation:. Chanson Z, Yue W, Wei B, Wang N, Li T, Guan L, et al. (2011) Sonic Hedgehog Pathway est essentielle pour le maintien du cancer des cellules souches-Comme dans le cancer gastrique humain. PLoS ONE 6 (3): e17687. doi: 10.1371 /journal.pone.0017687

Editeur: Mikhail Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Etats-Unis d'Amérique

Reçu le 27 Novembre 2010; Accepté 10 Février 2011; Publié 4 Mars, 2011

Droit d'auteur: © 2011 Song et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par le Programme national de haute technologie de recherche et de développement de la Chine (È6AA402A04,È6AA02A107), le Programme Major Etat recherche fondamentale de la Chine (È9CB521704), et la national Nature science Foundation de Chine (Ĵ72468,Ĵ73031). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

CSCs jouent un rôle important dans le développement du cancer, cette sous-population au sein de la tumeur possède les caractéristiques de capacité d'auto-renouvellement, la chimiorésistance et la capacité tumorigène peuvent donc jouer un rôle crucial dans l'initiation, la progression et la récurrence du cancer. Examiner et manipuler les voies biochimiques impliquées dans ces caractéristiques est l'une des meilleures façons de contribuer à CSCs, conduisant au développement de nouveaux médicaments et des procédures de traitement. voie SHH joue un rôle essentiel dans de nombreux CSCS, telles que les cellules souches de glioblastome [1], [2], les cellules leucémiques CD34 + [3], [4] et CSCs du sein [5], en outre, il est crucial pour le développement et homéostasie de la glande gastrique [6], l'activation anormale de la voie SHH pourrait entraîner un cancer gastrique [7], [8], cependant, le rôle de la voie SHH dans CSCs gastrique est pas claire.

voie de SHH dans les cellules de mammifères est médiée par des ligands Shh [9]. En l'absence de Shh, le récepteur transmembranaire patched (Ptch) inhibe l'activité d'une autre protéine transmembranaire, lissée (Smo), ce qui entraîne l'inactivation de la voie SHH [9], [10]. La liaison de Shh à Ptch abroge l'effet inhibiteur de Ptch et Smo est déréprimé, ce qui active le facteur de transcription Gli (Gli1, et GLI2 GH3) [9], [10]. Gli1 est un puissant activateur positif de gènes cibles en aval et est elle-même une cible transcriptionnelle de la voie SHH [11]. Par conséquent, Gli1 est considérée comme un marqueur de SHH voie activation anormale [10], [12]

Récemment, plusieurs types de CSC ou les CLSC ont été identifiés et isolés de tumeurs malignes [13] - [25].. Dans le cancer gastrique, le plan méthodologique, il est difficile d'isoler et d'amplifier les cellules souches cancéreuses de lignées cellulaires ou d'échantillons de tissus tumoraux. À l'heure actuelle, CD44 semble être le marqueur le plus utile pour la purification prospective de CSCs gastriques, cependant, il est hautement spécifique pour CSCs gastrique [26].

Dans cette étude, nous avons isolé les CLSC de l'estomac humain des lignées de cellules de cancer (HGC-27, MGC-803 et MKN-45) en utilisant tumorsphere culture dans un milieu sans sérum et identifier la capacité d'auto-renouvellement, la chimiorésistance et la capacité tumorigène des cellules tumorsphere; suivant, nous avons examiné l'expression de SHH molécules apparentées voie, y compris Shh, Ptch, Smo, Gli1 et GLI2 dans tumorsphere et les cellules adhérentes, en particulier l'expression de Ptch et Gli1.Then, nous avons bloqué la voie SHH par cyclopamine ou le contrôle tomatidine, 5E1 ou contrôler PBS pour étudier si les caractéristiques dans les CLSC tumorsphere cellules ont été maintenues par une activation anormale de la voie SHH. Enfin, nous avons utilisé des échantillons de cancer gastrique primaire pour analyser les aspects fonctionnels de la voie SHH dans les CLSC gastriques.

Cyclopamine est un alcaloïde stéroïdien cellulaire perméable. Il perturbe le cholestérol bio-synthèse et antagonise spécifiquement la voie de signalisation SHH par interaction directe avec Smo (lissée), un parent éloigné des récepteurs aux protéines G couplées. Il est un outil précieux pour étudier l'implication de la signalisation SHH dans le développement de diverses tumeurs. Tomatidine est un alcaloïde stéroïdien qui ressemble structurellement cyclopamine, mais n'a pas la capacité d'inhiber la signalisation SHH. Il peut être utilisé comme témoin négatif. 5E1 est un anticorps monoclonal anti-Hh, qui neutralise l'activité SHH et IHH.

Résultats

1. les cellules Tumorsphere possédaient les caractéristiques de
les CLSC

Nous avons grandi HGC-27, MGC-803 et MKN-45 cellules adhérentes dans un milieu sans sérum décrit dans la section des méthodes. Après 7 jours, tumorspheres constitués d'environ 50 à 100 cellules ont été observées (Fig. 1A).

La capacité d'auto-renouvellement de ces tumorspheres a été évaluée par les dissociant dans une seule cellule et croît à une densité clonale de 1000 cellules par millilitre. Au bout de 2 semaines, une seule cellule dérivée de HGC-27 tumorsphere cellules générées sous-tumorspheres à 41,83% ± 3,13% contre 8,17% ± 2,40% des cellules adhérentes, en outre, dans MGC-803 et MKN-45, la formation de sous-tumorspheres tumorsphere taux de cellules étaient également plus élevée que celle des cellules adhérentes. (Fig. 1B). Ces données suggèrent que la capacité d'auto-renouvellement des cellules tumorsphere était significativement plus élevée que celle des cellules adhérentes. cellules Tumorsphere ont également montré une plus grande capacité à former des colonies dans des conditions d'ancrage indépendant dans un dosage de l'agar mou standard après 14 jours à HGC-27 et MKN-45 (Fig. 1C).

Nous avons également effectué une dilution limite essai pour la formation de sphéroïdes utilisant HGC-27 cellules tumorsphere et les cellules adhérentes, respectivement. Comme on le voit dans le tableau S1, environ 27-35% des cellules tumorsphere pourrait produire sphéroïdes, alors que moins de 5% de cellules adhérentes pourrait générer sphéroïdes après 3 semaines de culture. Par conséquent, dans les cellules tumorsphere HGC-27, nous avons pu estimer que les sphéroïdes-formant la population de cellules composées d'un maximum de 35%.

chimiorésistance est une autre caractéristique de CSCs, donc nous avons cherché à savoir si une différence de chimiorésistance existait entre tumorsphere et des cellules adhérentes. Les résultats montrent que, au bout de 48 heures, les cellules ont montré tumorsphere significativement plus grande résistance aux médicaments par rapport aux cellules adhérentes dans les mêmes conditions (fig. 1D). Nous avons également évalué la chimiorésistance des HGC-27 tumorsphere et les cellules adhérentes à différentes concentrations de médicaments, cependant, les cellules et les cellules adhérentes tumorsphere ne présentaient pas de manière significative la chimiorésistance aux médicaments d'une manière dose-dépendante (Fig. S1).

ensuite, nous avons examiné l'expression de CD44 dans les cellules tumorsphere dissociés et les cellules adhérentes à l'aide de dosage immunofluorescence et western blot. Les résultats ont montré que les cellules exprimant CD44 étaient significativement plus tumorsphere cellules que dans les cellules adhérentes (Fig. 2A). En outre, l'expression d'autres CCM marqueurs (CD24 et CD133) dans tumorsphere et des cellules adhérentes a été examinée par buvardage de western, par rapport à tumorsphere cellules, l'expression de CD24 était significativement plus faible dans les cellules adhérentes, tandis que l'expression de CD133 a été similaire (fig . 2B). En outre, nous fractionnées HGC-27 cellules par FACS de tri pour CD44, nous avons constaté que CD44 (+) fraction cellulaire pourrait générer plus de colonies de sphéroïdes par rapport à CD44 (-) fraction de cellules, en outre, la taille des colonies sphéroïde de CD44 des cellules (+) était plus grande que celles de CD44 (-) (Fig. 2C).
cellules

2. les cellules Tumorsphere pourraient générer des tumeurs sur la xénotransplantation

Pour les études de xénogreffes, nombre égal (2 × 10 ^{4, 2 x 10 5, 2 × 10 6, 2 × 10 7) fraîchement dissociées tumorsphere ou des cellules adhérentes de contrôle a été injecté sc dans chaque souris (6 souris par groupe). Les résultats ont montré que les tumeurs ont été générées avec 2 x 10 4 tumorsphere cellules, qui était 100 fois moins que celles requises pour l'ensemencement de la tumeur par les cellules adhérentes (tableau 1). En outre, les cellules générées tumorsphere tumeurs sous-cutanées avec un plus grand volume et de temps plus court par rapport à ceux générés à partir de cellules adhérentes (fig. 3A, B). Ainsi, l'injection sous-cutanée d'un faible nombre d'tumorsphere cellules ont confirmé que les cellules sphéroïdes conservées plus forte capacité tumorigènes chez la souris nude de cellules adhérentes}

H &. E examen de xénogreffes dérivées de HGC-27 tumorsphere cellules a montré que ces tumeurs étroitement ressemblait à la tumeur humaine d'origine, contenant principalement des cellules différenciées (Fig. 3C). Surtout, tumorspheres pourraient être ré-dérivées des tumeurs transplantées (Fig. 3D), et ils pourraient se former à nouveau une tumeur (Fig. 3E). Ces données indiquent donc que les cellules tumorsphere représentaient les CLSC qui avaient la capacité tumorigène.

3. voie SHH a été plus élevée exprimée en tumorsphere cellules que dans les cellules adhérentes

Pour étudier le lien entre les caractéristiques de la voie SHH et les CLSC de tumorsphere cellules, nous avons examiné d'abord l'expression des ARNm de SHH molécules apparentées voie, y compris Shh, Ptch, SMO, et Gli1 GLI2 par RT-PCR. Les résultats ont montré que tous les ARNm ont été élevés exprimés en HGC-27 tumorsphere cellules. Par rapport aux tumorsphere cellules, les niveaux de Shh, Ptch, et Smo Gli1 expression était significativement plus faible dans les cellules adhérentes, tandis que les niveaux d'expression de GLI2 étaient similaires à tumorsphere cellules. Dans MGC-803 et MKN-45, les taux de Shh, Ptch et Gli1 expression étaient également significativement plus faible dans les cellules adhérentes que dans tumorsphere cellules, tandis que les niveaux de Smo et GLI2 expression a pas de différence significative entre les cellules adhérentes et tumorsphere cellules (fig . 4A).

En voie de SHH, Ptch et Gli1 sont des gènes cibles, ils sont considérés comme des marqueurs importants de la voie SHH activation anormale. Donc, nous avons encore examiné les niveaux d'expression de Ptch et Gli1 par Western blot et PCR quantitative en temps réel.

Lors de l'utilisation Western blot, nous avons constaté que les niveaux de Ptch et Gli1 expression étaient également plus élevés dans les cellules que tumorsphere dans des cellules adhérentes (Fig. 4B). Nous avons ensuite évalué les niveaux de Ptch et Gli1 expression dans des xénogreffes de HGC-27 par PCR quantitative en temps réel. PCR quantitative en temps réel, l'analyse des gènes cibles de SHH (PTCH) et Gli1 a montré les mêmes résultats que ci-dessus semi-quantitative par RT-PCR (Fig. 4C).

4. blocage de la voie SHH a réduit la capacité d'auto-renouvellement et la chimiorésistance de HGC-27 tumorsphere cellules

Pour tester un rôle possible de la voie SHH dans la capacité d'auto-renouvellement de tumorsphere cellules, nous avons utilisé cyclopamine ou le contrôle tomatidine, 5E1 ou le contrôle du PBS pour bloquer la voie.

les résultats ont montré que le traitement de la cyclopamine conduit à une réduction significative de la capacité de la formation de sous-tumorspheres dans HGC-27 tumorsphere cellules d'une manière dépendante de la dose, mais pas un tel effet a été observée dans les cellules adhérentes (Fig. 5A). Nous avons évalué en outre si le traitement avec cyclopamine aurait une incidence sur la capacité de formation de colonies de HGC-27 cellules tumorsphere par dosage de croissance -indépendante ancrage. De même, la capacité de former des colonies a été réduite de plus dans les cellules tumorsphere d'une manière relativement dépendante de la dose pour les cellules adhérentes (fig. 5B).

Ensuite, nous avons étudié l'effet de la voie SHH sur la chimiorésistance de HGC -27 cellules tumorsphere, nous avons traité les cellules dissociées avec cyclopamine ou le contrôle tomatidine pendant 48 heures, puis la résistance aux médicaments des tumorsphere cellules a été évaluée. Lorsque cyclopamine a été suivie par les médicaments, le traitement a entraîné un taux de mortalité cellulaire globale significativement améliorée. Les meilleurs résultats ont été obtenus lorsque cyclopamine a été combiné avec oxaliplatine plus mitomycine (Fig. 5C). Aucun effet synergique a été observé dans les cellules adhérentes après l'exposition aux médicaments avec Cyclopamine pendant 48 heures (Fig. 5D).

Nous avons également dosé l'effet de différentes concentrations de cyclopamine (2,5 pM, 5 pM, 10 pM) sur la mort cellulaire. Les résultats ont montré que cyclopamine seul tumorsphere cellules pourrait faire une légère mais constante diminution du nombre de cellules viables. Par rapport à HGC-27 tumorsphere cellules, l'effet de cyclopamine sur la mort cellulaire des cellules adhérentes a plus d'importance (Fig. 5C, D).

Lorsque la voie SHH a été bloqué par 5E1 ou le contrôle PBS, les résultats de l'auto capacité -renewing et la chimiorésistance des tumorsphere et les cellules adhérentes ont été similaires à ceux bloqués par cyclopamine ou le contrôle tomatidine (Fig. S2).

5. voie SHH bloquant la réponse tumorale accrue aux médicaments in vivo

Pour tester cette hypothèse in vivo, nous avons analysé si la voie SHH blocage amélioré l'efficacité chimiothérapie, la cyclopamine ou un contrôle tomatidine a été utilisé pour inhiber les réponses de voie de SHH. HGC-27 tumorsphere cellules ont été laissées à croître dans les deux flancs arrières des souris nues jusqu'à ce que le plus grand diamètre de la tumeur a atteint environ 2 mm. Les souris ont ensuite été traitées deux fois par semaine pendant 3 semaines avec cyclopamine ou le contrôle tomatidine 24 heures avant la livraison oxaliplatine. Dans toutes les souris traitées, les tumeurs traitées avec oxaliplatine étaient significativement inférieures à celles non traitées à l'oxaliplatine. De plus, les tumeurs ont présenté une inhibition significative de la croissance tumorale lorsqu'elles ont été traitées à l'oxaliplatine, en combinaison avec la cyclopamine, la réponse de la tumeur à un médicament chimiothérapeutique a été renforcée par la cyclopamine (Fig. 6A, B). Nous avons également cherché à savoir si la voie SHH bloquée par 5E1 ou témoin PBS améliorée chimiothérapie efficacité in vivo, les résultats ont montré que 10 ug de traitement /ml 5E1 a conduit à une inhibition de la croissance tumorale significativement plus élevée que ceux traités seulement par l'oxaliplatine (Fig. 6A, B).

Ces données suggèrent que, bien que des médicaments chimiothérapeutiques standards retardés croissance tumorale pendant le traitement, quand elles sont combinées avec la cyclopamine ou 5E1, l'efficacité de la chimiothérapie a été significativement améliorée et aussi plus maintenu après l'interruption du traitement.

ensuite, pour déterminer si le blocage de la voie SHH in vivo a eu un effet spécifique sur HGC-27 tumorsphere cellules. Les souris ont été seulement traités cyclopamine sur le flanc arrière droit ou le contrôle tomatidine sur le flanc arrière gauche (deux fois par semaine pendant 3 semaines) lorsque les tumeurs de HGC-27 tumorsphere cellules ont atteint environ 2 mm, au bout de 3 semaines, nous avons effectué un test de dilution limite pour la formation des sphéroïdes en utilisant des cellules tumorales traitées avec la cyclopamine et traités par tomatidine, respectivement. Comme on le voit dans le tableau S2, environ 9-15% des cellules provenant d'une tumeur traitée avec xénotransplantées tomatidine pourrait produire sphéroïdes, tandis que moins de 2,5% des cellules de tumeur traitées avec xénotransplantées Cyclopamine pourrait générer des sphéroïdes. Par conséquent, le blocage de la voie de SHH in vivo pourrait réduire le nombre de les CLSC gastriques.

6. voie SHH a maintenu les gastriques les CLSC caractéristiques des tumorsphere cellules à partir d'échantillons de tumeur primaire

Pour déterminer si la voie SHH pourrait être impliqué dans les gastriques CCM caractéristiques de tumorsphere cellules de tissus de cancer de l'estomac, nous avons utilisé des échantillons de cancer gastrique primaire pour analyser la aspects fonctionnels de SHH voie dans les CLSC gastriques.

cellules en vrac d'abord, nous avons grandi fraîchement dissociées des spécimens de cancer gastrique dans un milieu sans sérum décrit dans la section des méthodes, au bout de 10 jours, tumorspheres ont été observés (Fig. 7A, B). Ensuite, nous avons étudié la chimiorésistance et la capacité tumorigène de cellules tumorsphere de tissu de cancer gastrique. Les résultats ont montré que les cellules provenant tumorsphere tissu de cancer gastrique ont montré significativement plus élevée que la résistance aux médicaments des cellules en vrac dans les mêmes conditions (fig. 7C). En outre, les cellules en vrac fraîchement dissociées à partir d'échantillons de cancer gastrique injectés à 2 × 10 ^{7 cellules par souris ont été capables d'établir des tumeurs sous-cutanées, tout aussi peu que 2 x 10 4 des cellules tumorsphere à partir d'échantillons de cancer gastrique pourrait former les tumeurs (tableau 1), les xénogreffes de tumeurs résultant de l'injection de cellules tumorsphere présentent les mêmes caractéristiques histopathologiques que leur tumeur humaine respectif (fig. 7F). Ces résultats ont montré que les cellules provenant tumorsphere tissu de cancer gastrique possédaient les caractéristiques de les CLSC. Ensuite, nous avons observé l'effet de SHH voie blocage sur la chimiorésistance des tumorsphere cellules en réponse in vitro et de la tumeur aux médicaments in vivo. Les résultats ont montré que cyclopamine ou 5E1 pourrait abouti à un taux de mortalité cellulaire globale significativement améliorée (Fig. 7D) et la réponse de la tumeur au médicament (Fig. 7E).}

Discussion

CSCs partagent beaucoup caractéristiques avec des cellules souches de tissus, tels que l'auto-renouvellement, la prolifération, la chimiorésistance, et sont principalement responsables pour le maintien de la croissance des tumeurs [27], [28]. De nombreux chercheurs ont utilisé des cellules activées par fluorescence de tri pour identifier et isoler des cellules souches cancéreuses et a déterminé que ces cellules peuvent former des sphères dans un milieu exempt de sérum spécialisé. Dans cette étude, nous avons pris l'approche inverse en développant des cellules tumorsphere puis déterminer si ces cellules ont acquis CCM caractéristiques.

Nous avons utilisé un milieu sans sérum défini constitué de EGF, FGF-2, B-27 supplément et N-2 supplément pour maintenir des lignées cellulaires de cancer gastrique. Ces conditions ont été utilisées auparavant pour maintenir endogènes souches neurales et des cellules progénitrices /souches tumorales humaines provenant de tumeurs et de lignées cellulaires tumorales. Par exemple, Kondo et al. [24] caractérisé par la lignée cellulaire tumorale C6 du rat in vitro et in vivo et a observé une petite population de cellules souches analogue dérivées de la population bien caractérisée côté. Setoguchi et al. [29] ont démontré un cancer potentiel de cellules souches comme dans d'autres lignées cellulaires de cancer, y compris la ligne MCF7 du cancer du sein, B104 neuroblastome, et HeLa adénocarcinome.

Lors de notre expérience, nous avons utilisé trois lignées cellulaires de cancer gastrique (HGC- 27, MKN-45 et MGC-803) à tumorspheres de culture. HGC-27, la lignée cellulaire a été établie par culture des ganglions lymphatiques métastatique à partir d'un patient atteint de cancer gastrique histologique diagnostiqué un carcinome indifférencié. MKN-45 a été établie à partir de l'adénocarcinome peu différencié de l'estomac d'une femme de 62 ans. MGC-803 est un épithéliale ligne gastrique humaine peu différenciée de cellules muco-adénocarcinome d'un homme de 74 ans.

Deux approches différentes ont généralement été utilisées pour identifier les CSC dans les études publiées [30], [31] . La première est une méthode in vitro appelée "formation de colonies sphéroïde», et un autre est dans la méthode in vivo impliquant l'implantation d'CSCs candidats sous la peau des souris immunodéficientes.

La première méthode consiste à cultiver CSCs candidats dans des boîtes de culture à revêtement spécial pour noncell fixation avec des milieux sans sérum contenant un facteur de croissance épidermique et le facteur de croissance des fibroblastes. La croissance des colonies sphériques après quelques semaines est considérée comme une indication de l'auto-renouvellement capacité, et serait compatible avec un phénotype SCC. Cette dernière méthode, la croissance des cellules dans des souris immunodéficientes-est nécessaire pour démontrer vrai tumorigène et est généralement considéré comme l'étalon-or pour prouver l'existence de CSC. Un certain nombre d'études ont suggéré que ces deux approches fournissent généralement des résultats similaires dans l'évaluation CSCs candidats pour de nombreuses tumeurs solides.

À l'heure actuelle, CSCs gastriques ont les décideurs de surface non spécifiques, donc, nous avons développé tumorsphere cellules, puis déterminer si ces cellules acquises CCM caractéristiques, y compris la capacité d'auto-renouvellement, la chimiorésistance et la capacité tumorigène.

Nos données ont montré que les lignées cellulaires de cancer gastrique (HGC-27, MGC-803, MKN-45) cultivées dans un sérum défini milieu libre pourrait former tumorspheres qui contenaient des cellules se comportant comme les CLSC. In vitro, les cellules ont montré tumorsphere une plus grande capacité à former des colonies dans la gélose molle dans des conditions indépendantes de l'ancrage et une capacité accrue à former des sous-tumorspheres. Nous avons également montré que la capacité d'auto-renouvellement pour former des sous-tumorspheres de HGC-27 tumorsphere cellules eu une augmentation au passage 2 à 8 (de 44,5% à 70,5%), puis il maintenu une proportion relativement stable après 8 ou plus passages lorsque cultivées à une densité clonale (Fig. S3). Ces données suggèrent que le potentiel de prolifération de cellules tumorsphere a été maintenue après les passages prolongés. En outre, tumorsphere cellules in vitro ont été plus résistantes à l'oxaliplatine et la mitomycine par rapport aux cellules adhérentes, ces données suggèrent que les cellules sont constituées tumorsphere des nombres enrichis de laquelle les CLSC, pouvant les rendre moins vulnérables aux actes de deux oxaliplatine et la mitomycine. In vivo, les cellules tumorsphere pourraient générer des tumeurs sur la xénotransplantation à un taux plus élevé que les cellules adhérentes. De plus, tumorsphere cellules générées tumeurs sous-cutanées avec un plus grand volume et la réduction du temps par rapport à celles générées à partir de cellules adhérentes, est important, tumorspheres pourraient être re-dérivées des tumeurs transplantées, et ils pourraient former à nouveau une tumeur, ces données suggèrent que tumorspheres ont été enrichies dans les CLSC .

Dans notre étude, les cellules adhérentes contenait vraisemblablement un pourcentage relativement faible des CSC, comme aucune méthode pour l'isolement ou la suppression de ces cellules a été utilisé. On peut faire valoir qu'il est cette petite population de CSCs qui est responsable de la formation de tumeurs. Peu importe, plus CSCs étaient évidents dans les cellules tumorsphere, ce qui peut expliquer son comportement plus agressif.

Ensuite, nous avons cherché à savoir si les caractéristiques de les CLSC en tumorspheres ont été maintenues par une activation anormale de la voie SHH. Tout d'abord, nous avons démontré que les niveaux de molécules liées à la voie-SHH (Shh, PTCH et Gli1) expression d'ARNm étaient significativement plus élevés dans les cellules tumorsphere que dans les cellules adhérentes, tandis que GLI2 était élevé exprimé dans les deux cellules. Nous avons également examiné les niveaux de SHH gènes cibles de la voie (PTCH et Gli1) expression par Western blot et la PCR quantitative en temps réel, les résultats étaient similaires à ceux de la RT-PCR. Deuxièmement, l'inhibition de l'activité de la voie SHH par cyclopamine ou 5E1 a conduit à une diminution de la capacité d'auto-renouvellement et une sensibilité accrue aux médicaments dans les HGC-27 tumorsphere cellules, mais ces effets ne sont pas prononcés dans les cellules adhérentes. In vivo, chez toutes les souris traitées, les tumeurs traitées avec oxaliplatine étaient significativement inférieures à celles non traitées à l'oxaliplatine, après traitement à la cyclopamine ou 5E1, la réponse tumorale à des médicaments chimiothérapeutiques a été améliorée. Ces données suggèrent que, bien que des médicaments chimiothérapeutiques standards retardés croissance tumorale pendant le traitement, quand elles sont combinées avec la cyclopamine, l'efficacité de la chimiothérapie a été significativement améliorée et aussi plus maintenu après l'interruption du traitement.

Enfin, nous avons utilisé le cancer gastrique primaire échantillons pour analyser les aspects fonctionnels de la voie SHH dans les CLSC gastriques. Les résultats ont montré que tumorsphere cellules de l'échantillon de cancer gastrique ont également chimiorésistance et la capacité tumorigène, par ailleurs SHH voie blocage réduit la chimiorésistance des tumorsphere cellules et la réponse tumorale accrue aux médicaments in vivo.

Comme pour la chimiorésistance, plusieurs caractéristiques de CSCs peut les rendre difficiles à éliminer. CSCs sont relativement calme, ce qui leur permet d'échapper à des régimes chimiothérapeutiques qui ciblent généralement les cellules cyclisme activement. En outre, comme indiqué pour leur contrepartie normale, CSCs ont été proposées pour présenter une expression de haut niveau de gènes de la famille polychimiothérapie transporteur, entraînant vraisemblablement efflux plus efficace des médicaments chimiothérapeutiques et multirésistance innée, En outre, les voies de signalisation, tels que Wnt, Hedgehog ou Notch, sont dérégulé en CSCs conduisant au développement de la tumeur. Le développement d'une approche thérapeutique efficace nécessiterait donc l'identification des voies moléculaires distinctes actives dans CSCs et l'identification d'agents qui peut soit bloquer CSC prolifération ou induire la différenciation du SCC, améliorant ainsi la sensibilité aux médicaments chimiothérapeutiques. Ainsi, les facteurs importants affectant la chimiorésistance des CSC sont des facteurs intrinsèques. Le microenvironnement, ou de niche, peuvent influer sur la capacité des cellules souches cancéreuses de proliférer, migrer ou envahir. La niche est un site d'ancrage pour CSCS, et des molécules d'adhésion ou de molécules solubles du microenvironnement, y compris les facteurs croissance et de cytokines, peuvent contribuer de manière significative à la réfractarité à la thérapie. Bien que l'inhibition de la voie SHH par cyclopamine ou 5E1 serait une stratégie utile, dans notre étude, nous avons démontré que Ptch composant récepteur et le facteur de transcription Gli1 ont également été élevée exprimée en tumorsphere cellules. Donc, Ptch ou Gli1 pourrait être une cible alternative pour le traitement du cancer gastrique. Une stratégie possible consiste à utiliser des petits ARN interférents (siRNA) ou shRNA spécifique pour Ptch ou Gli1, mais les CLSC gastriques chez tumorsphere cellules n'a pas été complètement purifiés, nous avons besoin de purifier davantage les les CLSC gastriques, de sorte que ce travail sera fait dans notre plus étude.

en conclusion, nous avons montré que la voie SHH pourrait être impliqué dans l'auto-renouvellement, la prolifération, la résistance aux médicaments et tumorigène de tumorsphere cellules et suggèrent que les stratégies visant à inhiber les voies de SHH représentent une approche thérapeutique logique de cibler CSCs gastriques.

Matériel et méthodes de

Déclaration

Homme athymiques souris nude (nu /nu) éthique animale, âgé de 6 à 8 semaines, ont été obtenus à partir de Beijing Vital-rivière Lab animale Technology Co. Ltd (SCXK JING 2007-0001) et ont été logés dans des conditions exemptes d'agents pathogènes dans l'établissement barrière animal. Toutes les souris ont été menées conformément aux lignes directrices approuvées du Laboratoire Animal Center de l'Académie militaire des sciences médicales (SYXK juin 2002-001).

Culture de cellules adhérentes, tumorspheres et sous-tumorspheres

cancer gastrique humain lignées cellulaires (HGC-27, MGC-803 et MKN-45) obtenus à partir de Peking Union Medical College a été cultivé dans un milieu 1640 contenant 10% de sérum de veau fœtal (FBS) et étalées à la densité de 1 x 10 ^{6 cellules vivantes par 75 cm 2 flacon. Lorsque les cellules attachées, nous les repiquées sur confluence. Tumorspheres ont été obtenus en plaçant les cellules adhérentes dans du milieu 1640 de culture sans sérum contenant 1% de N-2 supplément (Invitrogen), 2% de B-27 supplément (Invitrogen), 1% de mélange d'antibiotiques (Gibco), 20 ng /ml de FGF humain -2 (Chemicon) et 100 ng /ml d'EGF (Chemicon) et les cellules adhérentes ont été ensemencées dans 24 puits ultra-basse plaque de fixation (Corning) à 500 cellules par puits. 2 semaines plus tard, les plaques ont été analysées pour la formation de tumorspheres et ont été quantifiés à l'aide d'un microscope inversé (Olympus) à 40 × 100 × grossissement.}

Après tumorspheres primaires ont atteint la taille d'environ 200-500 cellules par sphère, le tumorspheres ont été dissociées à une densité de 1.000 cellules par ml et 100 pi de suspension cellulaire unique a été ensemencé dans chaque puits de 24 puits ultra-basse plaque de fixation (Corning) dans un milieu sans sérum décrit ci-dessus. Chaque puits a été examiné pour une seule cellule, et seuls les puits qui contenaient une seule cellule ont été marqués. 2 semaines plus tard, les puits ont été analysées pour la formation des sous-tumorspheres. cellules adhérentes normales ont été utilisées comme témoin pour la capacité de former des sous-tumorspheres. Pour tester le lien entre la voie SHH et la formation de sous-tumorspheres, nous avons traité les cellules dissociées avec cyclopamine (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) ou le contrôle tomatidine, 5E1 (10 ug /ml) ou contrôler PBS et observé la formation de sous-tumorspheres.

spécimen
de tissus du cancer gastrique

les spécimens humains frais stériles tissus cancer gastrique ont été obtenus conformément aux normes éthiques du comité institutionnel sur l'expérimentation humaine à partir de 15 patients (âge gamme 70-85 ans) subissant une résection du cancer gastrique, après avoir obtenu le consentement éclairé des patients (tableau S3).

Ensuite, les échantillons ont été immergés dans 95% d'éthanol pendant 2-3 sec pour éviter toute contamination, et lavés avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et des antibiotiques à plusieurs reprises pour enlever le sang. Après cela, la surface des échantillons de tissus cancéreux a été retiré et les parties intérieures ont été coupés en 1-3 mm ^{3 morceaux de taille. Ensuite, ils ont été digérées dans une solution de collagénase et de la dispase à 37 ° C, après 4 heures d'incubation, la solution contenant les tissus digérée a été centrifugée pour éliminer la solution de collagénase. Le culot cellulaire a été lavé une fois avec 1640 avant d'être suspendu dans 1640 sans sérum du milieu contenant 1% de N-2 supplément, 2% de B-27 supplément, 1% de mélange d'antibiotiques, 20 ng /ml de FGF-2 humain, 100 ng /ml d'EGF et étalées dans 24 puits ultra-basse plaque de fixation. Toutes les cultures ont été incubées à 37 ° C dans des incubateurs alimentés en air humidifié et 5% de CO _2.}

Anchorage indépendant test de croissance

Pour observer la capacité d'auto-renouvellement en outre, doux dosage de gélose a été utilisée pour déterminer la formation de colonies tumorsphere et les cellules adhérentes dans des conditions d'ancrage indépendant. Chaque puits d'une plaque à six puits a été revêtue avec 1 ml de 10% de FBS 1640 avec 1% d'agarose. Après 20 min d'incubation à 37 ° C, un nombre égal (500) tumorsphere ou des cellules adhérentes ont été ajoutées dans 1 ml de 10% de FBS 1640 avec 0,5% d'agarose. Pour tester la liaison entre la voie SHH et la formation de colonies dans des conditions d'ancrage indépendant, nous avons traité les cellules dissociées avec Cyclopamine (2,5 uM, 5 uM, 10 uM) ou tomatidine de commande, 5E1 (10 ug /ml) ou le contrôle PBS.

• PLOS ONE: Wnt /β-caténine Signaling Améliore Cyclooxygenase-2 (COX2) transcriptionnelle L'activité dans le cancer gastrique Cells
• PLOS ONE: Une méthode de calcul pour la prévision des excréteurs protéines et application à l'identification de marqueurs de cancer gastrique dans Urine